包含啶南平生物合成基因簇和标记基因的核酸构建体

对相关申请的交叉参考

本专利申请要求在2010年1月26日提交的日本专利申请号 14700/2010和在2010年11月11日提交的日本专利申请号253183/2010的 优先权，并且将其全部完整公开并入本文作为参考。

发明背景

技术领域

本发明涉及包含啶南平(pyripyropene)生物合成基因簇和标记基因的 核酸构建体。

背景技术

目前已经证明在啶南平中有从啶南平A至啶南平R的18种类型的 天然存在的类似物，所述类似物在它们侧链的结构中不同(非专利文献1)。

已经公开啶南平具有ACAT抑制活性(专利文献1)。由此期望其用于 治疗胆固醇积累等引起的疾病。并且，已经公开啶南平具有针对棉铃虫(Helicoverlpa armlgera)幼虫(非专利文献2)，小菜蛾(Dlamondback moth) 幼虫(专利文献2)，黄粉虫(专利文献2)或者蚜虫(aphids)(专利文献3)的杀 虫活性，并且由此期望其用作杀虫剂。

已知啶南平是丝状真菌作为次级代谢物产生的。例如，已经公开了粪 生青霉(Penicillium coprobium)PF1169菌株(专利文献4),烟曲霉(Aspergillus fumigatus)IFO-1289菌株(专利文献5)，网状孢正青霉 (Eupenicillium reticulosporum)NRRL-3446菌株(非专利文献2)或者灰黄青 霉(Penicillium griseofulvum)F1959菌株(专利文献2)每种产生啶南平。

通过培养上文提到的生产细菌并且收集啶南平进行啶南平的工业生 产。通常，分离的天然存在的微生物产生的次级代谢产物的量是很少的。 为了在工业上使用该产物，需要提高这些期望产物的生产力。

为了提高这些期望产物的生产力，已经进行了用于培养生产期望产物 的微生物的方法的研究，培养基组分和发酵条件的改变如加入前体的研 究，以及通过用紫外线放射或者诱变剂突变对细菌菌株的修饰。此外，除 了这些方法，最近已经进行了使用基因重组提高生产力的方法。

通过基因重组提高生产力的一般方法是提高生物合成基因的表达。例 如，通过这种方法，公开了提高无孢目(agonomycetales)产生的PF1022物 质的生产力的方法(专利文献6)。为了应用这种方法，需要分离期望产物的 生物合成基因并且需要建立在期望的产物产生微生物中用于转化的方法。

对于啶南平，目前没有关于分离它们的生物合成基因簇的报告。另外， 还未建立将产生啶南平的真菌作为宿主的转化方法。因此，目前很难将啶 南平的生物合成基因簇引入到产生啶南平的微生物中，并且通过基因重组 提高生产力是不能实现的。

现有技术参考文献

专利文献

专利文献1日本特开公报号184158/1994

专利文献2WO2004/060065

专利文献3WO2006/129714

专利文献4技术公开杂志号500997/2008

专利文献5日本特开公报号360895/1992

专利文献6日本专利号3961289

非专利文献

非专利文献1Journal of Antibiotics(1996),49(3),292-298

非专利文献2Applied and Environmental Microbiology(1995),61(12), 4429-4435

发明概述

本发明人已经发现，通过在宿主中表达包含啶南平生物合成基因簇和 标记基因的核酸构建体，显著地提高了啶南平的生产力。基于这种发现已 经做出了本发明。

相应地，本发明的目的是提供包含啶南平生物合成基因簇和标记基因 的核酸构建体。

根据本发明的一个实施方案，提供了包含啶南平生物合成基因簇和标 记基因的核酸构建体。

根据本发明的另一个实施方案，也提供了转化体，其通过将上文提到 的核酸构建体引入到宿主中获得。

进一步地，根据本发明的另一个实施方案，提供了转化体，其通过将 包含上文提到的啶南平生物合成基因簇的核酸构建体和包含上文提到的 标记基因的核酸构建体同时或者单独引入到宿主中获得。

此外，根据本发明的另一个实施方案，提供生产啶南平的方法，所述 方法包括培养上文提到的转化体并且从培养物中收集啶南平。

附图简述

[图1]图1显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳， 使用了以下引物扩增的PCR产物：M：分子量标记物(100bp梯)，泳道1： SEQ ID NO：1和2的引物，泳道2：SEQ ID NO：239和240的引物，泳 道3：SEQ ID NO：237和238的引物，泳道4：SEQ ID NO：241和242 的引物，泳道5：SEQ ID NO：247和248的引物，泳道6：SEQ ID NO： 251和252的引物，泳道7：SEQ ID NO：245和246的引物，泳道8：SEQ ID NO：243和244的引物，泳道9：SEQ ID NO：249和250的引物，泳 道10：SEQ ID NO：235和236的引物，泳道11：SEQ ID NO：233和234 的引物，泳道12：SEQ ID NO：227和228的引物，泳道13：SEQ ID NO： 229和230的引物，泳道14：SEQ ID NO：231和232的引物。

[图2]类似于图1，图2显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。 对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：M：分子量标记物(100bp 梯)，泳道1：SEQ ID NO：253和254的引物，泳道2：SEQ ID NO：257 和258的引物，泳道3：SEQ ID NO：259和260的引物，泳道4：SEQ ID  NO：255和256的引物，泳道5：SEQ ID NO：261和262的引物。

[图3]类似于图1，图3显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。 对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：泳道1：分子量标记物(100 bp梯)，泳道2：SEQ ID NO：264和265的引物(400bp扩增片段)。

[图4]图4显示用于使用的丝状真菌的质粒载体pBI-AnGpD-EGFP 的图谱。在该图中，RB指右边界，HYGr指的是潮霉素抗性编码区， PAngpdA指的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动 子，EGFP指的是增强的绿色荧光蛋白编码区，TAngpdA指的是构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶终止子，并且LB指的是左边界。

[图5A]在图5A中，左图显示用土壤杆菌(Agrobacterium)感染形成 的潮霉素抗性菌落，并且右图显示GFP荧光观察的结果。

[图5B]在图5B中,左图显示不用土壤杆菌感染的粪生青霉菌株 PF1169的菌落，在不含潮霉素的培养基中形成菌落，并且右图显示GFP 荧光观察的结果。

发明详述

微生物的保藏

用质粒pCC1-PP1转化的大肠杆菌(Escherichia coli)(大肠杆菌 EPI300^TM-T1^R)于2008年10月9日(原始保藏日)保藏在独立行政法人产业 技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番 地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11133(从国内保 藏FERM P-21704移管)(保藏者所用的识别标识：大肠杆菌 EPI300^TM-T1^R/pCC1-PP1)。

在2009年12月14日将用质粒pPYRI02转化的大肠杆菌，以保藏号 FERM BP-11203(保藏者所用的识别标识：XL1-Blue MRA/pPYRI02)保藏 在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县 筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)。

在2010年12月1日将用黏粒pPYRI07转化的大肠杆菌，以保藏号 FERM BP-11316(保藏者所用的识别标识：XL1-Blue MRA/pPYRI07)保藏 在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县 筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)。

啶南平生物合成基因簇

将本发明中的啶南平生物合成基因簇排列在核酸构建体中以便能与 后文描述的标记基因一起在宿主中表达。只要它是啶南平生物合成中涉及 的基因簇，对其没有特别限制。优选地，提供构建体，其含有选自以下的 (I)至(IV)的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列的全部或者一部分：

(I)SEQ ID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列；

(II)核苷酸序列，其能在严格条件下与SEQ ID NO:266中的从2911至 27797的核苷酸序列的互补序列杂交，并且编码与SEQ ID NO:266中的从 2911至27797的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质；

(III)SEQ ID NO:266中的从2911至27797的核苷酸序列的多核苷酸的 核苷酸序列，其中缺失、取代、插入或者添加了一个或者多个核苷酸，并 且所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO:266中的从2911至27797的核苷酸 序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质；和

(IV)核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO:266中的从2911至27797的 核苷酸序列的多核苷酸至少90%的同一性，并且编码与SEQ ID NO:266 中的从2911至27797的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质。

根据本发明进一步优选的啶南平生物合成基因簇的实施方案，所述基 因簇是含有目的基因和表达调节区的基因簇。这里，目的基因是具有一个 或者多个编码涉及啶南平的生物合成的蛋白质的基因的基因。也不限制表 达调节区，只要它具有调节上文提到的宿主中的目的基因必须的核苷酸序 列。例如，包括了启动子和终止子，其是调节目的基因在宿主中转录的量 的核苷酸序列。此外，在下面的路线1中显示了在啶南平的生物合成中涉 及的蛋白质，例如在任一生物合成途径中涉及的蛋白质。

表1

路线1

根据本发明中的目的基因优选的实施方案，提供包含核苷酸序列的核 酸构建体，所述核苷酸序列编码选自SEQ ID NOs:267至275的至少一种 氨基酸序列或者与其基本等同的氨基酸序列。

根据本发明中的目的基因的另一个优选的实施方案，提供核酸构建 体，其包含选自下面(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列：

(1)在下面(a)至(i)的核苷酸序列:

(a)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从3342至5158的核 苷酸序列,

(b)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777的核 苷酸序列,

(c)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至15144的核 苷酸序列,

(d)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至18018的核 苷酸序列,

(e)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至19296的 核苷酸序列,

(f)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从19779至21389的核 苷酸序列,

(g)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至22877的 核苷酸序列,

(h)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至24773的 核苷酸序列,以及

(i)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至27178的核 苷酸序列;

(2)能在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序 列，并且其编码与每种核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质;

(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、 插入或者添加了一个或者多个核苷酸，并且所述核苷酸序列编码与每种核 苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质;和

(4)核苷酸序列，其具有与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的 同一性，并且编码与每种核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质。

根据本发明中的目的基因的另一个优选的实施方案，提供了核酸构建 体，其包含选自下面(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:

(1)核苷酸序列，其包含上文提到的(a)至(i)或者(a)至(h)的全长 的核苷酸序列的全部;

(2)核苷酸序列，其能在严格条件下与(1)中的核苷酸序列的互补序列 杂交，并且编码的蛋白质与所述核苷酸序列编码的蛋白质基本等同;

(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、 插入或者添加了一个或者多个核苷酸，并且所述核苷酸序列编码的蛋白质 与(1)的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同;并且

(4)核苷酸序列，其具有与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的 同一性，并且编码的蛋白质与(1)的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同。

根据本发明中的表达调节区的一个优选的实施方案，提供了核酸构建 体，其包含选自下面(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:

(1)在下面(j)至(s)中的核苷酸序列的全部或者一部分:

(j)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从2911至3341的核苷 酸序列,

(k)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从5159至5381的核 苷酸序列,

(l)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从12778至13265的核 苷酸序列,

(m)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从15145至16219的 核苷酸序列,

(n)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从18019至18505的 核苷酸序列,

(o)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从19297至19778的 核苷酸序列,

(p)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21390至21792的 核苷酸序列,

(q)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从22878至23204的 核苷酸序列,

(r)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从24774至25823的 核苷酸序列,和

(s)在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从27179至27797的核 苷酸序列;

(2)能在严格条件下与(1)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，并且所 述核苷酸序列具有与每种核苷酸序列基本等同的功能;

(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、 插入或者添加了一个或者多个核苷酸，并且所述核苷酸序列具有与每种核 苷酸序列基本等同的功能;和

(4)核苷酸序列，其具有与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的 同一性，并且具有与每种核苷酸序列基本等同的功能。

根据本发明中的表达调节区的一个更优选的实施方案，提供了核酸构 建体，其包含选自下面(1)至(4)中的核苷酸序列的至少一种核苷酸序列:

(1)核苷酸序列，其包含上文提到的(j)至(s)或者(j)至(r)中的全部全 长核苷酸序列；

(2)核苷酸序列，其能在严格条件下与(1)中的核苷酸序列杂交，并且 具有与每种核苷酸序列基本等同的功能;

(3)(1)中的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列，其中缺失、取代、 插入或者添加了一个或者多个核苷酸，并且其具有与每种核苷酸序列基本 等同的功能;和

(4)核苷酸序列，其具有与(1)中的核苷酸序列的多核苷酸至少90%的 同一性，并且具有与每种核苷酸序列基本等同的功能。

作为本发明中的啶南平生物合成基因簇，可以分离待使用的来源于产 生啶南平的真菌的生物合成基因簇的全部或者一部分，优选的可以使用来 自粪生青霉PF1169菌株的在SEQ ID NO:266中显示的啶南平生物合成 基因簇的全部或者一部分，并且进一步优选地可以使用来自粪生青霉PF1169菌株的在SEQ ID NO:266中显示的全长啶南平生物合成基因簇。

在本发明中，术语“基本等同的氨基酸序列”指的是不影响多肽的活性 的氨基酸序列，尽管事实上通过取代、缺失、取代、添加或者插入改变了 一个或者多个氨基酸。优选地，通过氨基酸的取代、缺失、取代、添加或 者插入改变的氨基酸序列与改变之前的氨基酸序列等具有70%或者更多, 优选地80%或者更多,更优选地90%或者更多,还更优选地95%或 者更多,并且还更优选地98%或者更多的序列同一性。进一步地，改变 的氨基酸残基数目优选地是1至40,更优选地1至20,还更优选地1 至10,还更优选地1至8,并且最优选地1至4。

进一步地，不影响活性的改变的例子包括保守取代。术语“保守取代” 是指将优选地1至40,更优选地1至20,更优选地1至10,还更优选 地1至8,并且最优选地1至4个氨基酸残基用其它化学相似的氨基酸 残基取代，而多肽的活性基本上未改变。其例子包括将某个疏水性氨基酸 残基用另一个疏水性氨基酸残基取代的情形和将某个极性氨基酸残基用 另一个具有相同电荷的极性氨基酸残基取代的情形。能够进行此类取代的 功能类似的氨基酸是本领域公知的每一氨基酸。具体而言，非极性(疏水性) 氨基酸的例子包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸等。极性(中性)氨基酸的例子包括甘氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。带正电荷的(碱性) 氨基酸的例子包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。带负电荷的(酸性)氨基酸 的例子包括天冬氨酸、谷氨酸等。

术语，“严格条件”在本发明中指的是在杂交后在高的温度下在具有低 盐浓度的溶液中进行膜的洗涤操作的条件，本领域的技术人员能适当地确 定该条件，例如所述条件包括在具有2×SSC(1×SSC:15mM柠檬酸钠，150 mM氯化钠)和0.5%SDS的溶液中在60°C下洗涤20分钟,以及包括 在具有0.2×SSC(1×SSC:15mM柠檬酸钠，150mM氯化钠)和0.1%SDS 的溶液中在60°C下洗涤15分钟。

可以根据已知的方法进行杂交。并且，在使用商业上可获得的文库的 情况下，可以根据所附说明书中描述的方法进行杂交。

在本说明书中，对于核苷酸序列，术语“同一性”(也指的是同源性)指 待比较的序列中组成每种序列的碱基配对的程度。这时候，考虑空位的存 在和氨基酸的特征。在本说明书中显示的“同一性”的任一值可以是使用本 领域技术人员已知的同源性搜索程序计算的值。例如，在FASTA，BLAST 等中通过使用默认(起始设定)参数可以很容易计算该值。

在说明书中，核苷酸序列的“同一性”是90%或者更多,优选地95%或 者更多,更优选地98%或者更多,还更优选地99%或者更多。

在说明书中，术语“在多核苷酸中缺失、取代、插入或者添加了一个或 者多个核苷酸”指的是通过已知的方法如位点特异的诱变方法，或者在可以 天然发生的程度下取代多种核苷酸进行改变。改变的核苷酸的数目是一个 或者多个核苷酸(例如，一至几个核苷酸，或者1,2,3或者4个核苷酸)。

术语“编码与所述(每种)核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质 的核苷酸序列”指的是核苷酸序列，其编码的蛋白质与“所述(每种)核苷酸 序列编码的蛋白质”具有的等同的活性。

优选地，与在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列中的从3342至 5158的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质具有辅酶A连接酶活 性。

优选地，与在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从5382至12777 的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质具有LovB样聚酮化合物合 酶(PKS)活性。

优选地，与在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从13266至 15144的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质具有细胞色素P450加 单氧酶(1)(P450-1)活性。

优选地，与在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从16220至 18018的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质具有细胞色素P450加 单氧酶(2)(P450-2)活性。

优选地，与在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从18506至 19296的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质具有环化酶(IMP:整 合膜蛋白)活性。

优选地，与在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从19779至 21389的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质具有FAD依赖的加单 氧酶(FMO)活性。

优选地，与在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从21793至 22877的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质具有UbiA样异戊烯 转移酶(UbiAPT)活性。

优选地，与在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从23205至 24773的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质具有乙酰转移酶(AT) 活性。

优选地，与在SEQ ID NO:266中显示的核苷酸序列的从25824至 27178的核苷酸序列编码的蛋白质基本等同的蛋白质具有乙酰转移酶 -2(AT-2)活性。

“具有与每种核苷酸序列基本等同的功能的核苷酸序列”不受特别地限 制，只要它具有与“每种核苷酸序列”等同的功能，并且，例如，指的是调 节目的基因表达的功能是等同的，并且更特别地，例如启动子活性或者终 止子活性的功能是等同的。

通过进行DNA扩增或者通过进行完全化学合成可以得到上文提到的 目的基因和表达调节区，所述DNA扩增通过用来自产生啶南平的真菌的 基因组DNA或者类似物作为模板，使用基于上文提到的核苷酸序列合成 的合适的引物以PCR方法进行。

啶南平

本发明中的啶南平包括啶南平A至啶南平R,并且优选地是啶南平A, E和O，进一步优选地是啶南平A。

分离啶南平生物合成基因簇的方法

例如，通过以下的方法，可以分离啶南平生物合成基因簇。例如，提 取产生啶南平的真菌的基因组DNA并且用合适的限制酶消化，并且然后 使用粘粒载体制备由基因组DNA组成的文库。随后，基于啶南平生物合 成基因簇中含有的核苷酸序列如细胞色素P450，根据实施例12的描述合 成合适的引物。用来源于产生啶南平的真菌的基因组DNA作为模板使用 引物进行PCR方法来扩增由所述生物合成基因簇的一部分组成的DNA片 段。使用这种DNA片段作为探针，通过筛选基因组文库，可以分离啶南 平生物合成基因簇的全长或者一部分。

除上文提到的方法以外，通过将目的基因连接到在宿主中有功能的表 达调节区可以取得本发明中的在宿主中表达的啶南平生物合成基因簇。可 以使用在目的基因和表达调节区之间任何方式的连接，只要在宿主中表达 目的基因。例如，有用于将目的基因上游的启动子有效连接到它的终止子 下游的方法。通过本发明，根据已知的方法可以进行目的基因和表达调节 区之间的连接。

标记基因

根据本发明的标记基因是在核酸构建体中以一种状态排列的基因，在 所述状态中，它可以在宿主中与上文描述的啶南平生物合成基因簇一起表 达，并且取决于筛选转化体的方法适当地被筛选。例如，可以使用编码药 物抗性的基因和补充营养缺陷型的基因。药物抗性基因的实例包括针对药 物如越霉素、潮霉素、苯菌灵、寡霉素、G418、博来霉素、双丙氨酰膦、 灭瘟素、腐草霉素、膦丝菌素、氨苄青霉素或卡那霉素的基因，优选地越 霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。补充营养缺陷型的基因的实例包括如 amdS,pyrG,argB,trpC,niaD,TRP1,LEU2或者URA3。

通过例如和待使用的啶南平生物合成基因簇相同的方法可以分离、扩 增或者合成这些标记基因。

核酸构建体

本发明中的核酸构建体可以是任何形式的，只要可以将它引入到宿主 基因中，并且当被引入到宿主中时，可以使用优选整合到载体中的形式。 因此，根据本发明优选的实施方案，提供了包含本发明的核酸构建体的重 组载体。

通过将啶南平生物合成基因簇和在宿主中表达的标记基因引入到适 当的载体中可以制备根据本发明的重组载体。

作为构建重组载体的步骤和方法，可以使用基因工程领域通常使用的 步骤和方法。

作为本发明中可以使用的载体，可以使用任何载体，只要它能被引入 到宿主中。所述载体的实例包括粘粒、噬菌体载体、基于pUC的质粒、基 于pBluescript的质粒、pBR322质粒等等。

宿主

可以用于本发明中的宿主没有特别的限制，只要通过引入本发明的核 酸构建体，它是能产生啶南平的宿主。优选地是能产生啶南平的微生物， 甚至在没有引入本发明的核酸构建体的状态下。更优选地是丝状真菌，还 更优选地属于青霉属(Penicillium)、正青霉属(Eupenicillium)或曲霉属 (Aspergillus)，进一步更优选地是粪生青霉、灰黄青霉、网状孢正青霉或者 烟曲霉。在它们之中，粪生青霉是优选的，粪生青霉PF1169菌株是最优 选的。

转化体的制备

根据本发明，通过使用上文提到的核酸构建体转化上文提到的宿主， 提供引入了啶南平生物合成基因簇的转化体。在宿主中引入核酸构建体的 方法不受特别的限制，只要实现宿主中的引入。例如，通过以下的方法使 用重组载体可以将核酸构建体引入到宿主中。

使用重组载体将核酸构建体引入到宿主中可以根据常规方法进行。引 入方法的实例包括电穿孔方法、聚乙二醇方法、农杆菌方法、锂方法、氯 化钙方法等等。选择对宿主细胞有效的方法。在使用粪生青霉作为宿主的 情况下，优选地是聚乙二醇方法。

根据本发明的优选的实施方案，提供了转化体，其通过将质粒 pPYRI02引入到宿主中(用质粒pPYRI02转化的大肠杆菌保藏号：FERM BP-11203)或者将粘粒pPYRI07引入到宿主中(用粘粒pPYRI07转化的大 肠杆菌保藏号：FERM BP-11316)得到。

培养转化体和生产啶南平

根据本发明，提供了用于生产啶南平的方法，包括培养上文制备的转 化体并且从培养物中收集啶南平，优选地大规模生产啶南平的方法。

根据常规方法，通过适当地选择培养基、培养条件等等可以进行转化 体的培养。作为培养基，可以使用通常使用的组分，例如碳源、葡萄糖、 蔗糖、纤维素、淀粉糖浆、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动物和植物油等等。 并且，作为氮源，可以使用大豆粉、麦胚、药物介质(pharmamedia)、玉 米浆、棉籽粉、肉汤、蛋白胨、多蛋白胨(polypeptone)、麦芽提取物、酵 母提取物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等等。除此以外，如果需要，加入钠、 钾、钙、镁、钴、氯、磷酸、硫酸，或者可以产生其他离子的无机盐，如 氯化钾、碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸锰或 硫酸铜是有效的。并且，如果需要，可以添加微量营养素，如各种维生素 如硫胺素(盐酸硫胺素等)，氨基酸，如谷氨酸(谷氨酸钠等)或天冬酰胺(DL- 天冬酰胺等)，或核苷酸，或者选择试剂如抗生素。进一步的，可以适当地 添加帮助真菌生长并且促进啶南平产生的有机物或无机物。

作为培养的方法，可以使用在需氧条件下的震荡培养、搅拌下鼓泡培 养、或者深部需氧培养，并且，尤其搅拌下鼓泡培养是最适当的。培养基 的pH例如是约pH6至pH8。培养最适当的温度是15°C至40°C，在很 多情况下，在26°C至37°C左右进行生长。啶南平的产生是不同的，取决 于培养基和培养条件或者使用的宿主。在用于培养的任一方法中，积累物 通常在2天至25天内达到它的峰值。

当培养过程中啶南平的量达到峰值的时侯，培养终止，并且从培养物 中收集啶南平，如果需要，分离和纯化啶南平。在产生多种类型的啶南平 的情况下，可以同时收集多种类型的啶南平，如果需要，进行分离和纯化； 或者可以分别收集多种类型的啶南平，如果需要，进行分离和纯化。

实施例

本发明将通过下列实施例进一步具体阐述本发明，这些实施例不用于 限制本发明。

实施例1：制备粪生青霉PF1169株的基因组DNA

将无菌NB培养基(500ml)置于三角瓶(1L)。将在1/2CMMY琼脂培 养基中28°C预培养4天的粪生青霉PF1169株(Journal of Technical  Disclosure No.500997/2008(专利文献4))加入上述培养基，并在28°C液体 培养4天。用Miracloth过滤，获得5g真菌细胞。从这些真菌细胞根据 基因组DNA纯化试剂盒Genomic-tip 100/G(Qiagen K.K.制)所附的手册获 得30μg基因组DNA。

实施例2：用于扩增聚酮化合物合酶(PKS)的简并引物和其扩增片段

基于多种丝状真菌聚酮化合物合酶中保守的氨基酸序列，设计并合成 下列引物作为简并引物用于扩增：

LC1：GAYCCIMGITTYTTYAAYATG(SEQ ID NO：1)

LC2c：GTICCIGTICCRTGCATYTC(SEQ ID NO：2)

(其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，I=肌苷)。

使用这些简并引物，将实施例1中制备的基因组DNA和ExTaq聚合 酶(Takara Bio Inc.制)按照所附的手册进行反应。检测到约700bp的扩增 片段(图1)。进一步地，分析上述扩增片段来特定其内部的500bp序列(SEQ ID NO：3)。

实施例3：基因组DNA的大量测序和氨基酸序列同源性检索

将实施例1中获得的粪生青霉PF1169株的基因组DNA进行大量测 序和氨基酸序列的同源性检索。具体地，将基因组DNA的50μg份进行预 处理并随后供Roche 454FLX DNA测序仪测序，获得了103000个约250bp 片段序列(总计49Mb的序列)。

对于这些序列，作为聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶中已知的序列， 选择下列5种序列(衍生自聚酮化合物合酶：烟曲霉PKS 2146 a.a.和灰黄 青霉(Penicillium(P.)griseofluvum)6-甲基水杨酸(methylsalycilic acid)合酶 1744a.a.；异戊烯转移酶：烟曲霉异戊烯转移酶，烟曲霉异戊烯转移酶(4- 羟基苯甲酸八异戊烯转移酶)和马尼菲青霉(Penicillium(P.)marneffei)异戊 烯转移酶)，并用同源序列检索软件blastx进行检索，由此分别获得89个、 86个、2个、1个和3个同源序列(见表2)。进一步地，从烟曲霉PKS 2146 a.a.和灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.的同源序列，分别获得19个和 23个叠连序列(烟曲霉PKS 2146a.a.的叠连序列：SEQ ID NO：179至197； 灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.的叠连序列：SEQ ID NO：198至220) (见表2)。

表2

实施例4：基因组DNA的PCR扩增

从实施例3获得的blastx的检索结果，对于聚酮化合物合酶，合成了 SEQ ID NO：227至252所示的13种引物对。类似地，对于异戊烯转移酶， 合成了SEQ ID NO：253至262所示的5种引物对。当使用这些引物对基 因组DNA进行PCR时，对所有的引物对观察到了预期大小的扩增片段(见 图1和图2)。

实施例5：构建噬菌体基因组文库

使用λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit(Takara Bio Inc.制，目录号 69242-3)按照所附的手册构建粪生青霉PF1169株的λ噬菌体基因组文库。 即，用限制性酶Sau3A1部分消化基因组DNA。将约20kb的DNA片段 (0.5μg)连接至试剂盒所附的0.5μgλBlueSTAR DNA。将该连接溶液使用 Lambda INN Packaging试剂盒(Nippon Gene Co.，Ltd.制)，根据该试剂盒 所附的手册进行体外包装，获得1ml溶液。将该经包装的噬菌体溶液(10μl) 感染100μl大肠杆菌ER1647株，并在噬斑形成培养基上37°C过夜培养， 从而获得约500个克隆的噬斑。因此，构建了包含通过克隆感染导入了10 至20kb粪生青霉PF1169株的基因组DNA的噬菌体约50000个克隆的基 因组文库。

实施例6：自噬菌体文库的筛选

从实施例5制备的噬菌体文库的10000个克隆，使用自上述制备的 LC1-LC2c引物对扩增的PCR产物作为探针通过噬斑杂交进行初步筛选。 对于探针的标记和检测，使用AlkPhos Direct Labelling and Detection  System with CDP-Star(GE Healthcare制，目录号RPN3690)。上述杂交按 照所附的手册进行。

通过初步筛选后，留下6个克隆作为候补。进一步地，作为通过噬斑 杂交进行的二次筛选的结果，获得了4个克隆。将这些阳性克隆感染大肠 杆菌BM25.8株，并按照所附的手册将噬菌体变换为质粒，从而获得了含 有目的区域的4种质粒。

实施例7：制备F粘粒基因组文库

根据CopyControl Fosmid Library Production Kit(EPICENTRE制， 目录号CCFOS110)所附的手册，构建粪生青霉PF1169株的基因组文库。 即，将约40kb基因组DNA 0.25μg的DNA片段末端平端化后掺入F粘 粒载体pCCFOS(Epicentre制)。将该连接溶液使用该试剂盒所附的 MaxPlax Lambda Packaging Extract，根据该试剂盒所附的手册进行体外 包装。将该经包装的病毒溶液10μl感染100μl大肠杆菌EPI300^TM-T1^R株， 并在含有氯霉素的培养基上37°C过夜培养并选择，从而获得约300个克 隆的菌落。因此，获得了通过感染导入了40kb粪生青霉PF1169株的基 因组DNA的F粘粒约30000个克隆。将它们以每孔约50个克隆注入96 孔板。从而构建了包含96个池的约4800个克隆的基因组文库。

实施例8：筛选F粘粒文库

按照F粘粒所附的手册，分别从实施例7制备的文库的96个池制备 质粒DNA。使用实施例2中合成的用于聚酮化合物合酶扩增的简并引物， 对96个池的这些质粒DNA样本实施PCR。结果，从9个池扩增了约700 bp的DNA片段。进一步地，从所述阳性池制备含有约300个或以上克隆 的集落的平皿，并再次通过菌落杂交筛选。结果，使用LC1-LC2c引物对， 自约4800个克隆获得了9种F粘粒。

实施例9：基因组DNA的大量测序和氨基酸序列同源性检索

将实施例1中获得的粪生青霉PF1169株的基因组DNA进行大量测 序和氨基酸序列的同源性检索。具体地，将基因组DNA的50μg份进行预 处理并随后供Roche 454FLX DNA测序仪测序，获得了平均重叠群长度 19.621kb的1405个片段序列(总碱基长27.568160Mb的序列)。

对于这些序列，作为聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶中已知的序列， 选择下列5种序列(衍生自聚酮化合物合酶：灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶 1744a.a.(P22367)和烟曲霉PKS 2146a.a.(Q4WZA8)；以及异戊烯转移酶： 马尼菲青霉异戊烯转移酶(Q0MRO8)、烟曲霉异戊烯转移酶(Q4WBI5)和烟 曲霉异戊烯转移酶(4-羟基苯甲酸八异戊烯转移酶)(Q4WLD0))，并用同源 序列检索软件blastx进行检索，由此分别获得22个(P22367)、21个 (Q4WZA8)、2个(Q0MRO8)、3个(Q4WBI5)和3个(Q4WLD0)同源序列。

实施例10：F粘粒文库筛选和簇集基因的序列分析

按照F粘粒试剂盒(EPICENTRE制，CopyControl Fosmid Library Production Kit)所附的手册，从实施例7制备的文库的96个池分别制备各 质粒DNA。基于Roche 454FLX DNA测序仪确定的碱基序列，进行氨基 酸序列的同源性检索，以检索与聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶邻近的区 域。基于所获得的区域的异戊烯转移酶碱基序列，合成能够扩增400bp DNA片段的引物对(No.27)。使用该引物，对48个池的质粒DNA样本进 行PCR。结果，从11个池扩增了约400bp的预期DNA片段(SEQ ID NO： 263)(见图3)。进一步地，从该阳性池中的6个池制备含有约300个或以上 克隆的集落的平皿，并再次通过菌落杂交筛选。结果，使用27F+27R引 物对(27F引物：SEQ ID NO：264，27R引物：SEQ ID NO：265)，自 约4800个克隆获得了4种F粘粒。其中之一命名为pCC1-PP1，并且确定 了插入片段的全序列(SEQ ID NO：266)。

将获得的pCC1-PP1转化进入大肠杆菌EPI300^TM-T1^R菌株中(F黏粒 试剂盒附带)，从而得到大肠杆菌EPI300^TM-T1^R菌株/pCC1-PP1(保藏号 FERM BP-11133)。

当在上文提到的SEQ ID NO:266序列和辅酶A连接酶；LovB样聚酮 化合物合酶(PKS)；为羟化酶的细胞色素P450加单氧酶、环化酶和FAD 依赖的加单氧酶(FMO)；UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)；为乙酰转移 酶的乙酰转移酶(AT)、乙酰转移酶-2(AT-2)；和阳离子转运腺苷三磷酸酶 (上文提到的酶全部来源于烟曲霉Af293菌株)中的每种之间进行同源性搜 索时，在任一搜索中可见70%或者以上的高同源性。

SEQ ID NO：266的核苷酸3342至5158编码CoA连接酶，其相应 的多肽显示为SEQ ID NO：267所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的 核苷酸5382至12777编码LovB样聚酮化合物合酶(PKS)，其相应的多肽 显示为SEQ ID NO：268所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸 13266至15144(此后将该核苷酸序列(P450-1)编码的蛋白质称为细胞色素 P450单加氧酶(1))和核苷酸16220至18018(此后将该核苷酸序列(P450-2) 编码的蛋白质称为细胞色素P450单加氧酶(2))编码细胞色素P450单加氧 酶，相应的多肽分别显示为SEQ ID NO：269和270所示的氨基酸序列； SEQ ID NO:266的核苷酸18506至19296编码环化酶，其相应的多肽显示 为SEQ ID NO：271所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸19779 至21389编码FAD依赖的单加氧酶(FMO)，其相应的多肽显示为SEQ ID  NO:272所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸21793至22877 编码UbiA样异戊烯转移酶(UbiAPT)，其相应的多肽显示为SEQ ID  NO:273所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸23205至24773 编码乙酰转移酶(AT)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：274所示的氨基 酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸25824至27178编码乙酰转移酶 -2(AT-2)，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：275所示的氨基酸序列;和SEQ  ID NO：266的核苷酸27798至31855编码转运阳离子的ATPase，其相应 的多肽显示为SEQ ID NO：276所示的氨基酸序列。

实施例11：基因组DNA文库的制备

按照以下步骤构建能转化真菌的粘粒载体pMFCOS1。制备来自质粒 pMKD01(日本专利号3593134)的含有越霉素抗性基因的约3.0kb XbaI的 片段并且使用T4聚合酶形成平端，所述抗性基因是真菌转化的标记基因。 将该片段连接到商业上可获得的被限制酶SmaI和StuI双消化的粘粒载 体Super Cos1(Stratagene)上，从而得到粘粒载体pMFCOS1。

然后，将生产啶南平A的真菌粪生青霉PF1169菌株(Journal of  Technical Disclosure编号.500997/2008(专利文献4))接种到液体培养基 (3%甘油,0.8%营养肉汤,0.3%麦芽汁,0.2%酵母提取物,0.1%谷氨酸 钠,pH 7.0)中并且在26°C培养48小时。培养完成后，通过离心收集真菌 细胞并且从这些真菌细胞中制备染色体DNA。用限制酶Sau3AI部分地消 化染色体DNA后，进行碱性磷酸酶处理来使DNA的末端去磷酸。将DNA 片段与粘粒载体pMFCOS1连接，所述pMFCOS1提前被限制酶XbaI消 化，通过碱性磷酸酶处理被去磷酸化，并且进一步地被限制酶BamHI消 化以得到重组的粘粒载体。使用Epicentre生产的MaxPlaxλ包装提取 物(MAXPLAX Lambda Packaging Extract)进行重组粘粒载体的体外包装 并且感染大肠杆菌XLI-Blue MRA，从而得到基因组DNA文库。

实施例12：筛选基因组DNA文库

作为筛选实施例1中制备的基因组DNA文库的探针，确定使用细胞 色素P450基因，其是啶南平A生物合成基因中的一种。进一步地，通过 如下所示的PCR制备探针。

用实施例1中显示的基因组DNA作为模板，使用寡DNA 5'-ATGATCGAGCTCAAAGATGC-3'(SEQ ID NO:277)和 5'-CTTCTTTCCAGTCAATACCT-3'(SEQ ID NO:278)作为引物进行 PCR。用Prime STAR HS DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)作为DNA聚合 酶，使用PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9700进行PCR。反应 溶液含有0.5μl(等同于0.5μg的量)的基因组DNA,25μl酶附带的2-倍浓 度的反应缓冲液,4μl的2.5mM dNTP溶液,0.5μl调整到100pmol/μl 的浓度的上文提到的每种引物，0.5μl的酶，并且加入19μl无菌水来达到 50μl的终体积。在94°C预处理5分钟后，反应通过在98°C温育10秒， 50°C温育5秒，并且72°C温育2分钟重复25个循环进行。反应完成后， 将反应混合物的一部分进行琼脂糖凝胶电泳，结果证实特异地扩增了约1.8 kbp的DNA片段。因此，用苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)提取剩余的反 应溶液，紧接着用乙醇沉淀。将沉淀物重新溶解在无菌水中并且进行琼脂 糖凝胶电泳。根据常规方法切除约1.8kbp的条带来回收DNA片段。

通过使用ECL Direct DNA/RNA Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech Inc.生产)，用上文提到的DNA片段作为探 针进行菌落杂交，并且筛选了大约5000个菌落。得到了多个阳性克隆。从 这些克隆中的一个，分离了质粒pPYRI02。而且，分析了这种质粒pPYRI02 插入片段末端的碱基序列，并且结果证实它含有1至25000个SEQ ID  NO:266和它的上游区域。

实施例13：制备转化体

将产生啶南平的真菌粪生青霉PF1169菌株接种到液体培养基(3％甘 油，0.8％营养肉汤，0.3％的麦芽汁，0.2％的酵母提取物，0.1％的谷氨酸 钠，2％的甘氨酸，pH值7.0)中并且在26°C培养24小时，并且之后通过 离心收集真菌细胞。用1.0M KCl洗涤获得的真菌细胞并且在用0.45μm 滤器过滤的10mL的原生质体形成酶溶液(3mg/mLβ-葡糖醛酸糖苷酶， 1mg/mL几丁质酶，3mg/mL裂解酶，1.0M KCl)中悬浮所述真菌细胞。 将悬浮液在30°C震荡60至90分钟并且将菌丝转化到原生质体中。将该 悬浮液过滤并且离心收集原生质体，用SUTC缓冲液(0.5mol/L蔗糖，10 mM氯化钙，10mM tris盐酸[pH7.5])洗涤所述原生质体。

在1mL SUTC缓冲液中悬浮制备的原生质体。对于100μL悬浮液， 加入10μg pPYRI02DNA溶液(20μL)，并且让混合物在冰上保持5分钟。 然后，加入400μLPEG溶液((60％PEG4000，10mM氯化钙，10mM tris 盐酸[pH7.5])并且将混合物在冰上保持5分钟。然后，加入400μL PEG溶 液((60％PEG4000，10mM氯化钙，10mM tris盐酸[pH7.5])，混合并且在 冰上保持20分钟。进一步地，加入10mL SUTC缓冲液并且离心收集转 化到原生质体的真菌细胞。在1mL SUTC缓冲液中悬浮得到的真菌细胞， 并且然后在4000rpm离心5分钟，最终悬浮在100μL SUTC缓冲液中。

将进行上述处理的真菌细胞覆盖在含有200μg/mL的潮霉素B和1.0 M的蔗糖的马铃薯葡萄糖琼脂和含有1.0M的蔗糖的软的马铃薯葡萄糖琼 脂上。在26°C培养4天后，将形成的菌落作为转化体使用。

实施例14：转化体的培养和培养基中啶南平的定量

为培养转化体，使用由2.0％的淀粉，1.0％的葡萄糖，0.5％多蛋白胨， 0.6％的麦胚，0.3％的酵母提取物，0.2％豆饼和0.2％的碳酸钙组成的培 养基(灭菌前pH值7.0)作为种子培养基。而且，使用由10.0％的葡萄糖， 1.3％的脱脂大豆，0.3％的谷氨酸钠，0.8％麦胚，0.125％的氯化钠，0.15％ 的碳酸钙和0.2％烟酰胺组成的培养基(灭菌前pH值7.0)作为生产培养基。

将上文提到的种子培养基(40ml)等分到在122°C灭菌20分钟的250 ml锥形瓶中。为此，用铂环收集实施例13中描述的转化体并且接种，并 且在26°C震荡培养3天。将生产培养基(20ml)等分到在122°C灭菌20 分钟的250ml锥形瓶中。为此，将0.5ml的上述种子培养溶液无菌接种， 并且在26°C震荡培养8天。将9.5ml的甲醇加入到0.5ml得到的培养溶 液中来提取啶南平。将生成物过滤，从而得到提取溶液。将10μl的提取 溶液进行HPLC分析。使用HPLC系统LC-2010C(Shimadzu Corporation) 进行HPLC分析。分析的条件如下：柱体:Inertsil ODS-34.6X 250mm,流 动相:乙腈：水=60:40,流速:1.0ml/min,柱体温度:40°C以及UV波长: 320nm。将得到的图形与啶南平的标准比较。指定了来源于啶南平的峰值。 从这些区域对啶南平定量。被定量的啶南平类似物是在本发明的真菌中产 生的啶南平A,E和O。

同时，对于是转化体的亲株的粪生青霉PF1169菌株，类似地在培养 基中进行培养和啶南平的定量。

结果，如下表3显示，已经发现转化体的啶南平的生产力比亲株高约 2.6倍，并且用不含全长的啶南平生物合成基因簇的pPYRI02转化的转化 体仍然提高了啶南平的生产力。

表3

实施例15：使用根癌农杆菌转化粪生青霉

在1/2CMMY琼脂培养基中在28°C培养粪生青霉菌株PF1169三天， 并且通过刮除回收分生孢子。通过用无菌的miracloth(Carbiochem生产, Cat No.475855)过滤得到孢子，并且用IM液体培养基((1.74g/L K₂HPO₄, 1.36g/L KH₂PO₄,0.14g/L NaCl,0.49g/L MgSO₄·7H₂O,0.10g/L CaCl₂·2H₂O,100μ/L 9mM FeSO₄,0.53g/L(NH₄)2SO₂,1.8g/L葡萄糖， 8.53g/L的MES(2-吗啉代乙磺酸)，5mL/L的甘油,pH 5.3)稀释至10³/ml 来得到粪生青霉孢子的悬浮液。

将已经引入了在附图4中显示的pBI-AnGPD-EGFP(RIKEN)的根癌农杆菌菌株EHA105接种到含有50ppm卡那霉素(Km)的IM液体培养基 中，并且在28°C培养过夜。用含有50ppm卡那霉素(Km)的IM液体培养 基稀释生成物以便在660nm的透射光吸收的范围是0.3至0.45。以 500μm的终浓度加入乙酰丁香酮(AS)，并且将生成物在28°C培养6小时 来产生农杆菌培养基。将Hybond-N+(GE Health Science生产,直径82mm, Cat No.RPN82B)放在含有50ppm Km和500μM AS的共培养琼脂培养 基(1.74g/L K₂HPO₄,1.36g/L KH₂PO₄,0.14g/L NaCl,0.49g/L MgSO₄·7H₂O,0.10g/L CaCl₂·2H₂O,100μL/L 9mM FeSO₄,0.53g/L (NH₄)₂SO₂,0.9g/L葡萄糖,8.53g/L MES(2-吗啉代乙磺酸),5mL/L甘油, 15g/L琼脂,pH 5.3)上。并且将都是通过上述方法得到的100μL粪生青霉孢子的悬浮液和100μL农杆菌培养基的混合物均匀地涂布在Hybond-N+ 上。在25°C共培养2天后，将生成物转移到含有50ppm潮霉素和25ppm 的美罗培南(Sumitomo Pharmaceuticals生产)的MM琼脂培养基(1.74g/L K₂HPO₄,1.36g/L KH₂PO₄,0.14g/L NaCl,0.49g/L MgSO₄·7H₂O,0.10g/L CaCl₂·2H₂O,100μL/L 9mM FeSO4,0.53g/L(NH4)₂SO₂,1.8g/L葡萄糖, 15g/L琼脂)中，并且培养4天。将得到的菌落转移到含有25ppm潮霉素 和25ppm的美罗培南的1/2CMMY琼脂培养基中，并且得到生长的转化 体。附图5A显示了得到的潮霉素抗性菌落和GFP荧光观察结果，从附图 5A看出，在大部分得到的潮霉素抗性菌落上检测到了荧光。另一方面，如 附图5B中显示，在对照(没有农杆菌感染的粪生青霉菌株PF1169)上检测 不到荧光。通过潮霉素抗性菌落的基因组PCR证实了潮霉素抗性基因和 GFP基因的引入，没有显示这些数据。

实施例16：基因组DNA文库的筛选2

在实施例12中得到的质粒pPYRI02的插入片段末端的碱基序列是 SEQ ID NO:266的从1至25000的区域和它的上游区域的序列。为得到 全长的啶南平生物合成基因簇(其中进一步添加了啶南平生物合成基因簇 的下游区域)，通过与单独克隆到上文描述的pPYI02的插入片段中的啶南 平生物合成基因簇的下游区域连接构建全长的生物合成基因簇。

在构建全长的生物合成基因簇的方法中，将pPYRI02中不含有的啶南 平A生物合成基因O-乙酰转移酶酶基因用作探针，从实施例11产生的基 因组DNA文库中克隆了基因簇的下游区域。

以实施例12中相同的条件进行PCR，只是将实施例11中描述的基因 组DNA用作模板，并且将5’-ATGGATTCCCTATTGACGAG-3’(SEQ ID  NO:279)和5’-TTAAATCTCCCCACCAACCG-3’(SEQ ID NO:280)用作 引物，用于扩增用作探针的DNA片段。

通过使用ECL Direct DNA/RNA Labeling and Detection System，使用 上文提到的DNA片段作为探针进行菌落杂交来筛选约5000个菌落。得到 了多个阳性克隆。从这些克隆中的一个，分离了质粒pPYRI03。该克隆的 PCR分析已经证实它足够地具有生物合成基因簇的下游区域，并且在上游 区域方面，它具有细胞色素P450加单氧酶区域并且不含腺苷酸形成酶(辅 酶A连接酶)区域。

通过使用在实施例12中得到的pPYRI02插入片段和上文描述的 pPYRI03的插入片段构建了具有全长的生物合成基因簇的粘粒。每种粘粒 碱基序列的分析可以显示基因簇上的限制酶位点。进一步地，已经发现通 过将用作生物合成基因簇的上游区域的pPYRI02的BsiWI片段(约 20.2kb)连接到用作下游区域的pPYRI03的BsiWI-Aflll片段(约4.9kb)， 可以构建全长的生物合成基因簇。

用SphI消化用于在[Bierman,M.等人.“Gene”,(Netherlands)1992, 116,p43-49]中描述的放线菌中的接合转移的质粒pSET152，用T4DNA聚 合酶使其形成平端，并且连接到HindIII接头(5’-CCCAAGCTTGGG-3’ (SEQ ID NO:281),Takara Shuzo生产)上来构建质粒pSET153。为将 pSET153的多克隆位点改变成HindIII-NotI-BsiWI-Aflll-NotI-EcoRI，将 合成的寡核苷酸Hin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-1 (5’-AGCTTGCGGCCGCGTACGCTTAAGGCGGCCGCG-3’)(SEQ ID  NO:282)和Hin-Not-Bsi-Afl-Not-Eco-2(5’-AATTCGCGGCCGCCTTAAG  CGTACGCGGCCGCA-3’)(SEQ ID NO:283)退火，并且然后连接到用 HindIII和EcoRI双消化的pSET153上来构建质粒pSET201。将来源于 pPYRI03的约4.9kb的BsiWI-Aflll片段插入到pSET201的BsiWI-Aflll位点以得到质粒pPYRI05。将来源于pPYRI02的约20.2kb的BsiWI片段 插入到pPYRI05的BsiWI位点，并且筛选克隆以得到质粒pPYRI06，在 所述克隆中以天然的生物合成基因簇相同方向插入了BsiWI片段。由于含 有全长的生物合成基因簇的质粒pPYRI06没有用于真菌转化的标记，将插 入的片段插入到粘粒载体pMFCOS1中。更具体地，将来源于pPYRI02 的约8.5kb的粘粒载体区域的NotI片段与来源于pPYRI06的约25.1kb的 NotI片段连接来得到粘粒pPYRI07(翻译区:SEQ ID NO:284,非翻译区: SEQ ID NO:285)。pPYRI07是具有全长的生物合成基因簇，并且也具有用 于真菌转化的标记基因的粘粒。

pPYRI07的插入片段末端的碱基序列的分析已经证实pPYRI07含有 SEQ ID NO:266的从第2446至第27505个碱基的区域和具有载体区域的 碱基序列的上游区域，并且pPYRI07含有全长的啶南平生物合成基因簇。

实施例17：使用pPYRI07制备转化体

按照实施例13中相同的条件制备转化体，除了使用实施例16中得到 的pPYRI07。

实施例18：培养转化体并且对培养基中的啶南平定量

培养实施例17中取得的转化体和对培养基中的啶南平定量的方法与 实施例14中描述的方法相同。被定量的啶南平类似物是啶南平A,E和 O，它们由本发明真菌产生。同时，以相同的方式培养转化体的亲株—— 粪生青霉菌株PF1169，并且对培养基中的啶南平定量。

结果，如下表4显示，转化体的啶南平的生产力比亲株高了3.6倍。 结果已经显示全长的啶南平生物合成基因簇的引入提高了粪生青霉菌株 PF1169的生产力。

表4

实施例19：使用粪生青霉制备转化体

为证实全长的啶南平生物合成基因簇的引入也提高了除了粪生青霉菌株PF1169以外的粪生青霉菌株的生产力，转化了粪生青霉菌株 ATCC58615(见Studies in Mycology(2004),49,p84-85)。

按照实施例13中相同的方式制备转化体，除了使用实施例16中得到 的pPYRI07。

实施例20:培养转化体并且对培养基中的啶南平定量

培养实施例19中取得的转化体和对培养基中的啶南平定量的方法与 实施例14中描述的方法相同，只是培养时间是4天。被定量的啶南平类似 物是啶南平A,E和O，它们由本发明真菌产生。同时，以相同的方式培 养转化体的亲株——粪生青霉菌株ATCC58615，并且对培养基中的啶南 平定量。

结果，如下表5显示，转化体的啶南平的生产力比亲株高了2.5倍。 结果已经显示全长的啶南平生物合成基因簇的引入也提高了除粪生青霉 菌株PF1169以外的粪生青霉菌株的生产力。也已经发现粪生青霉菌株 PF1169比粪生青霉菌株ATCC58615提高的生产力更多。

表5

保藏号

FERM BP-11133

FERM BP-11203

FERM BP-11316