一种用于贲门癌高危人群筛查的SNP标志物及试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，具体涉及一种用于贲门癌高危人群筛查诊断的SNP标志物及试剂盒。

背景技术

贲门是位于食管胃交界部，齿状线下方2cm以内的组织器官。由于贲门解剖范围较小，该部位发生癌变后组织侵犯范围较广，较难准确定位肿瘤的部位，因此国际上对发生于食管下段胃交界部的肿瘤统称为食管胃交界部腺癌，并将其分为三类，一类为食管下段腺癌，第二类为真正的贲门腺癌，第三类为贲门下腺癌。在西方国家，主要以食管下段腺癌为主，而在我国则以第二类真正的贲门腺癌为主，第三类型则较少见。本专利中的所述的贲门癌均为第二类贲门腺癌。

贲门癌是贲门粘膜腺上皮发生的恶性肿瘤。在我国食管癌高发区，贲门癌同时高发，贲门癌和食管癌发病比例保持在1：2左右。且贲门癌和食管癌一样具有明显的家族聚集现象和显著的地域分布差异，形成明显的高低发区，贲门癌患者家族史阳性率占30％-40％，甚至更高，强烈提示遗传易感因素在贲门癌发病中起重要作用。由于临床症状相似，均为上消化道梗阻，上世纪70年代之前曾被划归为食管癌进行诊治。中晚期贲门癌5年生存率仅为10％左右，早期贲门癌的5年生存率可达80％-90％以上，然临床就诊的贲门癌患者95％以上为中晚期，缺乏特异性临床症状是导致这一临床现象的主要原因。目前，对无症状人群进行胃镜普查，是早期发现贲门癌的主要技术手段，然而无症状人群胃镜普查早期贲门癌检出率仅为2％-3％左右。大量人群的陪检及重复检查、胃镜检查导致的强烈不适感和其昂贵成本严重限制胃镜检查作为一种大规模无症状人群普查技术手段的应用和推广。

贲门癌高危人群的传统界定标准为：高发区，男性，家族史阳性，有长期吸烟、饮酒史。然而，这些标准界定的贲门癌高危人群，最终演变为贲门癌的比例非常低，很难做到精准界定和预判。随着现代分子生物学技术的发展和人类基因组计划的实施，基因检测越来越简单方便，贲门癌高危人群精准分子分型、早期预警和筛查成为可能，也越来越成为贲门癌早期发现、降低死亡率的重要技术手段。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphsm,SNP)是指基因组水平上由单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的发生频率大于1％，是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP遗传稳定性强，易于检测，位于基因内部的SNP能直接影响到蛋白质的结构或表达水平，进而影响到组织、器官乃至生理功能。采用SNP作为基因组标志的关联分析方法是目前最常用的疾病遗传易感基因检测方法之一。

由于贲门癌是一个多因素、多基因参与的复杂性疾病，群体中存在多个贲门癌发病相关易感基因和位点，之前的研究由于缺乏高通量检测位点、高通量检测样本的技术，往往更多关注的是单个或极少数易感基因和位点与疾病发生发展的关系，导致对高危人群筛查和判定的特异性和灵敏度均较低，很难准确筛查出贲门癌高危人群，而无法做到早期发现贲门癌患者。

目前，一些传统医学手段，如组织细胞检测存在着其固有的缺陷，取材位置不当、组织细胞标本材料不足或人为经验不足等都将导致疾病的误诊和漏诊。甄别贲门癌易感性分子指标，进行微创的基因型检测，界定无症状贲门癌高危易感人群，并对其进行临床跟踪检查，以期发现早期贲门癌是解决以上临床难题的有效方法。目前，尚无用于贲门癌高危人群筛查的SNP位点和试剂盒的报道。

综上所述，研发一种用于筛查无症状贲门癌高危易感人群的SNP位点试剂盒，对贲门癌发病风险的预测、早期发现贲门癌、降低贲门癌死亡率具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题和不足，本发明的第一个目的是提供一种用于贲门癌高危人群筛查的SNP标志物。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测上述SNP标志物的特异性引物。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测上述SNP标志物的特异性引物在制备用于贲门癌高危人群筛查试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种用于贲门癌高危人群筛查的试剂盒。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于贲门癌高危人群筛查的SNP标志物，所述SNP标志物为rs2274223、rs13042395、rs7447927、rs1642764、rs35597309、rs10074991、rs2294693、rs4072037、rs10931936、rs13016963、rs10201587、rs7578456、rs9288318、rs1801133和rs1048943的组合。

上述SNP标志物的特异性扩增引物为：

rs2274223的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

rs13042395的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；

rs7447927的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

rs1642764的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；

rs35597309的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；

rs10074991的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17；

rs2294693的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；

rs4072037的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23；

rs10931936的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26；

rs13016963的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29；

rs10201587的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32；

rs7578456的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35；

rs9288318的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38；

rs1801133的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41；

rs1048943的扩增引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44。

上述SNP标志物的特异性延伸引物为：

rs2274223的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；

rs13042395的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；

rs7447927的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.9；

rs1642764的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.12；

rs35597309的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.15；

rs10074991的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.18；

rs2294693的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.21；

rs4072037的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.24；

rs10931936的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.27；

rs13016963的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.30；

rs10201587的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.33；

rs7578456的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.36；

rs9288318的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.39；

rs1801133的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.42；

rs1048943的延伸引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.45。

上述的特异性扩增引物在制备用于贲门癌高危人群筛查试剂盒中的应用。

上述的特异性延伸引物在制备用于贲门癌高危人群筛查试剂盒中的应用。

一种用于贲门癌高危人群筛查的试剂盒，所述试剂盒用于检测外周血DNA中的rs2274223、rs13042395、rs7447927、rs1642764、rs35597309、rs10074991、rs2294693、rs4072037、rs10931936、rs13016963、rs10201587、rs7578456、rs9288318、rs1801133和rs1048943。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒包含上述的特异性扩增引物和/或上述的特异性延伸引物。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包含PCR技术常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包含标准品和/或对照品。

本发明用于贲门癌高危人群筛查的SNP标志物(15个SNP位点的组合)，是基于国内大样本量贲门癌和正常人群的全基因组关联分析所筛查得出的，并在贲门癌高发区选取10000例50-60岁无症状人群，提取其外周血DNA，根据本发明用于贲门癌高危人群筛查的SNP标志物中15个SNP位点的基因型，将上述10000例无症状人群分为高危和非高危两组人群，并对两组人群进行了8年跟踪随访及胃镜检查、活检病理确诊，比较两组人群贲门癌患病率，并进行数据统计分析，从而判定15个SNP位点在筛查贲门癌高危人群中的敏感度和特异度。结果发现，两组人群贲门癌患病率差异显著，而且高危人群患贲门癌的比例明显高于非高危组人群，最终确定该15个SNP位点为贲门癌高危人群筛查用的SNP位点，并自主设计了贲门癌高危人群筛查用SNP试剂盒。

本发明人以标准操作程序收集统一标准的外周血样标本，系统完整收集人口学资料、临床诊疗资料，并采用了Affymetrix6.0芯片进行全基因组扫描，Sequeom MassARRAY基因分型进行单个位点检测。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

(1)本发明基于国内大样本量贲门癌和正常人群的全基因组关联分析获取食管癌相关的SNP位点，并将这些位点在贲门癌高发区10000例无症状人群中进行验证，最终筛选出了可用于贲门癌高危人群筛查的15个SNP位点组合，该15个SNP位点组合可用于贲门癌的早期评估和大规模筛查，检出成功率高，技术重现性好，最大程度上界定了贲门癌高危易感人群，使早期贲门癌检出率达到71.4％，为贲门癌高危人群的筛查、患病风险评估提供了重要依据。

(2)SNP标志物具有微创、易于检测的临床优势，通过检测本发明的SNP标志物组合将大大提高贲门癌筛查诊断的敏感性和特异性，为贲门癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(3)本发明以用于贲门癌高危人群筛查的SNP标志物组合的特异性扩增引物和特异性延伸引物来制备试剂盒，该试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，可用于贲门癌高发区无症状人群的大规模筛查，而且检出成功率高，技术重现性好，性价比高，为贲门癌高危人群的筛查、患病风险评估提供重要依据，以实现对贲门癌疾病的早期评估和诊断，同时也使贲门癌的早期筛查更加方便易行。

附图说明

图1为本发明15个SNP位点用于筛查、确定贲门癌高危人群的ROC曲线。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。

下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例一：用于检测贲门癌易感性相关的SNP位点的筛选

发明人对从我国贲门癌高发区(河南省林州市、安阳市、辉县市等)收集的1528例贲门癌患者和6936例健康人群外周血DNA进行全基因组关联分析，筛选出了与贲门癌发明显著相关的15个SNP位点；其中，1528例贲门癌患者为病理学明确诊断的贲门癌患者，6936例健康人群是经病理学明确证实无贲门癌变的健康人群。

与贲门癌发病显著相关的15个SNP位点筛选的具体操作如下：

1、外周血DNA提取：按照QIAGEN基因组DNA提取试剂盒的说明书提取样品DNA，具体步骤为：

(1)细胞解冻：将血样从-80℃冰箱中取出，依次置于-20℃低温冰箱24h、4℃冰箱24h；

(2)去除红细胞：依次取1.0ml FG1 buffer、400μl血样加入新的EP管中，上下均匀颠倒20-30次，混匀直至肉眼观察无血凝块及颗粒出现；4℃，15000rpm离心7分钟，弃上清；

(3)去除蛋白质：向沉淀中加FG2/PK溶液200μl，立即震荡混匀，至细胞团完全溶解；15000rpm离心30秒，65℃水浴孵育20min；后4℃，15000rpm离心30秒；

(4)抽提DNA：加200μl异丙醇(100％)，手动振荡(90-120次/分)混匀5-6分钟，直到细丝状DNA出现；15000rpm离心7分钟，弃上清，倒置沥干30秒；加300μl 70％乙醇，摇床震荡混匀20分钟，后15000rpm离心7分钟；倒置沥干10分钟；

(5)溶解DNA：加110μl FG3，65℃水浴孵育20分钟，置摇床12h；4℃，15000rpm离心30秒。

2、测量浓度：通常能得到15-25ng/μl DNA，纯度(紫外260OD/280OD比值和260OD/230OD比值)均在1.8-2.0。

3、进行全基因组扫描：在Affymetrix SNP 6.0芯片上进行全基因组扫描。

4、数据分析与处理：

对“贲门癌患者”组和“健康人群”组外周血DNA的Affymetrix SNP 6.0芯片扫描结果，采用单因素和多因素Logistic回归分析方法，发现基因型分布频率存在差异的15个SNP位点，这15个SNP位点包括rs2274223、rs13042395、rs7447927、rs1642764、rs35597309、rs10074991、rs2294693、rs4072037、rs10931936、rs13016963、rs10201587、rs7578456、rs9288318、rs1801133和rs1048943，参见表1，15个SNP位点的序列参见表2。

表1“贲门癌患者”组和“健康人群”组全基因组关联分析结果

表2与贲门癌发病显著相关的15个SNP位点的序列

实施例二：10000例贲门癌高发区无症状人群易感基因位点检测及高危人群筛查

在贲门癌高发区(林州市、安阳市、辉县市、长治市等)选取10000例50-60岁无症状人群，提取其外周血DNA，根据实施例一筛选出的与贲门癌发病存在着显著关联的15个SNP位点的基因型，将上述10000例无症状人群分为高危和非高危两组人群，并对两组人群进行了8年跟踪随访及胃镜检查、活检病理确诊，比较两组人群贲门癌患病率，并进行数据统计分析，从而判定15个SNP位点在筛查贲门癌高危人群中的敏感度和特异度。

具体操作步骤如下：

1、外周血DNA提取：按照QIAGEN基因组DNA提取试剂盒的说明书提取样品DNA，其具体操作与实施例一中外周血DNA提取的步骤相同，在此不再赘述。

2、测量浓度：通常能得到15-25ng/μl DNA，纯度(紫外260OD/280OD比值和260OD/230OD比值)均在1.8-2.0。

3、进行Sequenom MassARRAY基因分型：

(1)设计和合成上述15个SNP位点的PCR特异性扩增引物和单碱基延伸引物：

用MassARRAY Assay Design软件对全基因组关联分析发现的15个SNP位点设计PCR特异性扩增引物和单碱基的特异性延伸引物，所述特异性扩增引物和特异性延伸引物的具体核苷酸序列如表3所示。

表3 15个SNP位点的PCR扩增产物及单碱基延伸引物

(2)PCR扩增：

PCR扩增采用多重PCR技术，在96孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl。

①配制PCR扩增反应体系，PCR master mix液的配制比例参见表4。

表4 PCR扩增反应体系的配制

以上试剂混匀后在96孔板的每个加样孔中加入2μL。该96孔板即为PCR反应板。

②向96孔板的每个加样孔中依次加入DNA抽提物1μL、0.25uM Primer Mix 2μl。对于每个反应孔，PCR反应体系的总体积为5μl。

③将96孔板放置于兼容96孔板的PCR仪，进行PCR扩增反应。PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃维持。

(3)PCR产物碱性磷酸酶处理：

在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。具体操作为：

①配制碱性磷酸酶处理反应液(SAP Mix)，SAP Mix液的配制比例参见表5。

表5 SAP Mix液配制比例

②向96孔板的每个加样孔中加入2μL SAP Mix。对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAP Mix 2μl。

③将96孔板放置在兼容96孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃40min；85℃5min；4℃维持。启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。

(4)单碱基延伸：

在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应。

①配制单碱基延伸反应液(EXTEND Mix)，单碱基延伸反应液的配制比例参见表6。

表6 EXTEND Mix的配制比例

②向96孔板的每个加样孔中加入2μL EXTEND Mix。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系总体积为9μl，包含SAP处理后PCR产物7μl及EXTEND Mix液2μl。

③将96孔板放置在兼容96孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：94℃30s，94℃5s，52℃5s，80℃5s；52℃5s，80℃5s，4个循环；94℃5s，52℃5s，80℃5s，39个循环；72℃3min；4℃维持。启动PCR仪进行单碱基延伸反应。

(5)树脂纯化：

①将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；

②加16μl水到延伸产物的对应孔内；

③将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；

④43000rpm离心5min使树脂沉入孔底部。

(6)芯片点样：

启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至96孔固体支持物上，制作出芯片。

(7)质谱检测：

将点样后的芯片使用MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果采用TYPER4.0软件(Sequenom)进行分型并输出结果，分析分析10000例无症状人群的15个SNP位点，确定出高危人群和非高危人群。

根据人群中含SNP等位基因的不同，进行风险评分：

将携带有风险等位基因纯合子即变异纯合型的风险定为2分；

将携带有风险等位基因杂合子即杂合型的风险定为1分；

将携带有保护性等位基因纯合子即变异纯合型的风险定为0分；

最终有效检测例数为9948例，经风险评分，将评分大于等于5分的无症状人群确定为高危人群，对全部人群进行8年长期跟踪随访、胃镜检查、病理活检，最终确定两组人群中贲门癌患者，其结果见表7。

表7基于SNP位点基因型风险评估结果

由表7可知，经SNP位点检测、风险评估为贲门癌高危人群，经过8年长期跟踪随访、胃镜检查、病理活检最终确定为贲门癌患者的比例为17.3％(205/1183)，是传无症状人群胃镜普统查贲门癌检出率(2％-3％)的5.8-9倍，极大提高了早期贲门癌的检出率，从而降低了贲门癌患者的死亡率。

绘制ROC曲线来评估15个SNP位点在筛查贲门癌高危人群中的敏感度和特异度，进而评估这些SNP对贲门癌发病的预测能力，结果见图1。由图1可知，该15个SNP位点以80.7％的AUC将贲门癌高危人群和非高危人群分开，最佳临界点的灵敏度为71.4％，特异度为89.9％。

实施例三：用于贲门癌高危高危人群筛查的试剂盒的制作

用于贲门癌高危高危人群筛查试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和Sequenom MassARRAY基因型分型技术，该试剂盒含有实施例一筛选出的15个与贲门癌的发病存在着显著关联的SNP位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物(特异性扩增引物和特异性延伸引物的序列参见表3)，还有含有PCR技术所需的常用试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、PCR反应缓冲液、酶切反应缓冲液、去离子水等，这些常用的试剂都是本领域技术人员所熟知的；另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。该试剂盒的检测方法包括：(1)外周血DNA提取；(2)PCR扩增；(3)PCR产物碱性磷酸酶处理；(4)单碱基延伸；(5)树脂纯化；(6)芯片点样；(7)质谱检测等步骤；每一个步骤的具体操作参见实施例二。

此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测SNP，再通过SNP谱辅助筛查贲门癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病贲门癌早期筛查的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

综上所述，本发明用于贲门癌高危人群筛查的15个SNP位点组合，是经过大样本量贲门癌患者和正常人群进行全基因组关联分析得出的贲门癌发病密切相关的易感位点，同时又在大规模无症状人群中进行了验证，可以很好的将无症状人群区分为贲门癌高危人群和非高危人群，且高危人群发展为贲门癌的比例远远高于非高危人群(17.3％:0.93％)，是传统无症状人群胃镜普查贲门癌检出率的5.8-9倍；使现有临床就诊早期贲门癌比例提高到了71.4％，极大提高了早期癌的检出率和就诊率，从而大大降低了贲门癌患者的死亡率，为贲门癌患者和家庭带来极大的福祉，且该试剂盒检出成功率高、技术重现性好、性价比高，为贲门癌高危人群的筛查、患病风险评估提供重要依据，具有较大的临床应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 一种用于贲门癌高危人群筛查诊断的SNP标志物及试剂盒

<160> 45

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatctcctga cctcgtgat19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagaacactg gaatggacaa 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggaacgagc agtttctgtt cc22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttccatccc acccaatg 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctcaacaga tagacacaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaccagggcc agtgcaccgt 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccaggaggat gttcagtg 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgctgctgt ccatctatt19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagggaggct aggtggag 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacaacttct tcctctgact 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgaacgata cggacaat 18

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctcctggaat taagctatcc tcc 23

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagagtgttc ttggcttca19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaggctcgga catcagat 18

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

catccattgc aagggtggtc tt22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gttgttgttg ttgagatgga 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caggagaatt gcttgaacc19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctttttgctc ccagcctata 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tggcttgtct catctcatc19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtatctctgg aagtccttgt 20

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atcagtgaat tggcagtg 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggtggtcttc gtggtctt 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tctcagcctg tccttagc 18

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cccgcaacag ttgttac17

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cagcagatac agacttacct 20

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tggatgtggc ttgttctc 18

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caatcctctg attcatacct 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cctcttcaga ttctccttca 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttccttcctc taaccttgtc 20

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aggaaggaaa catcagc17

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggtgtctcgc tatgttgt 18

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tgcttatgga ctggaagaat 20

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccatttgttt gtgtcctctt ca22

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

acctattagc accatctact g 21

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttctcgcact gattccttc19

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cagagacgtc ctccgaag 18

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ctaatagtca gcacagtctt g 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ctctgcctat tcatcctacc 20

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gaggggaccc ttttctac 18

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tgaggctgac acattcttc19

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gcaagttctg gacctgag 18

<210> 42

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

aaggtgtctg cgggag 16

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tgcttgcctg tcctctat 18

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gtctcaccga tacacttcc19

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aagtgtatcg gtgagacc 18