法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-06-16
授权
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2019-11-19
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/68 申请日:20180413
实质审查的生效
2019-10-25
公开
公开
技术领域
本发明属于质谱检测技术领域，具体涉及一种用于生物标志物灵敏检测的基于竞争性非共价相互作用的质谱检测新方法。
背景技术
生物标志物是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。但是由于其结构的复杂多样性，很难被有效灵敏地检测到。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，由于其灵敏度高，检测限低，高通量和能提供准确的分子质量或分子结构信息，从而广泛地应用于分析检测中。MALDI-TOF MS不但可以分析无机分子，聚合物，还可以分析大分子，如核酸和蛋白质。当有些分析物无法直接通过MALDI-TOF MS检测时，通常会引入一种容易解吸电离的质量标签来间接检测。基于以上优势，质谱作为一种有效的分析方法在生物标志物的检测上具有潜在价值。
因此，发展一种基于MALDI-TOF MS的检测新方法，提高生物标志物的检测灵敏度十分重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于生物标志物灵敏检测的基于竞争性非共价相互作用的质谱检测方法。
本发明所提供的用于生物标志物灵敏检测的基于竞争性非共价相互作用的质谱检测方法，包括下述步骤：
1)根据待检测的生物标志物设计核酸适配体；
2)将核酸适配体与金纳米颗粒一起孵育，得到核酸适配体-金纳米颗粒结合体；
3)将所述核酸适配体-金纳米颗粒结合体分别与一系列已经浓度的生物标志物标准品、固定量的质量标签共同孵育，分离，对得到的固体分别进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，得到一系列对应于已知浓度的生物标志物的与金纳米颗粒结合的质量标签的信号，建立标准的生物标志物的浓度与质量标签的信号的对应关系；
4)将未知浓度的生物标志物与步骤2)中的所述核酸适配体-金纳米颗粒结合体和质量标签共同孵育，分离，对得到的固体进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，得到对应于未知浓度的生物标志物的金纳米颗粒结合的质量标签的信号，根据步骤3)中的标准的生物标志物的浓度与质量标签的信号的对应关系，得到生物标志物的浓度。
上述方法中，所述生物标志物具体可为前列腺癌特异性抗原。
前列腺癌特异性抗原是一种含有237个氨基酸的单链多肽，属于具有组织特异性的有糜蛋白酶样作用的丝氨酸蛋白酶族，可以分解精液中的主要胶状蛋白，有稀释精液的作用。前列腺癌特异性抗原具有组织特异性，只存在于人前列腺腺泡及导管上皮细胞胞浆中，不表达于其它细胞，是目前临床上常用的前列腺癌诊断的标志物。
当所述待检测的生物标志物为前列腺癌特异性抗原时，所述核酸适配体的序列为CGT CGT ATT AAA GCT CGC CAT CAA ATA GCT TT。
上述方法中，所述金纳米颗粒的粒径分布在11-17nm之间，平均尺寸为13nm；紫外特征吸收最大值在520nm波长处。
所述核酸适配体与金纳米颗粒的孵育温度可为室温，时间可为12-24h。
在酸性pH条件下进行可以增强核酸适配体与金纳米颗粒的相互作用。
核酸适配体与金纳米颗粒的相互作用在缓冲溶液比水溶液的环境下要结合的更强。
核酸适配体与金纳米颗粒的相互作用最大负载率为65％。
上述方法中，所述质量标签为具有良好的解析与离子化特性可以在MALDI MS中出现信号的物质。
具体地，所述质量标签可为腺嘌呤，其2位上的氨基与金纳米颗粒存在非共价相互作用。
上述方法步骤3)中，所述一系列已知浓度的生物标志物标准品的浓度依次可为：0.06、0.3、0.6、3、6ng/mL。
核酸适配体-金纳米颗粒结合体与生物标志物、质量标签共同孵育的温度可为室温，时间可为1-3h，具体可为2h。
上述方法中，核酸适配体与金纳米颗粒的相互作用、质量标签与金纳米颗粒的相互作用可以至少承受住12000rpm的转速，即，分离时，采用离心分离，转速不高于12000rpm。
上述方法中，所述质谱分析的条件为：电压：加速电压：19.000kV；延迟引出电压：14.920kV；反射器电压：20.000kV；透镜电压：7.000kV；频率：1.000Hz；激光器能量：20％；累加次数：100次；正离子模式。
本发明可用于灵敏检测前列腺癌特异性抗原，由于核酸适配体是32碱基的单链DNA，所以一条核酸适配体占据的金纳米颗粒表面位点，可以被多个腺嘌呤质量标签填补，在质谱检测中具有信号放大的效果；
上述方法中，对前列腺癌抗原是特异性、专一性地检测，可以排除人的体液中大部分蛋白的干扰，例如人血清白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白G等。
上述方法中，对前列腺特异性抗原的检测低，灵敏度高，在前列腺特异性抗原的浓度低至0.06ng/mL时，仍然有明显的质谱信号。
上述方法中，对前列腺特异性抗原的微量变化具有明显的响应，在前列腺特异性抗原的浓度由0.06ng/mL变化到6ng/mL时，质谱信号增强了90倍。
本发明可以对复杂的临床样品中的前列腺癌特异性抗原进行检测，例如病人尿液，同时正常人尿液不会出现假阳性结果。
上述方法中，比较本发明与商用酶联免疫吸附测定试剂盒，两者在实际病人样本中前列腺特异性抗原的测定具有较高的吻合。
本发明从技术上克服了生物标志物检测灵敏度低，复杂基质干扰大的问题，通过设计一种基于竞争性的非共价相互作用的质谱检测新方法，放大质谱信号，利用质谱灵敏度高，检测限低的优点，从而实现对生物标志物的灵敏检测。本发明对复杂体系的抗干扰能力强，不受到人体液中的其他蛋白的干扰，可以用于临床实际病人样本中前列腺癌特异性抗原的检测；本发明提供的是一种通用的质谱分析方法，可以用于很多其他生物标志物的检测。
附图说明
图1为金纳米颗粒的透射电镜图。
图2为金纳米颗粒的紫外吸收图。
图3为不同浓度的核酸适配体与金纳米颗粒的负载量分布图。
图4为不同浓度的核酸适配体与金纳米颗粒的负载率分布图。
图5为腺嘌呤质量标签的信号强度对应前列腺癌特异性抗原的浓度变化的质谱图。
图6为本发明对人体内其他蛋白的干扰实验。
图7为本发明引入内标物之后的线性方程。
图8为本发明在正常人尿液中的回收率实验表。
图9为本发明与商用ELISA试剂盒对病人样本中前列腺癌特异性抗原的检测对比数据。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明下述实施例所用的样品购自美国sigma公司。
本发明下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的型号为BIFLEXTM III(Bruker)。
实施例1、合成金纳米颗粒
50mL煮沸水加2mL 1％HAuCl4加热煮沸(回流即可)，快速搅拌下加入1mL>3Ct·2H2O定容至5mL)，继续加热，5min内颜色由黄—无色—蓝黑—深黑—酒红色，至颜色稳定，再加热5min，停止加热，继续搅拌至室温即可，其粒径为13纳米。
图1为金纳米颗粒的透射电镜图。
图2为金纳米颗粒的紫外吸收图。
实施例2、前列腺癌特异性抗原标准品的检测
将200μL 1.3nM金纳米颗粒溶液分别与10,50,100和150μL的浓度为1μM的核酸适配体(序列为CGT CGT ATT AAA GCT CGC CAT CAA ATA GCT TT，购自生物工程(上海)股份有限公司)混合，室温反应过夜，检测不同浓度的核酸适配体与金纳米颗粒的负载量及负载率分布图。
图3为不同浓度的核酸适配体与金纳米颗粒的负载量分布图。
图4为不同浓度的核酸适配体与金纳米颗粒的负载率分布图。
最终选择将200μL 1.3nM金纳米颗粒溶液与50μL 1μM的核酸适配体混合，室温反应过夜，12000rpm 10min离心弃上清，沉淀用水洗两次，加入腺嘌呤质量标签(10μL1μM)和前列腺癌特异性抗原标准品溶液，最终浓度分别是0.06,0.3,0.6,3,6ng/mL，室温反应2小时，12000rpm 10min离心弃上清，沉淀用水洗两次后，取沉淀1μL与基质(CCA)1μL混合加入到MALDI靶板上，在空气中干燥后进入质谱分析。
质谱条件为：电压：加速电压：19.000kV；延迟引出电压：14.920kV；反射器电压：20.000kV；透镜电压：7.000kV；频率：1.000Hz；激光器能量：20％；累加次数：100次；正离子模式。
图5为腺嘌呤质量标签的信号强度对应前列腺癌特异性抗原的浓度变化的质谱图。
实施例3、干扰实验
将200μL 1.3nM金纳米颗粒溶液与50μL 1μM的核酸适配体混合，室温反应过夜，12000rpm 10min离心弃上清，沉淀用水洗两次，分别加入腺嘌呤质量标签(10μL 1μM)和10μL 6ng/mL干扰蛋白(人血清蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白、牛血清以及牛血清与前列腺癌特异性抗原的混合物)室温反应2小时，12000rpm 10min离心弃上清，沉淀用水洗两次后，取沉淀1μL与基质(CCA)1μL混合加入到MALDI靶板上，在空气中干燥后进入质谱分析。
质谱条件为：电压：加速电压：19.000kV；延迟引出电压：14.920kV；反射器电压：20.000kV；透镜电压：7.000kV；频率：1.000Hz；激光器能量：20％；累加次数：100次；正离子模式。
图6为本发明对人体内其他蛋白的干扰实验。
实施例4、回收率测试
将200μL 1.3nM金纳米颗粒溶液与50μL 1μM的核酸适配体混合，室温反应过夜，12000rpm 10min离心弃上清，沉淀用水洗两次，加入前列腺癌特异性抗原(终浓度分别为0、3、6、30、60ng/mL)和腺嘌呤质量标签(10μL 1μM)，室温反应2小时，12000rpm10min离心弃上清，沉淀用水洗两次后，取沉淀1μL和内标物3-甲基腺嘌呤(1μL 1μM)，基质(CCA)1μL混合加入到MALDI靶板上，在空气中干燥后进入质谱分析。
质谱条件为：电压：加速电压：19.000kV；延迟引出电压：14.920kV；反射器电压：20.000kV；透镜电压：7.000kV；频率：1.000Hz；激光器能量：20％；累加次数：100次；正离子模式。
以腺嘌呤质量标签与内标物3-甲基腺嘌呤质谱信号强度比对应前列腺癌特异性抗原浓度做线性曲线。
图7为本发明引入内标物之后的线性方程。
将200μL 1.3nM金纳米颗粒溶液与50μL 1μM的核酸适配体混合，室温反应过夜，12000rpm 10min离心弃上清，沉淀用水洗两次。在正常人尿液中加入前列腺癌特异性抗原标准品，终浓度分别为0.8、8、80ng/mL。取上述尿液10μL以及腺嘌呤质量标签10μL(1μM)室温反应2小时，12000rpm 10min离心弃上清，沉淀用水洗两次后，取沉淀1μL和内标物3-甲基腺嘌呤(1μL 1μM)，基质(CCA)1μL混合加入到MALDI靶板上，在空气中干燥后进入质谱分析，根据腺嘌呤质量标签与内标物3-甲基腺嘌呤质谱信号强度比以及标准曲线计算出上述尿液中的前列腺癌特异性抗原的含量，结果如图8所示。
实施例5、前列腺癌症病人尿液中前列腺癌特异性抗原含量分析
测试前列腺癌症病人尿液中的前列腺癌特异性抗原的含量，将200μL 1.3nM金纳米颗粒溶液与50μL 1μM的核酸适配体混合，室温反应过夜，12000rpm 10min离心弃上清，沉淀用水洗两次，加入腺嘌呤质量标签(10μL 1μM)和前列腺癌症病人尿液10μL，室温反应2小时，12000rpm 10min离心弃上清，沉淀用水洗两次后，取沉淀1μL和内标物3-甲基腺嘌呤(1μL 1μM)，基质(CCA)1μL混合加入到MALDI靶板上，在空气中干燥后进入质谱分析，根据腺嘌呤质量标签与内标物3-甲基腺嘌呤质谱信号强度比以及标准曲线计算出前列腺癌症病人尿液中的前列腺癌特异性抗原的含量，结果如图9所示。
质谱条件为：电压：加速电压：19.000kV；延迟引出电压：14.920kV；反射器电压：20.000kV；透镜电压：7.000kV；频率：1.000Hz；激光器能量：20％；累加次数：100次；正离子模式。
根据标准ELISA试剂盒(购于Abcam(上海)贸易有限公司)测试方法测试上述前列腺癌症病人尿液中的前列腺癌特异性抗原，结果如图9所示。
<110> 中国科学院化学研究所 中国科学院大学
<120> 用于生物标志物灵敏检测的基于竞争性非共价相互作用的质谱检测方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cgtcgtatta aagctcgcca tcaaatagct tt 32
机译： 基于质谱的扩散测量检测非共价相互作用的方法和装置
机译： 通过基于质谱的扩散测量检测非共价相互作用的方法和装置
机译： 通过基于质谱的扩散测量检测非共价相互作用的方法和装置
