基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法

技术领域

本发明属于分析方法领域，更具体地涉及一种基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法。

背景技术

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种高效、简单、高通量的软电离质谱。它的原理主要是将待测物与基质混合形成共结晶，并通过共结晶将照射的激光能量传递给待测物，辅助待测物离子化从而对其进行检测。它之前主要用于一些多肽、蛋白质、聚合物的分析。在MALDI-TOF-MS分析过程中，选择合适的基质才能得到比较理想的待测物的信号。基质不仅可以稀释和保护样品，还可以通过提供质子来促进样品分子离子化。但传统的基质在与待测样品共结晶过程中容易产生“热点”，降低了分析的重现性，且额外的基质的加入延长了样品的制备时间，也增加了分析的成本。

作为一种新型的单元素的二维层状半导体材料，黑磷已经成为了材料界的黑马。它拥有着随着层数可变的直接带隙，能吸收可见光到红外线范围内的波长。这种特性使得它具有良好的光电化学性质，可广泛应用于光电器件，生物医学，红外探测，卫星遥感等方面。但是，随着黑磷越来越广泛的使用，针对黑磷的分析检测就变得极其重要。但是黑磷是一个大分子，分析起来非常困难，特别是黑磷纳米材料由于其稳定性很差，尤其需要快速的黑磷的分析方法。目前使用的方法主要是SEM、TEM、AFM等电镜技术和拉曼光谱，样品制备过程复杂、耗时长，而且这些方法基本是小部分区域的定性方法，分析速度和准确性也无法保证。因此，开发一种快速、准确、高通量的分析黑磷的方法是目前研究的热点和难点。

发明内容

本发明的目的在于针对目前检测技术的不足，利用黑磷本身可吸收激光能量辅助化合物解吸离子化的优势，从而通过黑磷自身吸收的能量辅助其解吸和电离，开发了一种基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法，并且基于此发展了复杂样品中黑磷的定量分析方法。

为实现上述目的，本发明提出以下技术方案：

一种基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法，包括以下步骤：

步骤(1)、称取适量的黑磷样品；

步骤(2)、将称取的黑磷样品用N-甲基吡咯烷酮或者水分散并配制一定浓度的分散液；

步骤(3)、将未添加基质的所述黑磷样品分散液滴加在商业化的MTP 384不锈钢非抛光靶板上；

步骤(4)、不额外添加基质，置于通风橱中，通过氮气辅助加速溶剂的挥发；

步骤(5)、样品干燥后，将所述靶板放置于所述基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)的靶托上，通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对所述黑磷样品直接进行质谱检测。

进一步地，步骤(5)的MALDI-TOF MS检测在反射模式下进行，并且在正离子模式和负离子模式下都适用。

进一步地，在正离子模式下，质谱的激光功率设置为5-60％，频率设置为100-200，shots设置为100-500；在负离子模式下，质谱的激光功率设置为15-55％，频率设置为100-200，shots设置为100-500，在这两种模式下，Matrix Suppression Mode设置为Off，Detector Gain设置为4-8x，laser Attenuator范围为1-minimum到5-ultra。

进一步地，步骤(2)中配制的黑磷分散液浓度范围为0.0000008-1000μg/mL。

进一步地，步骤(5)得到的黑磷在MALDI-TOF MS中有特征的分子峰团簇，特征指纹峰的范围在0～2000m/z内，特别是在1000m/z以下的小分子区域。

进一步地，在步骤(3)中，将所述黑磷样品分散液配制成多份不同浓度的黑磷标液，将每份黑磷标液滴加在MTP 384不锈钢非抛光靶板上；

利用MALDI-TOF MS测量钢板上的黑磷，在正离子模式下根据m/z 216.6处的峰强和黑磷分散液浓度制作工作曲线；

当黑磷浓度在100μg/mL～0.2μg/mL范围时，峰强和黑磷浓度呈线性关系为：Peakintensity＝214.99C_黑磷+815.55，R²＝0.994，其中Peak>黑磷为黑磷的浓度，单位为μg/mL，R为相关系数，无单位。

进一步地，利用MALDI-TOF MS测量钢板上的黑磷，在负离子模式下根据m/z 153.4处的峰强和黑磷分散液浓度制作工作曲线；

当黑磷浓度在100μg/mL～0.2μg/mL范围时，峰强和黑磷浓度呈线性关系为：Peakintensity＝225.82C_黑磷+717.82，R²＝0.994，其中Peak>黑磷为黑磷的浓度，单位为μg/mL，R为相关系数，无单位。

进一步地，步骤(1)中黑磷样品适用于配制成黑磷分散液、微米级黑磷分散液、片层黑磷纳米材料或者黑磷量子点分散液。

进一步地，步骤(2)中黑磷样品分散液需放置于黑暗避光缺氧的环境，且放置时间不超过7天。

进一步地，步骤(1)中待测样品为环境或生物样品基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法。

本发明提出的一种基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法具有以下有益效果：

1.本发明使用的黑磷本身就能够高效地吸收激光能量，从而促进自己的解吸与电离，因此使用本发明方法，在样品配置时不需要另外添加基质，就可以实现高灵敏度的质谱检测，从而简化了操作步骤、节省了样品准备时间且大大提高了检测效率。

2.本发明由于不需要额外的添加基质，减少了共结晶过程，也克服了传统基质中常遇到的热点问题，提高了分析的重现性，减少了成本。

3.本发明实现了复杂的植物和动物样品进行检测，实现了快速高通量的质谱检测。

4.本发明的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法体积极小，所需样品量极少，可以实现黑磷的高灵敏度质谱检测，检测限可达到ppt甚至低于ppt级别。

5.本发明的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法具有快速、高效、灵敏、信号稳定、高通量、准确的特点，并且具有对黑磷进行定量的可能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1(a)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对1μL空白样品在负离子模式下的质谱检测结果。

图1(b)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对1μL空白样品在正离子模式下的质谱检测结果。

图2(a)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对1μL微米级的黑磷样品在负离子模式下的质谱检测结果。

图2(b)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对1μL微米级的黑磷样品在正离子模式下的质谱检测结果。

图3(a)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对1μL片层的黑磷样品在负离子模式下的质谱检测结果。

图3(b)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对1μL片层的黑磷样品在正离子模式下的质谱检测结果。

图4(a)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对1μL黑磷量子点分散液在负离子模式下的质谱检测结果。

图4(b)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对1μL黑磷量子点在正离子模式下的质谱检测结果。

图5(a)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对2μL实际的植物加标提取液在负离子模式下的质谱检测结果。

图5(b)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对2μL实际的植物加标提取液在正离子模式下的质谱检测结果。

图6(a)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对10μL实际的动物加标组织在负离子模式下的质谱检测结果。

图6(b)是采用本发明一实施例提出的基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法对10μL实际的动物加标组织在正离子模式下的质谱检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请发明人在研究中发现：

(1)黑磷在MALDI-TOF MS中有特征的分子峰，基于此发展了首个黑磷的质谱定量分析方法。

(2)黑磷的质谱指纹谱在0-2000之间，尤其是在小于1000的小分子区域。

因此，本发明提出了一种基于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱双离子模式的免基质黑磷检测方法，包括以下步骤：

步骤(1)、称取适量的黑磷样品；

步骤(2)、将称取的黑磷样品用N-甲基吡咯烷酮或者水分散并配制一定浓度的分散液；

步骤(3)、将未添加基质的黑磷样品分散液滴加在商业化的MTP 384不锈钢非抛光靶板上，并将该靶板放置于所述基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪的靶托上；

步骤(4)、不需要额外添加基质，置于通风橱中，通过氮气辅助加速溶剂的挥发；

步骤(5)、样品干燥后，将该靶板放置于所述基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪的靶托上，通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对所述黑磷样品直接进行质谱检测。进一步地，本申请发明人进行了相关实验验证：

(1)所述分析方法可通过氮气可加速溶剂的挥发，加快分析的速度。

(2)所述分析方法配制的黑磷样品浓度范围为0.0000008-1000μg/mL，检测限在ppt水平甚至低于ppt水平。

(3)所述分析方法在在正离子模式下，质谱的激光功率设置为5-60％，频率设置为100-200，shots设置为100-500；在负离子模式下，质谱的激光功率设置为15-55％，频率设置为100-200，shots设置为100-500。而在这两种模式下，Matrix Suppression Mode设置为Off，Detector Gain设置为4-8x，laser Attenuator范围为1-mini到5-ultra。。

(4)所述分析方法的黑磷样品可配制成黑磷分散液、微米级黑磷分散液、片层黑磷纳米材料及或黑磷量子点分散液。

(5)所述分析方法的黑磷样品分散液需为新制的黑磷分散液。

(6)所述分析方法的黑磷样品分散液放置于黑暗避光缺氧的环境，且放置时间不超过7天。

(7)所述分析方法的步骤(2)中的分散液配制成多份不同浓度的黑磷标液，将每份黑磷标液滴加在MTP 384不锈钢非抛光靶板上；

利用MALDI-TOF-MS测量钢板上的黑磷，在正离子模式下根据m/z 216.6处的峰强和黑磷分散液浓度制作工作曲线；

当黑磷浓度在100μg/mL～0.2μg/mL范围时，峰强和黑磷浓度呈线性关系为：Peakintensity＝214.99C_黑磷+815.55，R²＝0.994，其中Peak>黑磷为黑磷的浓度，单位为μg/mL，R为相关系数，无单位。

利用MALDI-TOF-MS测量钢板上的黑磷，在负离子模式下根据m/z 153.4处的峰强和黑磷分散液浓度制作工作曲线；

当黑磷浓度在100μg/mL～0.2μg/mL范围时，峰强和黑磷浓度呈线性关系为：Peakintensity＝225.82C_黑磷+717.82，R²＝0.994，其中Peak>黑磷为黑磷的浓度，单位为μg/mL，R为相关系数，无单位。

(8)所述分析方法所用样品体积极小，在1-10μL范围内即可。

(9)所述分析方法可对环境水样、复杂的植物样品或生物组织样本进行检测。

实施例

在对黑磷的标准样品进行检测时，用移液枪吸取1μL的100μg/mL黑磷NMP分散液并直接点到MTP 384不锈钢非抛光靶板(Bruker Daltonics)上，不添加任何基质，置于通风橱中，通过氮吹加速溶剂的挥发。而在对植物提取液进行检测时，先将黑磷的NMP分散液与植物提取液按1:1比例混合，用移液枪吸取2μL该混合液并直接点到MTP 384不锈钢非抛光靶板(Bruker Daltonics)上。而在对动物组织进行检测时，先取0.2μg动物组织，利用匀浆机对其匀浆，加入100μL的100μg/mL黑磷NMP分散液，继续匀浆将其混合均匀，用移液枪吸取10μL该混合液并直接点到MTP 384不锈钢非抛光靶板(Bruker Daltonics)上，不添加任何基质，置于通风橱中，通过氮吹加速溶剂的挥发。这三种样品最后都用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对所述3种样品直接进行质谱检测。使用的仪器型号为BrukerDaltonicsAutoflex III Smartbean MALDI-TOF质谱仪，使用频率为200Hz的355nmNd:YAG，在负离子模式下，激光功率设置为35％，质谱检测范围为0-2000；而在正离子模式下，激光功率设置为40％，质谱检测范围为1-1000。而在这两种模式下，MatrixSuppression Mode设置为Off，Detector Gain设置为4.6x；laser Attenuator设置为5-ultra。空白样品通过相同的方法进行检测。测定结果如图1(a)-图6(b)所示，其中图1(a)、图1(b)为空白样品的检测结果，图2(a)、图2(b)为微米级的黑磷样品的检测结果，图3(a)、图3(b)为片层的黑磷样品的检测结果，图4(a)、图4(b)为黑磷量子点的检测结果，图5(a)、图5(b)为实际的植物加标提取液的检测结果，图6(a)、图6(b)为实际的植物加标组织的检测结果。从图2(a)～(b)、图3(a)～(b)、图4(a)～(b)可以看出，在无基质的情况下，无论是在正离子模式还是负离子模式下，我们发现所测的三种黑磷黑磷在MALDI-TOF MS中有特征的分子峰团簇，证明本实施例的分析方法在样品配备时，无需加入基质，既可直接用于黑磷样品的分析。从图5(a)～(b)可以看出，该方法可适用于复杂的植物提取液的检测。从图6(a)～(b)可以看出，该方法甚至可以适用于复杂的动物组织的检测。

从以上实施例可以看出，我们首次发现黑磷在MALDI-TOFMS中有特征的分子峰，并且在准备样品时不需要另加基质，从而简化了操作步骤并节省了时间，大大提高了检测效率，可实现快速高通量的样品检测。所需样品量极小，可以实现黑磷的高灵敏度检测，检测限可达到ppt甚至低于ppt级别，并且基于此发展了首个复杂样品中黑磷的定量分析方法,因此具有广阔的应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。