气孔增加剂、多肽、植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法以及植物产率的增加方法

技术领域

本发明涉及气孔增加剂、多肽、植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法以及 植物产率的增加方法。更详细地说，本发明涉及对于植物的二氧化碳吸收量增加等有 用的气孔增加剂、多肽、植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法；以及对于植物 产量的提高等有用的植物产率的增加方法。

背景技术

叶中气孔的产生受到受体样蛋白质[TOO MANY MOUTH；下文记为“TMM”] 和ERECTA家族受体型磷酸化酶(ER、ERL1和ERL2)的负调节(例如，参照非专利文 献1和2)。

表皮模式因子[EPIDERMAL PATTERNING FACTOR(下文记为“EPF”)]1和EPF2 是可能与上述受体结合的2个配体，其作为负信号传递因子，在气孔产生中对不同的 步骤具有影响(例如参照非专利文献3～5)。另外，对于作为其它负调节因子的枯草杆 菌蛋白酶型蛋白酶[气孔密度和分布相关酶1(STOMATAL DENSITY AND  DISTRIBUTION 1)；下文记为“SDD1”]，据报道其依赖于TMM发挥功能(例如， 参见非专利文献6)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Nadeau,J.A.& Sack,F.D.Control of stomatal distribution on the  Arabidopsis leaf surface.Science 296,1697-1700(2002)

非专利文献2：Shpak,E.D.,McAbee,J.M.,Pillitteri,L.J.& Torii,K.U.Stomatal  patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.Science 309, 290-293(2005)

非专利文献3：Hara,K.,Kajita,R.,Torii,K.U.,Bergmann,D.C.& Kakimoto,T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rules.Genes Dev. 21,1720-1725(2007)

非专利文献4：Hunt,L.& Gray,J.E.The signaling peptide EPF2 controls  asymmetric cell divisions during stomatal development.Curr.Biol.19,864-869(2009)

非专利文献5：Hara,K.et al.Epidermal cell density is autoregulated via a secretory  peptide,EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.Plant Cell  Physiol.50,1019-1031(2009)

非专利文献6：Berger,D.& Altmann,T.Asubtilisin-like serine protease involved in  the regulation of stomatal density and distribution in Arabidopsis thaliana.Genes Dev.14, 1119-1131(2000)

发明内容

但是，对于能够对植物中的气孔发育进行正调节、增加植物中的气孔数和/或气 孔密度的信号传递因子，本发明人目前尚未发现有具体记载的文献。

本发明是鉴于上述现有技术而进行的，其目的在于提供可增加植物中的气孔数和 /或气孔密度的气孔增加剂、多肽以及植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法。本 发明的目的还在于提供可简便地增加植物产率的植物产率增加方法。

即，本发明涉及下述要点：

(1)一种气孔增加剂，其含有使植物中的气孔数和/或气孔密度增加的化合物；

(2)如上述(1)所述的气孔增加剂，其中，所述化合物为由选自由下述氨基酸序列 组成的组中的氨基酸序列构成的多肽：

(I)序列编号6所示的氨基酸序列；

(II)序列编号6中具有一个或数个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入的氨基 酸序列，该氨基酸序列构成的多肽至少具有对植物中的气孔形成呈正调节的性质；

(III)相对于序列编号6所示氨基酸序列的序列同一性为64%以上、且所编码的多 肽至少具有对植物中的气孔形成呈正调节的性质的氨基酸序列，所述序列同一性是在 Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1、expect value 10、wordsize 3的条件下通过 BLAST算法进行比对而计算出的；以及

(IV)由下述核酸编码的氨基酸序列，该氨基酸序列所编码的多肽至少具有对植物 中的气孔形成呈正调节的性质，所述核酸与编码序列编号6所示氨基酸序列的核酸的 互补核酸链在严格条件下杂交；

(3)一种多肽，其由选自由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列构成：

(I)序列编号6所示的氨基酸序列；

(II)序列编号6具有一个或数个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入的氨基酸 序列，该氨基酸序列构成的多肽至少具有对植物中的气孔形成呈正调节的性质；

(III)相对于序列编号6所示氨基酸序列的序列同一性为64%以上、且所编码的多 肽至少具有对植物中的气孔形成呈正调节的性质的氨基酸序列，所述序列同一性是在 Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1、expect value 10、wordsize 3的条件下通过 BLAST算法进行比对而计算出的；以及

(IV)由下述核酸编码的氨基酸序列，该氨基酸序列所编码的多肽至少具有对植物 中的气孔形成呈正调节的性质，所述核酸与编码序列编号6所示氨基酸序列的核酸的 互补核酸链在严格条件下杂交；

(4)一种植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法，其特征在于，使植物与上述 (1)所述的气孔增加剂接触，或者在植物中使上述(3)的多肽过量表达；

(5)如上述(4)所述的植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法，其中，所述植物 为维管束植物；

(6)一种植物，其是通过上述(4)或(5)所述的植物中的气孔数和/或气孔密度的增 加方法得到的；以及

(7)一种植物产率的增加方法，其特征在于，使植物与上述(1)所述的气孔增加剂 接触，或者在植物中使上述(3)的多肽过量表达。

利用本发明的气孔增加剂、多肽以及植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法， 发挥出了可增加植物中的气孔数和/或气孔密度这样的优异效果。从而可利用本发明 谋求植物二氧化碳吸收量的提高，因而对于大气中二氧化碳量的降低是有用的。并且， 利用本发明，可以通过二氧化碳吸收量的增大来增加植物中的碳固定量，从而可谋求 植物产率的增加等。进一步地，利用本发明的植物产率的增加方法，发挥出了可简便 地增加植物产率这样的优异效果。

附图说明

图1为表示本发明的多肽(气孔蛋白，stomagen)及其前体(气孔蛋白前体)的结构 的图。

图2为表示制备例2中得到的抗气孔蛋白抗体对气孔蛋白的特异性的研究结果的 附图代用照片。

图3(a)为表示试验例1中对野生株成熟第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干 涉图像的附图代用照片；图3(b)为表示试验例1中对气孔蛋白表达抑制株10成熟第 一叶的下表皮进行观察的结果的微分干涉图像的附图代用照片；图3(c)为表示试验例 1中对气孔蛋白过量表达株10成熟第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干涉图像 的附图代用照片。

图4为表示试验例1中对野生型、气孔蛋白表达抑制株2和气孔蛋白过量表达株 2各自的子叶、茎和果实的表皮进行观察的结果的微分干涉图像以及对花药的表皮进 行观察的结果的共聚焦显微图像的附图代用照片。

图5为表示试验例1中对气孔蛋白基因的表达模式与子叶、果实和茎各器官中的 气孔密度的关系进行研究的结果的曲线图。

图6(a)为表示试验例1中对野生型中的子叶下表皮进行观察的结果的共聚焦显微 图像的附图代用照片；并且图6(b)为表示试验例1中对气孔蛋白过量表达株10中的 子叶下表皮进行观察的结果的共聚焦显微图像的附图代用照片。

图7(a)为表示试验例1中对野生型中的第一叶表皮进行观察的结果的共聚焦显微 图像的附图代用照片；并且图7(b)为表示试验例1中对气孔蛋白过量表达pTMM：： GFP株中的第一叶表皮进行观察的结果的共聚焦显微图像的附图代用照片。

图8为表示试验例2中对发芽后第18天的pSTOMAGEN：：GUS株第9叶的横 截切片进行观察的结果的显微图像的附图代用照片。

图9(a)为表示试验例2中在叶原基中采用气孔蛋白基因的反义探针进行原位杂交 分析的结果的显微图像的附图代用照片；并且图9(b)为表示试验例2中在叶原基中使 用气孔蛋白基因的正义探针进行原位杂交分析的结果的显微图像的附图代用照片。

图10(a)为示出含有气孔蛋白基因的核酸中ami-A、ami-B和dsRNA各自的靶序 列的位置的示意图；图10(b)为表示试验例3中对野生株、气孔蛋白表达抑制株 (ami-A)、气孔蛋白表达抑制株(ami-B)和气孔蛋白表达抑制株(dsRNA)各自的成熟第一 叶下表皮进行观察的结果的微分干涉图像的附图代用照片；图10(c)为表示试验例3 中对气孔密度与气孔蛋白基因的相对表达量的关系进行研究的结果的曲线图。

图11为表示试验例4中对气孔密度与气孔蛋白基因的相对表达量的关系进行研 究的结果的曲线图。

图12为表示试验例5中对于在根、叶、茎、花芽和果实各器官中有无气孔蛋白 基因的表达进行研究的结果的电泳图的附图代用照片。

图13(a)为表示试验例6中对pSTOMAGEN：：GUS株发芽后第2天的气孔蛋白 基因的启动子表达进行分析的结果的附图代用照片，图13(b)为试验例6中对 pSTOMAGEN：：GUS株发芽后第9天的气孔蛋白基因的启动子表达进行分析的结 果的附图代用照片；并且图13(c)为表示试验例6中对pSTOMAGEN：：GUS株发芽 后第16天的气孔蛋白基因的启动子表达进行分析的结果的附图代用照片。

图14为表示试验例7中对气孔蛋白基因的表达模式与气孔密度的关系进行研究 的结果的曲线图。

图15为表示试验例8中对利用FM4-64进行了染色的气孔蛋白-Venus表达株发 芽3天后的子叶下表皮进行观察的结果的共聚焦显微图像的附图代用照片。

图16(A)为表示试验例8中对利用FM4-64进行了染色的SP-Venus表达株发芽3 天后的子叶下表皮进行观察的结果的共聚焦显微图像的附图代用照片；并且图16(B) 为表示试验例8中利用FM4-64进行了染色的Lti6b-GFP株发芽3天后的子叶下表皮 进行观察的结果的共聚焦显微图像的附图代用照片。

图17为表示实施例2中对于由气孔蛋白-Venus表达株所得到的级分使用抗气孔 蛋白抗体进行Western印迹分析的结果的附图代用照片。

图18为表示实施例2中对气孔蛋白-Venus的N末端氨基酸序列进行分析的结果 的曲线图。

图19(a)为表示实施例2中使用赖氨酰肽链内切酶通过质量分析对气孔蛋白 -Venus的N末端氨基酸序列进行分析的结果的曲线图；并且图19(b)为表示实施例2 中使用胰蛋白酶通过质量分析对气孔蛋白-Venus的N末端氨基酸序列进行分析的结 果的曲线图。

图20为表示实施例2中利用Clustal W进行的气孔蛋白在稻(Oryza  sativa(Os01g0914400))、葡萄(Vitis vinifera(AM444732))、白杨(Populus  trichocarpa(Pt02g2557))和江南卷柏(Selaginella moellendorffii(Sm084711))各植物中的 直向同源序列的多重比对结果的图。

图21为表示实施例3中对于气孔蛋白表达BY-2细胞的培养物利用抗气孔蛋白 抗体进行Western印迹分析的结果的附图代用照片。

图22为在实施例3中利用反相HPLC柱进行气孔蛋白的精制时的色谱图。

图23为表示在实施例3中对于使用了反相HPLC柱的色谱法的各级分利用 SDS-PAGE进行分析的结果的电泳图的附图代用照片。

图24为表示在实施例3中对于第10～13级分所含有的气孔蛋白的N末端氨基 酸序列利用埃德曼降解进行分析的结果的图。

图25为表示实施例3中经精制的重组气孔蛋白的电泳图的附图代用照片。

图26(a)为实施例4中未给予精制重组气孔蛋白的Lti6b-GFP表达株的子叶下表 皮的共聚焦显微图像的附图代用照片；并且图26(b)为实施例4中给予了精制重组气 孔蛋白(2μM)的Lti6b-GFP表达株的子叶下表皮的共聚焦显微图像的附图代用照片。

图27为表示实施例6中的合成气孔蛋白量与气孔密度的关系的研究结果的曲线 图。

图28(a)为试验例9中未给予精制重组气孔蛋白的spch变异株的子叶下表皮的共 聚焦显微图像的附图代用照片；图28(b)为试验例9中给予了精制重组气孔蛋白(2μM) 的spch变异株的子叶下表皮的共聚焦显微图像的附图代用照片；图28(c)为试验例9 中给予了精制重组气孔蛋白(2μM)的野生株的子叶下表皮的共聚焦显微图像的附图代 用照片；图28(d)为表示试验例9中对spch变异株的子叶下表皮进行观察的结果的微 分干涉图像的附图代用照片；图28(e)为表示试验例9中对气孔蛋白过量表达spch变 异株的子叶下表皮进行观察的结果的微分干涉图像的附图代用照片；图28(f)为表示 试验例9中对气孔蛋白过量表达株的子叶下表皮进行观察的结果的微分干涉图像的 附图代用照片。

图29(a)为表示试验例10中的植物体种类与茎中气孔密度的关系的研究结果的曲 线图；图29(b)为表示试验例10中的植物体种类与叶中气孔密度的关系的研究结果的 曲线图。

图30(A)为表示试验例10中对野生株、气孔蛋白表达抑制株、气孔蛋白过量表 达株、tmm变异株、气孔蛋白表达抑制tmm变异株和气孔蛋白过量表达tmm变异株 各株的第一叶下表皮进行观察的结果的微分干涉图像的附图代用照片；图30(B)为表 示试验例10中对野生株、气孔蛋白表达抑制株、气孔蛋白过量表达株、tmm变异株、 气孔蛋白表达抑制tmm变异株和气孔蛋白过量表达tmm变异株各株的茎进行观察的 结果的微分干涉图像的附图代用照片。

图31为表示试验例11中对植物体种类与气孔密度的关系进行研究的结果的曲线 图。

图32为表示试验例11中对植物体种类与非气孔细胞密度的关系进行研究的结果 的曲线图。

图33为表示试验例11中对植物体成熟第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干 涉图像的附图代用照片。

图34为表示试验例12中对气孔蛋白基因的表达模式与光合成速度的关系进行研 究的结果的曲线图。

图35为表示试验例12中对气孔蛋白基因的表达模式与气孔导度的关系进行研究 的结果的曲线图。

图36为表示试验例13中对植物体种类与气孔密度的关系进行研究的结果的曲线 图。

图37为表示试验例13中对气孔蛋白过量表达大豆的叶进行观察的结果的微分干 涉图像的附图代用照片。

图38为表示试验例13中对大豆(Kariyutaka，日本大豆品种)[野生株]的叶进行观 察的结果的微分干涉图像的附图代用照片。

图39(a)表示试验例14中给予了合成气孔蛋白的稻的第二叶下表皮的微分干涉显 微图像的附图代用照片；并且图39(b)表示试验例14中未给予合成气孔蛋白的稻的第 二叶下表皮的微分干涉显微图像的附图代用照片。

图40为表示实施例8中对气孔蛋白浓度与气孔密度的关系进行研究的结果的曲 线图。

图41为试验例15中对野生株或气孔蛋白表达抑制株所摄取的¹¹CO₂进行测定的 结果的附图代用照片。

图42为表示试验例16中对试样种类与气孔密度的关系进行研究的结果的曲线 图。

具体实施方式

1.本发明的气孔增加剂和本发明的多肽

本发明的气孔增加剂的特征在于，其含有使植物中的气孔数和/或气孔密度增加 的化合物。利用该气孔增加剂，可使未分化的表皮细胞分化为构成气孔的保卫细胞， 因而可增加植物中的气孔数和/或气孔密度。此处，所谓“植物中的气孔数增加”指 的是至少多于野生型植物中的气孔数的情况，所谓“植物中的气孔密度增加”指的是 具有高于野生型植物中的气孔密度的密度的情况。气孔数和气孔密度的测定例如可通 过利用显微镜进行观察等来进行。

本发明人发现，通过在植物中使由序列编号6所示氨基酸序列构成的多肽过量表 达、或对植物给予上述多肽，可使植物中的气孔增加，该多肽在表皮细胞的气孔形成 中作为细胞间正向信号传递因子而发挥作用。本发明人还发现，该多肽的前体在内部 的叶肉细胞中的表达多于在气孔发育的表皮细胞中的表达，通过将信号肽序列和前肽 序列切断，与作为负调节因子的EPF2竞争而与未分化表皮细胞的受体TMM结合， 从而可使该未分化的表皮细胞分化为保卫细胞、形成气孔。本发明基于这些见解而完 成。

作为上述化合物，可以举出例如由选自由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序 列构成的多肽、基于上述多肽的假化合物、对编码上述多肽的核酸所对应的启动子进 行正调节的物质、有助于气孔蛋白的稳定化的物质(例如为针对切断气孔蛋白的蛋白 酶的抑制剂等)等；

(I)序列编号6所示的氨基酸序列；

(II)序列编号6中具有一个或数个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入的氨基 酸序列，该氨基酸序列构成的多肽至少具有对植物中的气孔形成呈正调节的性质；

(III)相对于序列编号6所示氨基酸序列的序列同一性为64%以上、且所编码的多 肽至少具有对植物中的气孔形成呈正调节的性质的氨基酸序列，所述序列同一性是在 Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1、expect value 10、wordsize 3的条件下通过 BLAST算法进行比对而计算出的；以及

(IV)由下述核酸编码的氨基酸序列，该氨基酸序列所编码的多肽至少具有对植物 中的气孔形成呈正调节的性质，所述核酸与编码序列编号6所示氨基酸序列的核酸的 互补核酸链在严格条件下杂交。

上述化合物在是否具有所述对植物中的气孔形成呈正调节的性质例如可如下进 行评价：使待测对象化合物与幼小植物接触，进行数天生长，对所得到的植物(也称 为“处理植物”)中的气孔密度、气孔数进行测定，将该处理植物中的气孔密度、气 孔数与未接触上述化合物的植物中的气孔密度、气孔数进行比较，由此来进行评价。 此时，在处理植物中的气孔密度、气孔数比未接触上述化合物的植物中的气孔密度、 气孔数多的情况下，可以评价为上述待测对象化合物具有所述对植物中的气孔形成呈 正调节的性质。

需要说明的是，上述多肽也可以通过在植物内过量表达而对植物中的气孔形成进 行正调节。因而，本发明中也包含该多肽。

上述多肽由于具有上述氨基酸序列，因而在植物中作用于未分化表皮细胞的受体 TMM，促进由该未分化的表皮细胞分化成构成气孔的保卫细胞，能够增加植物中的 气孔密度。

在本发明中，只要表现出上述对植物中的气孔形成呈正调节的性质，则也包括由 上述(I)的序列编号6所示氨基酸序列构成的多肽的衍生体。本说明书中，该衍生体指 的是由上述(II)～(IV)中任一氨基酸序列构成的多肽。

上述(II)的氨基酸序列中，“一个或数个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入” 在序列编号6所示氨基酸序列的内部、C末端和N末端的至少任意一处具有。此处， “一个或数个”意指构成显示出上述对植物中的气孔形成呈正调节的性质的多肽的程 度的个数范围，指的是1～30个、优选为1～20个、进一步优选为1～10个、更优选 为1～3个。

另外，从充分确保上述对植物中的气孔形成呈正调节的性质的方面考虑，上述置 换优选为保守性置换。作为该保守性置换，可以举出例如特定的氨基酸残基与在疏水 性、电荷、pK、立体结构上的特征等方面发挥出类似功能的氨基酸残基(下面，在本 说明书中，也称为类似氨基酸残基)的置换等。作为上述保守性置换，更具体地说， 可以举出例如：甘氨酸残基和丙氨酸残基相互间的置换；缬氨酸残基、异亮氨酸残基 和亮氨酸残基相互间的置换；天冬氨酸残基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺 残基相互间的置换；丝氨酸残基和苏氨酸残基相互间的置换；赖氨酸残基和精氨酸残 基相互间的置换；苯基丙氨酸残基和酪氨酸残基相互间的置换等。

在上述(III)的氨基酸序列，从充分确保上述对植物中的气孔形成呈正调节的性质 的方面考虑，以在Cost to open gap 11、Cost to extend gap 1、expect value 10、wordsize 3的条件下利用BLAST算法进行比对而计算出的值计，序列同一性为64%以上、优 选为80%以上、进一步优选为95%以上、特别优选为100%。

上述(IV)中，作为所谓“严格条件”，可以举出例如下述条件等：将上述互补核 酸链与对应于上述互补核酸链的杂交对象核酸在杂交用溶液[组成：6×SSC(组成： 0.9M氯化钠、0.09M柠檬酸钠、调整为pH7.0)、0.5质量%十二烷基硫酸钠、 5×Denhardt’s溶液、100μg/ml变性鲑鱼精DNA、50体积%甲酰胺]中，在室温(作为 更严格条件在42℃以上、作为进一步严格条件在60℃以上的温度)进行10小时培养， 接下来，在例如2×SSC(作为更严格条件为0.1×SSC)的离子强度条件下，且在室温(作 为更严格条件在42℃以上、作为进一步严格条件在60℃以上的温度)进行清洗。另外， 所谓“互补核酸链”指的是与编码上述序列编号6所示氨基酸序列的核酸完全互补的 核酸。

本发明中，上述多肽只要显示出上述对植物中的气孔形成呈正调节的性质，也可 以为由上述(I)～(IV)中氨基酸序列的一部分构成的多肽。

上述多肽例如可通过肽固相合成法等化学合成法进行制造，或者可使用保持有编 码上述多肽的核酸的细胞或细菌通过生物学方法进行制造。这些之中，从可低成本且 大量制造上述多肽的方面考虑，优选上述生物学方法。

作为上述生物学方法中所用的细胞，可以举出例如在植物细胞(例如BY-2细胞等 烟草培养细胞等)、酵母细胞、大肠杆菌、昆虫细胞等适当的宿主细胞中可表达地导 入编码本发明多肽的核酸而得到的重组细胞等。在上述生物学方法中，可以通过利用 适当的培养基对该细胞进行培养来制造本发明的多肽。

作为编码上述多肽的核酸，可以举出例如编码序列编号6所示氨基酸序列的核酸 或其变异型核酸等。作为上述变异型核酸，可以举出编码上述(II)～(IV)中任意氨基酸 序列的核酸等。并且，对于上述变异型核酸来说，只要所编码的多肽显示出对植物中 的气孔形成呈正调节的性质，也可以为与由下述碱基序列构成的核酸在上述严格条件 下进行杂交的核酸，所述碱基序列与对应于序列编号6所示的氨基酸序列的碱基序列 完全互补。所述核酸可以通过电穿孔法、脂质体转染法、转染法、粒子枪法等导入到 上述宿主细胞中。

作为基于多肽的假化合物，可以举出例如作用于未分化表皮细胞的受体TMM， 使植物中的气孔数和/或气孔密度增加的化合物(其是基于上述多肽的假化合物)；等 等。需要说明的是，在本说明书中，“基于多肽的假化合物”的概念中例如包括：基 于上述多肽中有助于生理活性的部分的立体结构而设计的肽化合物或非肽化合物；由 上述多肽的一部分构成的肽等。

另外，“对编码多肽的核酸所对应的启动子进行正调节的物质”的概念中包括使 上述启动子活性增加的物质等。

本发明的气孔增加剂可以仅由上述化合物构成，也可以含有上述化合物与适当的 助剂。

本发明的气孔增加剂含有上述化合物与适当的助剂的情况下，该气孔增加剂中的 上述化合物的含量可以根据作为适用对象的植物或该气孔增加剂的用途进行适当设 定。

作为上述助剂，可以举出例如：对于适于稳定维持上述化合物所具有的上述性质 和立体结构、和/或维持植物的缓冲液；使作为该气孔增加剂适用对象的植物易于摄 取上述化合物的吸收促进剂；植物生长所用的培养基等。

对于上述缓冲液的pH，只要在将该气孔增加剂通过散布、喷雾等供给至植物的 情况下，适于稳定维持上述化合物所具有的上述性质和立体结构的范围即可，例如优 选为pH5.5～8.5、更优选为pH6～8、进一步优选为pH7.5附近。另外，在将幼小植 物浸渍在该气孔增加剂中进行供给的情况下，上述缓冲液的pH例如优选为pH5～7、 更优选为pH5.7附近。

作为上述吸收促进剂，可以举出例如具有可使上述化合物附着于叶等部位、使上 述叶等与上述化合物的接触时间变长的程度的粘度的溶剂(例如多糖类的水溶液等)； 促进上述化合物向叶内部渗透的溶剂等。

作为上述培养基，只要适于植物生长即可。

2.植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法

本发明的植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法的特征在于，使植物与上述 气孔增加剂接触，或者在植物中使上述多肽过量表达。

本发明的植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法中，一个方面是以使植物与 上述气孔增加剂接触为特征的方法(下文称为“方法1”)。由于在方法1中使用上述 气孔增加剂，因而未分化的表皮细胞被分化为构成气孔的保卫细胞，可使植物中的气 孔数和/或气孔密度增加。

在方法1中，植物与上述气孔增加剂的接触可以通过下述操作来进行：将植物浸 渍在含有上述气孔增加剂的溶液(例如，至少含有上述气孔增加剂与作为助剂的培养 基的气孔形成剂等)中；或对于植物的叶、茎、萼、花药等直接进行上述气孔增加剂 的涂布、散布、喷雾等。在方法1中，植物与上述气孔增加剂的接触可以通过上述的 简单操作来进行。

与植物接触的上述气孔增加剂的量可以根据植物中形成的气孔的量等来适宜设 定。并且，植物与上述气孔增加剂的接触时间可以根据植物的种类等来适宜设定。

作为成为该方法1的适用对象的植物，只要为具有气孔、且具有与上述气孔增加 剂中所含有的上述化合物进行结合的受体的植物即可。上述植物中，由于气孔形成效 果大而优选维管束植物。作为上述维管束植物没有特别限定，可以举出例如：大豆等 所代表的豆科植物、稻等所代表的稻科植物、拟南芥所代表的十字花科植物、湿地白 杨等所代表的杨柳科植物、江南卷柏所代表的卷柏科植物等。并且，上述植物中，由 于气孔形成效果大而优选具有嫩叶或叶芽。特别是在将植物浸渍在含有上述气孔增加 剂的溶液(例如至少含有上述气孔增加剂与作为助剂的培养基的气孔形成剂等)中的 情况下，由于气孔形成效果大而优选幼小植物(例如2～16日龄的植物等)。

进一步地，本发明的植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法的另一方面是以 在植物中使上述多肽过量表达为特征的方法(下面称为“方法2”)。在方法2中，由 于在植物中上述多肽过量表达，因而未分化的表皮细胞分化为构成气孔的保卫细胞， 可以增加植物中的气孔数和/或气孔密度。

作为在植物中使上述多肽过量表达的方法(多肽过量表达法)，可以举出例如下述 方法等：在作为方法2的适用对象的植物的原生质体、胼胝体或叶盘中通过电穿孔法、 粒子枪法、转染法等导入编码本发明多肽的核酸，使其再分化为叶、根等，进行植物 体的再生。再分化为叶时例如可如下进行：在原生质体的情况下，利用固体营养培养 基对该原生质体进行培养，进行细胞壁的合成，接下来，在液体培养基中剧烈搅拌下 进行培养，得到胼胝体，在植物生长素和细胞分裂素的存在下对所得到的胼胝体进行 培养，由此来进行所述再分化。另外，由胼胝体再分化为叶时例如通过在低浓度的植 物生长素和高浓度的细胞分裂素的存在下进行培养来进行。由叶盘再分化为叶时例如 通过在低浓度的植物生长素和高浓度的细胞分裂素的存在下对叶盘进行培养来进行。 作为上述再分化为叶时所用的培养基，可以根据植物的种类等来适宜选择，例如可以 举出胼胝体诱导培养基(含有1mg/L吲哚乙酸与1mg/L苄基氨基嘌呤的MS培养基)、 芽诱导培养基(含有0.1mg/L吲哚乙酸与1mg/L苄基氨基嘌呤的MS培养基)等。另外， 在本说明书中，所谓“过量表达”意指所产生的本发明的多肽至少多于野生型植物中 上述多肽的表达量。

作为该方法2的适用对象的植物与作为方法1的适用对象的植物是同样的。

如上所述，利用本发明的气孔增加剂、多肽、以及植物中的气孔数和/或气孔密 度的增加方法，可对植物中的气孔、例如植物的叶、茎、萼、花药等中的气孔形成进 行正调节，使未分化的表皮细胞分化为保卫细胞，增加气孔数和/或气孔密度。因而， 利用本发明，可以谋求植物二氧化碳吸收量的提高，因而对于大气中二氧化碳量的降 低是有用的。并且，利用本发明，可以通过二氧化碳吸收量的增大来增加植物中的碳 固定量，从而可谋求作为植物体的产率的增加等。

3.利用植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法所得到的植物

对于利用上述植物中的气孔数和/或气孔密度的增加方法而得到的植物，与野生 型植物相比，气孔数和/或气孔密度有所增加。因而，利用本发明的植物可以提高二 氧化碳的吸收量，因而可使大气中的二氧化碳量降低。并且，利用本发明的植物，可 通过二氧化碳吸收量的增大来增加碳固定量，因而可谋求产率的增加等。

作为上述植物，由于气孔数和/或气孔密度的增加所带来的效果大，优选维管束 植物。作为上述维管束植物没有特别限定，可以举出例如大豆等所代表的豆科植物、 稻等所代表的稻科植物、拟南芥所代表的十字花科植物、湿地白杨等所代表的杨柳科 植物、江南卷柏所代表的卷柏科植物等。

4.植物产率的增加方法

本发明的植物产率的增加方法的特征在于，使植物与上述气孔增加剂接触，或者 在植物中使上述多肽过量表达。

本发明的植物产率的增加方法中，一个方面是以使植物与上述气孔增加剂接触为 特征的方法(下文称为“方法3”)。在方法3中，由于使用上述气孔增加剂，因而与 野生型植物(野生株)相比，可使植物中的气孔数和/或气孔密度增加，可增加植物中的 碳固定量，增加植物的产率。并且，在该方法3中，可通过进行例如将上述气孔增加 剂直接涂布、散布或喷雾至植物等简单操作来简便地增加植物的产率。

植物与上述气孔增加剂的接触可通过与上述方法1中植物与上述气孔增加剂的 接触相同的方法来进行。并且，与植物接触的上述气孔增加剂的量以及植物与上述气 孔增加剂的接触时间与上述方法1中与植物接触的上述气孔增加剂的量以及植物与 上述气孔增加剂的接触时间是同样的。进一步地，作为方法3的适用对象的植物与作 为上述方法1的适用对象的植物是同样的。

本发明的植物产率的增加方法的另一方面是以在植物中使上述多肽过量表达为 特征的方法(下文称为“方法4”)。在方法4中，由于在植物中使上述多肽过量表达， 因而与未过量表达上述多肽的野生型植物(野生株)相比，可使植物中的气孔数和/或气 孔密度增加，可增加植物中的碳固定量，增加植物的产率。

上述多肽在植物中的过量表达可通过与上述方法2中的多肽过量表达法同样的 方法来进行。作为方法4的适用对象的植物与作为上述方法2的适用对象的植物是同 样的。

如以上说明所示，利用本发明的植物产率的增加方法，可增加植物中的碳固定量、 增加植物的产率。因而，本发明的植物产率的增加方法在粮食的增产、植物中有用物 质的产量增加等方面是有用的。

5.气孔增加剂的评价方法

在植物中，可以以本发明多肽的表达量或编码该多肽的核酸量为指标来对气孔增 加剂进行评价。具体地说，使待测物质与表达本发明多肽的细胞或至少保有该细胞的 植物接触，对于上述待测物质接触时多肽表达量相对于上述待测物质非接触时上述多 肽表达量的变化；以及上述待测物质接触时编码多肽的核酸量相对于上述待测物质非 接触时编码上述多肽的核酸量的变化这两种变化中的至少一种进行测定。

此处，作为上述待测物质没有特别限定，可以举出例如无机化合物、有机化合物、 植物或微生物的提取物、动物代谢产物、微生物培养物等。上述待测物质可以直接使 用，也可以根据需要溶解在溶剂中进行使用。上述溶剂优选为不会对上述生理学现象 的测定带来影响的溶剂。作为上述溶剂，可以举出例如生理盐水、水等。

待测物质与上述细胞的接触可以通过在含有上述待测物质的培养基中对上述细 胞进行培养等来进行。并且，待测物质与上述植物的接触可以通过下述操作等来进行： 将上述植物浸渍在含有上述待测物质的溶液中；对上述植物的叶、茎、萼、花药等直 接进行待测物质的涂布、散布、喷雾等。

作为上述培养基，只要为含有适于上述细胞或植物生长的成分[例如，葡萄糖、 氨基酸、蛋白胨、维生素等]的培养基即可。上述培养基可以为在常用的基础培养基 中添加上述成分而成的培养基，也可以为市售培养基。该培养基可以根据细胞或植物 的种类进行适当选择。

并且，作为构成上述溶液的溶剂，可以举出适于维持上述细胞或植物的缓冲液等。

与植物接触的待测物质量可以根据待测物质的种类进行适当设定。

对于多肽的表达量，可以通过使用与上述多肽结合的抗体进行例如Western印迹 法、ELISA法等来进行测定。并且，核酸量可以通过下述方法来测定：使用了利用上 述核酸而制作的探针的Southern印迹法或Northern印迹法；使用了利用上述核酸而 制作的引物对等的实时PCR；等等。

在该气孔增加剂的评价方法中，可以在上述待测物质接触时多肽表达量相对于上 述待测物质非接触时上述多肽的表达量多的情况下、以及上述待测物质接触时编码多 肽的核酸量相对于上述待测物质非接触时编码上述多肽的核酸量多的情况下分别做 出待测物质为气孔增加剂的评价。

实施例

下面通过实施例等对本发明进行详细说明，但本发明并不仅限于这些实施例。

需要说明的是，在以下的实施例等中，也将由序列编号6所示氨基酸序列构成的 多肽记为“气孔蛋白”。另外也将编码上述气孔蛋白的基因记为“气孔蛋白基因”。 进一步地，有时为了方便也将作为由序列编号6所示氨基酸序列构成的多肽的前体的 多肽(序列编号1)记为“气孔蛋白”。

(实施例1)

利用计算机进行的基因搜索(虚拟筛选，in silico screening)

使用拟南芥的转录组数据库ATTED-II(网址http://atted.jp/)以及作为程序的 ATTED-II的Tool中的“Network Drawer”，利用计算机进行基因搜索，对于与TMM 基因、SDD1基因和EPF1基因分别共表达的基因进行研究。基因搜索通过进行下述 步骤来实施：在Function 3中选择[Execute]、[MR-rank method]和[top 300 genes in 22,263 genes]的步骤；输入At1g80080(TMM基因)、At1g04110(SDD1基因)和 At2g20875(EPF1基因)这3个基因的步骤；以及利用“submit”进行分析的步骤。

基于该分析结果，注意到属于EPF家族的EPFL9基因(At4g12970)这一功能未知 的基因(气孔蛋白基因)。

(制备例1)

引物的设计

将以下的实施例等中所用的引物及其碱基序列于表1。

[表1]

其中，引物CACC_amiA、引物P10ami1_I miR-s、引物P10ami1_II miR-a、 引物P10ami1_III miR*s、引物P10ami1_IV miR*a、引物P10ami2_ImiR-s、引物 P10ami2_IImiR-a、引物P10ami2_IIImiR*s、引物P10ami2_IVmiR*a和引物amiB 为用于制作形成发夹结构的序列的引物，该发夹结构含有人工微小RNA，用于进行 气孔蛋白基因(基因编号At4g12970)的表达抑制。所述人工微小RNA以气孔蛋白基因 3’末端侧的编码区为靶位点。在人工微小RNA的设计中，使用微小RNA设计程序 WMD2[网址http://wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl]。

(制备例2)

针对气孔蛋白的抗体的制作

采用拟南芥Col-0品系(CS60000)[野生株]的基因组DNA作为模板，使用表1所 示的引物P10_F和引物P10_R，利用PCR对编码气孔蛋白的区域进行扩增。其后， 将所得到的PCR产物插入到载体[来源于pET32(Novagen社制造)的载体(参照文献23)] 中。将所得到的构建体导入至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21品系中，进行气孔蛋白 的表达。

将上述大肠杆菌的表达产物供于使用了亲和柱[GE Healthcare社制造，商品名： Hi-Trap Chelating Column]的亲和色谱中，之后供于使用了阴离子交换柱[GE  Healthcare社制造，商品名：H-SP]的色谱中，进行重组蛋白质(气孔蛋白)的精制。

接下来，按照文献26的记载，用所得到的精制产物对兔进行注射。其后采集兔 的血清。由所得到的血清得到了针对气孔蛋白的抗体(下文称为“抗气孔蛋白抗体”)。

(制备例3)

使用烟草培养细胞BY-2的重组蛋白质的表达

对于气孔蛋白与绿色荧光蛋白质(下文称为“GFP”)的融合蛋白(下文称为“气 孔蛋白-GFP”)、以及EPF1与GFP的融合蛋白(下文称为“EPF1-GFP”)，基于文献 20所记载的方法，利用烟草培养细胞体系(其使用了基于番茄花叶病毒的表达载体和 诱导型病毒感染体系)进行制作。

首先，采用拟南芥Col-0品系(CS60000)[野生株]的基因组DNA为模板，使用表 1所示的引物P10_F和引物P10R来进行PCR，从而得到编码气孔蛋白的DNA。另 外，对于编码GFP的DNA，是通过采用GFP的cDNA为模板、使用表1所示的引 物GFP-CfusF Bst和引物GFP-CfusR Bst进行PCR而得到的。将编码气孔蛋白的DNA 与编码GFP的DNA连结，得到DNA构建体(下文称为“气孔蛋白-GFP DNA”)。接 下来，将番茄花叶病毒载体pBICER8-ToMV-C0.3-HuIFNγ-SRz22中的HuIFNγ基因 区域置换为气孔蛋白-GFP DNA，得到用于表达气孔蛋白-GFP的载体(下文称为“气 孔蛋白-GFP表达载体”)。

另外，编码EPF1的DNA是通过采用拟南芥Col-0品系(CS60000)[野生株]的基 因组DNA为模板、使用表1所示的引物EPF1_F和引物EPF1_R进行PCR而得到 的。将编码EPF1的DNA与编码GFP的DNA连结，得到DNA构建体(下文称为 “EPF1-GFP DNA”)。接下来，将番茄花叶病毒载体 pBICER8-ToMV-C0.3-HuIFNγ-SRz22中的HuIFNγ基因区域置换为EPF1-GFP DNA， 得到用于表达EPF1-GFP的载体(下文称为“EPF1-GFP表达载体”)。

将所得到的气孔蛋白-GFP表达载体或EPF1-GFP表达载体导入到具有XVE的 BY-2细胞中，该XVE为可被雌激素诱导的转录因子。其后，基于文献20所记载的 方法，利用β-雌激素进行诱导。随后回收细胞进行破碎。对所得到的破碎物于800rpm 进行3分钟的离心分离，得到上清。由所得到的上清获得含有气孔蛋白-GFP或 EPF1-GFP的级分。

(实验例1)

抗气孔蛋白抗体的特异性的评价

将制备例3中得到的含有气孔蛋白-GFP的级分和含有EPF1-GFP的级分分别在 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶上点样，进行SDS-PAGE。使用SDS-PAGE后的凝胶以及 抗气孔蛋白抗体和抗GFP抗体中的每一种，基于文献24所记载的方法进行Western 印迹分析，对制备例2中得到的抗气孔蛋白抗体的特异性进行评价。另外，抗气孔蛋 白抗体以1/1000的浓度进行使用。作为二次抗体，以1/5000的浓度使用辣根过氧化 物酶结合型抗兔IgG-羊抗体[GE Healthcare社制造，商品名：NA934]。并且利用考马 斯亮蓝(CBB)对SDS-PAGE后的凝胶进行染色。制备例2中得到的抗气孔蛋白抗体的 特异性的研究结果见图2。图中，箭头表示对应于气孔蛋白-GFP区域的位置，星号 表示非特异性区域的位置。

由图2所示的结果可知，抗气孔蛋白抗体与气孔蛋白-GFP结合(参照图2的泳道 6)、但未与EPF1-GFP结合(参照图2的泳道5)。即，可知抗气孔蛋白抗体仅识别气 孔蛋白-GFP、而不识别EPF1-GFP。与此相对，可知抗GFP抗体与气孔蛋白-GFP和 EPF1-GFP这两者结合(参照图2的泳道3和4)。即，可知抗GFP抗体识别气孔蛋白 -GFP和EPF1-GFP这两者。

(制备例4)

首先如下进行操作，利用基于Gateway克隆化技术[Gateway cloning technology ｛Invitrogen｝]的植物双元载体(Plantbinary vector)来制作气孔蛋白过量表达用载体。 编码气孔蛋白的DNA是通过采用拟南芥Col-0品系(CS60000)的基因组DNA作为模 板、使用表1所示的引物P10_F和引物P10_R进行PCR而得到的。使用BP  Clonase[Invitrogen社制造]，将上述DNA导入到载体[Invitrogen社制造，商品名： pENTR/D-TOPO]中。其后，使用所得到的构建体与LR Clonase，将上述DNA由上述 构建体转移至二元载体pB2GW7[由Gent University VIB提供]中。由此得到气孔蛋白 过量表达用载体。

接下来，将气孔蛋白过量表达用载体导入至农杆菌(品系GV3101)中。随后用所 得到的农杆菌感染拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)，从而将上述DNA导入至拟 南芥Col-0品系中。其后使所得到的拟南芥生长，采集种子。将所采集的种子播种在 含有草铵膦的GM培养基[50μM草铵膦、0.5质量%MS盐、1质量%蔗糖、0.5质量 %MES-KOH缓冲液(pH5.7)、0.5质量%结冷胶]中，在22℃维持一定光量的条件下使 其生长。由此来挑选出草铵膦抗性个体。

对于所挑选的个体(T1)，使每个个体生长，得到第二代种子(T2)。将由所挑选的 个体(T1)中的第10个体(T1)所得到的种子作为气孔蛋白过量表达株10。将由所挑选 的个体(T1)中的第2个体(T1)所得到的种子作为气孔蛋白过量表达株2。

(制备例5)

采用人工微小RNA克隆化用质粒pRS300[由Detlef Weigel博士提供]作为模板， 使用表1所示的引物CACC_amiA、引物P10ami_1 miR-s、引物P10ami1_II miR-a、 引物P10ami1_III miR-*s、引物P10ami1_IV miR*a、引物amiB来制作由形成发夹 结构(该发夹结构包含人工微小RNA(amiRNA))的序列构成的DNA，将其导入至载体 [Invitrogen社制造，商品名：pENTR/D-TOPO]中。其后，使用所得到的构建体与LR Clonase，将上述DNA由上述构建体转移至二元载体pB2GW7[由Gent University VIB 提供]中。由此得到气孔蛋白表达抑制用载体。

接下来，将气孔蛋白表达抑制用载体导入至农杆菌(品系GV3101)中。随后用所 得到的农杆菌感染拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)，从而将上述DNA导入至拟 南芥Col-0品系中。其后使所得到的拟南芥生长，采集种子。将所采集的种子播种在 含有草铵膦的GM培养基中，在22℃维持一定光量的条件下使其生长。由此来挑选 出草铵膦抗性个体。

对于所挑选的个体(T1)，使每个个体生长，得到第二代种子(T2)。将由所挑选的 个体(T1)中的第10个体(T1)得到的种子作为气孔蛋白表达抑制株10 (STOMAGEN-RNAi)。将由所挑选的个体(T1)中的第2个体(T1)得到的种子作为气孔 蛋白表达抑制株2。

(制备例6)

除了用导入了气孔蛋白过量表达用载体的农杆菌(品系GV3101)感染拟南芥 pTMM：：GFP品系[岛根大学中川强博士提供]以外，进行与制备例4同样的操作， 得到气孔蛋白过量表达pTMM：：GFP株。

(试验例1)

气孔蛋白对植物表型的作用的评价

将拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]、制备例4中得到的气孔蛋白过 量表达株10和制备例5中得到的气孔蛋白表达抑制株10(STOMAGEN-RNAi)的成熟 第一叶分别采集下来。接下来，将上述第一叶在固定液(乙醇∶乙酸(体积比)=9∶1) 中固定7小时以上，其后利用水合三氯乙醛水溶液(水合三氯乙醛∶水∶甘油(体积 比)=8∶2∶1)进行透明化。用水除去水合三氯乙醛后，利用1μg/mL番红水溶液[1μg 番红-O/mL水]对气孔进行染色。其后，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商 品名：Axioskop plus Microscope]对上述第一叶的下表皮进行观察。将表示试验例1 中对野生株成熟第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干涉图像示于图3(a)，将表示 试验例1中对气孔蛋白表达抑制株10成熟第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干 涉图像示于图3(b)，并将表示试验例1中对气孔蛋白过量表达株10成熟第一叶的下 表皮进行观察的结果的微分干涉图像示于图3(c)。图中，比例条表示50μm。

另外，对于野生株、制备例4中得到的气孔蛋白过量表达株2和制备例5中得到 的气孔蛋白表达抑制株2，分别采集各株在发芽后第23天的子叶、生长完成的第2 节间的茎、成熟的果实、一定大小的花中的花药。接下来，通过进行与上述相同的操 作，分别将上述子叶、茎和果实固定、透明化，然后对气孔进行染色。其后，使用微 分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope]对于上述子叶、 茎和果实各自的表皮进行观察。另外，上述花药的表皮是使用共聚焦显微镜[蔡司 (Zeiss)社制造，商品名：LSM510META MICROSCOPE]以及488nm和544nm的40mW Ar/Kr激光进行观察的。试验例1中，将表示对野生株、气孔蛋白表达抑制株2和气 孔蛋白过量表达株2各自的子叶、茎和果实的表皮进行观察的结果的微分干涉图像以 及表示对花药的表皮进行观察的结果的共聚焦显微图像示于图4。图中箭头表示气 孔。并且图中的比例条表示100μm。

另外，对于拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]、制备例4中得到的气 孔蛋白过量表达株2和制备例5中得到的气孔蛋白表达抑制株2，分别采集各株在发 芽后第23天的子叶、成熟的果实或生长完成的第2节间的茎。接下来，使用微分干 涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope]对上述子叶、果实 或茎的表面进行观察，对0.22mm²正方形范围中的气孔数进行测定。并且计算出气孔 密度。需要说明的是，在统计分析中使用统计分析软件R(网址 http://www.R-project.org)。试验例1中对气孔蛋白基因的表达模式与子叶、果实和茎 的各器官中气孔密度的关系进行研究的结果见图5。图中，泳道1表示野生株、泳道 2表示气孔蛋白表达抑制株2，并且泳道3表示气孔蛋白过量表达株2。

进一步地，对于野生株和制备例4中得到的气孔蛋白过量表达株10，分别采集 发芽后第2.5天的子叶。接下来，利用荧光色素[Invitrogen社制造，商品名：FM4-64] 对子叶进行染色。使用共聚焦显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：LSM510 META  MICROSCOPE]以及488nm和544nm的40-mW Ar/Kr激光对染色后子叶的表皮进行 观察。将表示试验例1中对野生株子叶下表皮进行观察的结果的共聚焦显微图像示于 图6(a)，并且将表示试验例1中对气孔蛋白过量表达株10子叶下表皮进行观察的结 果的共聚焦显微图像示于图6(b)。在图6(a)和图6(b)各图中，右上图为右下图四方形 所示部分的扩大图。图中，水平方向的比例条表示50μm、垂直方向的比例条表示 500μm。

另外，对于野生株和制备例6中得到的气孔蛋白过量表达pTMM：：GFP株， 采集各株在发芽后第5天的第一叶。接下来，使用共聚焦显微镜[蔡司(Zeiss)社制造， 商品名：LSM510 META MICROSCOPE]以及488nm和544nm的40-mW Ar/Kr激光 对上述第一叶表皮进行观察。需要说明的是，在利用共聚焦显微镜进行观察时，使用 激发滤光片[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：BP450-490]、分色镜[蔡司(Zeiss)社制造，商 品名：FT510]、吸收滤光片[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：BP515-565]。将表示试验例 1中对野生株第一叶表皮进行观察的结果的共聚焦显微图像示于图7(a)，并将表示试 验例1中对气孔蛋白过量表达pTMM：：GFP株第一叶表皮进行观察的结果的共聚 焦显微图像示于图7(b)。图中，比例条表示50μm。

由图3、图4和图5所示的结果可知，在At4g12970基因、即气孔蛋白基因过量 表达的情况下(气孔蛋白过量表达株)，与野生株、气孔蛋白表达抑制株相比，存在气 孔的各种器官(叶、子叶、茎、果实、花药)中的气孔密度增加。这样的现象利用独立 作出的13个品系的T2植物(各7株个体)进行了确认。该气孔蛋白过量表达株的表型 为与表示气孔密度减少这样的表型的EPF1和EPF2过量表达株(文献4-6)完全相反的 表型。

需要说明的是，在大部分的双子叶植物中，气孔之间由至少一个“非气孔细胞” 隔开，该形态被认为会提高气体摄取效率(文献12)。由图3所示结果可知，在气孔蛋 白基因过量表达株的成熟叶中，有大量存在簇状气孔的倾向。另一方面，由图6和图 7所示的结果可知，在未成熟的子叶等中，卫星拟分生组织(气孔前体细胞)与保卫细 胞或其前体细胞相接。根据这些结果可以认为，在气孔蛋白过量表达株中，由于气孔 系细胞的细胞分裂方向与野生株不同，因而显示出了与野生株不同的形态特征。

(试验例2)

(1)气孔蛋白基因表达的局部性

采用拟南芥Col-0品系(CS60000)的基因组DNA为模板，使用表1所示的引物 P10_prom_F和引物P10_prom_R进行PCR，从而得到气孔蛋白基因(STOMAGEN) 的起始密码子上游2kbp的区域(启动子区域)的DNA。使用BP Clonase[Invitrogen社 制造]，将上述DNA导入至载体[Invitrogen社制造，商品名：pENTR/D-TOPO]中。 其后，使用所得到的构建体与LR Clonase，将上述DNA由上述构建体转移至载体 pBGWFS7[由Gent University VIB提供]中。上述pBGWFS7保持有β-葡萄糖苷酸酶 (GUS)基因，其是启动子所用的报告基因。由此得到启动子表达用载体。

接下来，将启动子表达用载体导入至农杆菌(品系GV3101)中。随后用所得到的 农杆菌感染拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)，从而将上述DNA导入至拟南芥 Col-0品系中。其后使所得到的拟南芥生长，采集种子。将所采集的种子播种在含有 草铵膦的GM培养基中，在22℃维持一定光量的条件下使其生长。由此来挑选出草 铵膦抗性的个体。

对于所挑选的个体(T1)，使每个个体生长，得到第二代种子(T2)。将所得到的种 子(T2)作为pSTOMAGEN：：GUS株。进一步制作发芽后第18天的pSTOMAGEN：： GUS株第9叶的横截切片。使用所得到的横截切片，对基于气孔蛋白基因启动子的 GUS活性表达进行研究。需要说明的是，对于GUS活性的表达，除了将样品在4℃ 固定7～10小时以外，通过进行与文献26所述GUS染色方法同样的操作来确认。将 表示试验例2中对发芽后第18天的pSTOMAGEN：：GUS株第9叶的横截切片进行 观察的结果的显微图像示于图8。

由图8所示的结果可知，基于气孔蛋白基因启动子的GUS活性的表达具有主要 多见于叶肉组织中的倾向。因而，该结果暗示了气孔蛋白基因在叶肉组织中表达。

(2)原位杂交

使用拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]的叶、以及经气孔蛋白基因 (STOMAGEN)的cDNA(306bp)标记的探针(正义探针)或经对应于上述cDNA的反义 链标记的探针(反义探针)，进行原位杂交。原位杂交通过与文献24所述方法同样的 操作来进行。将表示试验例2中在叶原基中使用气孔蛋白基因的反义探针进行原位杂 交分析的结果的显微图像示于图9(a)中，并且将表示试验例2中在叶原基中使用气孔 蛋白基因的正义探针进行原位杂交分析的结果的显微图像示于图9(b)中。

由图9(a)和图9(b)所示的结果可知，未检测到来源于作为对照的正义探针的信号 [参照图9(b)]，与此相对，在叶肉组织中见到了来源于反义探针的信号[参照图9(a)]。

根据这些结果可以认为，在图6和图7中所见的气孔蛋白过量表达株中的形态特 征是由于通过使用气孔蛋白的过量表达所用载体中含有的35S启动子而使气孔蛋白 基因在表皮细胞中过量表达所致的。

(制备例7)

在制备例5中，不使用表1所示的引物P10ami1_I miR-s、引物P10ami1_II miR-a、引物P10ami1_III miR*s和引物P10ami1_IV miR*a，而使用表1所示的引 物P10ami2_ImiR-s、引物P10ami2_IImiR-a、引物P10ami2_IIImiR*s和引物P10ami2 _IVmiR*a，除此以外，进行与制备例5同样的操作，得到气孔蛋白表达抑制株 (ami-B)。需要说明的是，在气孔蛋白表达抑制株(ami-B)中，通过作为人工微小RNA 的ami-B来抑制气孔蛋白的表达。含有气孔蛋白基因的核酸中的ami-B靶序列的位置 如图10(a)所示。

(制备例8)

在制备例5中，作为模板不使用人工微小RNA克隆化用质粒pRS300而使用拟 南芥Col-0品系(CS60000)的基因组DNA；不使用表1所示的引物CACC_amiA、引 物P10ami_1 miR-s、引物P10ami1_II miR-a、引物P10ami1_III miR-*s、引物P10ami1 _IV miR*a和引物amiB而使用表1所示的引物P10_RNAi_F和引物P10_RNAi _R；并且不使用二元载体pB2GW7[由Gent University VIB提供]而使用载体 pB2GWI(2)WG7[由Gent University VIB提供]，除此以外，进行与制备例5同样的操 作，得到气孔蛋白表达抑制株(dsRNA)。需要说明的是，在气孔蛋白表达抑制株(dsRNA) 中，气孔蛋白的表达由dsRNA所抑制。含有气孔蛋白基因的核酸中dsRNA靶序列的 位置如图10(a)所示。

(试验例3)

对于拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]、制备例5中得到的气孔蛋白 表达抑制株(气孔蛋白表达抑制株10，也称为“ami-A”)、制备例7中得到的气孔蛋 白表达抑制株(ami-B)和制备例8中得到的气孔蛋白表达抑制株(dsRNA)，分别采集成 熟第一叶。接下来，通过进行与试验例1同样的操作，进行上述第一叶的固定、透明 化，之后对气孔进行染色。其后，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名： Axioskop plus Microscope]对上述第一叶的下表皮进行观察。将表示试验例3中对野生 株、气孔蛋白表达抑制株(ami-A)、气孔蛋白表达抑制株(ami-B)和气孔蛋白表达抑制 株(dsRNA)各自的成熟第一叶下表皮进行观察的结果的微分干涉图像示于图10(b)。图 10(b)中，(I)表示野生株，(II)表示气孔蛋白表达抑制株(ami-A)，(III)表示气孔蛋白表 达抑制株(ami-B)、并且(IV)表示气孔蛋白表达抑制株(dsRNA)。另外，图10(b)中，比 例条表示50μm。

另外，对于拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]、制备例5中得到的气 孔蛋白表达抑制株(ami-A)、制备例7中得到的气孔蛋白表达抑制株(ami-B)和制备例 8中得到的气孔蛋白表达抑制株(dsRNA)，分别采集发芽后第5天的第一叶。接下来， 使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope]对上述 第一叶的表面进行观察，对0.22mm²正方形范围中的气孔数进行测定。并且计算出气 孔密度。需要说明的是，在统计分析中使用统计分析软件R。进一步地，对于拟南芥 Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]、制备例5中得到的气孔蛋白表达抑制株 (ami-A)的独立的12个品系、制备例7中得到的气孔蛋白表达抑制株(ami-B)的独立的 12个品系、以及制备例8中得到的气孔蛋白表达抑制株(dsRNA)的独立的4个品系， 分别对发芽后第5天第一叶中的气孔蛋白基因表达量进行测定。另外，作为对照，对 上述第一叶中肌动蛋白8基因的表达量进行测定，表达量的测定如下进行：作为模板 使用按照文献24提取的RNA，并且使用实时PCR用试剂盒[Life Technology社制造， 商品名：7500Fast Real-Time PCR system]与基因表达分析用试剂盒[Life Technology 社制造，商品名：TaqMan gene expression assay kit]，通过实时PCR来进行测定。对 于所用Taqman探针的编号，在气孔蛋白基因表达量测定的情况下为At02219575_ g1，在肌动蛋白8基因表达量测定的情况下为At02270958_gH。并且计算出气孔蛋 白基因相对于肌动蛋白8基因的相对表达量。为进行相对定量，使用threshold cycle 法(文献25)。将试验例3中对于气孔密度与气孔蛋白基因相对表达量的关系进行研究 的结果示于图10(c)。图10(c)中，黑圆表示气孔蛋白表达抑制株(ami-A)，黑三角表示 气孔蛋白表达抑制株(ami-B)，方形表示气孔蛋白表达抑制株(dsRNA)。并且，图10(c) 中，野生株表示相对表达量1。误差条表示标准偏差。

由图10(b)所示的结果可知，气孔蛋白表达抑制株(ami-A)、气孔蛋白表达抑制株 (ami-B)和气孔蛋白表达抑制株(dsRNA)各自的成熟第一叶显示出了与图3所示的气孔 蛋白表达抑制株10同样的表型。另外，由图10(c)所示的结果可知，相对于气孔蛋白 基因的相对表达量为1的野生株，在气孔蛋白基因的相对表达量低于1的气孔蛋白表 达抑制株(ami-A)、气孔蛋白表达抑制株(ami-B)和气孔蛋白表达抑制株(dsRNA)中，气 孔密度显著降低。这些结果暗示出，气孔蛋白基因对于气孔产生是必要的。

(试验例4)

对于拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]、制备例4中得到的气孔蛋白 过量表达株10和制备例5中得到的气孔蛋白表达抑制株10，分别采集发芽后第23 天的成熟第一叶。接下来，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop  plus Microscope]对上述第一叶的表面进行观察，对0.22mm²正方形范围中的气孔数进 行测定。并且计算出气孔密度。需要说明的是，在统计分析中，使用统计分析软件R。 并且通过进行与试验例3同样的操作来求出野生株、气孔蛋白过量表达株10和气孔 蛋白表达抑制株10各自的发芽后第23天的成熟第一叶中气孔蛋白基因的相对表达 量。将在试验例4中对气孔密度与气孔蛋白基因的相对表达量的关系进行研究的结果 示于图11中。图中，圆表示野生株，三角表示气孔蛋白表达抑制株10，方形表示气 孔蛋白过量表达株10，并且误差条表示标准偏差。

另外，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope]，对于野生株、气孔蛋白过量表达株10和气孔蛋白表达抑制株10各自的 发芽后第23天的成熟第一叶下表皮进行观察，对气孔数和表皮细胞数目进行测定。 并且计算出气孔指数[气孔数/(气孔数+表皮细胞的数)]。其结果列于表2。

[表2]

由图11和表2所示的结果可知，气孔蛋白基因的表达量与气孔密度或气孔指数 之间具有正相关。

因而，这些结果暗示出，气孔蛋白基因为气孔分化的正调节因子。

(试验例5)

按照文献24所记载的方法，在发芽后第9天(未成熟期)和第23天(成熟期)，分 别从拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)的根、叶或茎中提取RNA。并且按照文献 24所记载的方法从拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)未成熟的花芽或未成熟的果 实中提取RNA。

将所得到的RNA用作模板，通过与试验例3进行同样的操作来进行RT-PCR。 并且通过琼脂糖凝胶电泳法对于根、叶、茎、花芽和果实各器官中是否有气孔蛋白基 因的表达进行研究。需要说明的是，作为内部对照使用肌动蛋白基因。将表示试验例 5中对根、叶、茎、花芽和果实各器官中是否有气孔蛋白基因表达进行研究的结果的 电泳图示于图12中。图中，“i”表示未成熟期，并且“m”表示成熟期。

由图12所示的结果可知，气孔蛋白基因主要在未成熟期的叶、茎或花芽等器官 中表达。

(试验例6)

对于试验例2中制作的pSTOMAGEN：：GUS株，对发芽后第2天、第9天或 第16天中未成熟子叶和幼小叶中有无GUS活性表达进行观察。将试验例6中对 pSTOMAGEN：：GUS株发芽后第2天气孔蛋白基因启动子的表达进行分析的结果 示于图13(a)，将试验例6中对pSTOMAGEN：：GUS株发芽后第9天气孔蛋白基因 启动子的表达进行分析的结果示于图13(b)，并且将试验例6中对pSTOMAGEN：： GUS株发芽后第16天气孔蛋白基因启动子的表达进行分析的结果示于图13(c)。图中， “C”表示子叶，且“J”表示幼小叶。

由图13所示的结果可知，在pSTOMAGEN：：GUS中，在未成熟子叶、叶中确 认到了GUS活性，但在生长充分进展时则未见到GUS活性。并且，该现象与图12 所示的结果也是一致的。这些表达模式与气孔的产生在未成熟期的器官中进行这一事 实(文献2)相符。并且，令人吃惊的是，在叶肉组织中可以确认到基于气孔蛋白基因 启动子的GUS活性，但在气孔发生分化的表皮组织中却无法确认到该活性(参照图8)。 并且，在原位RNA杂交分析中也显示出了同样的结果(参照图9)。

由这些结果推测出，气孔蛋白在叶肉组织中产生，作为传递到表皮的信号对气孔 的产生进行调节。可知，对于气孔蛋白基因(STOMAGEN)的表达模式来说，其相对 于大部分与气孔产生相关的基因在表皮组织中特异性表达(文献10、13、14)的情况为 反例。

(制备例9～11)

通过PCR分别制作对在C末端结合有4个甘氨酸的Venus(Venus-G4)进行编码 的DNA、对南瓜2S白蛋白的信号肽(SP)进行编码的DNA、以及对除终止密码子以 外的气孔蛋白基因的开放阅读框进行编码的DNA。需要说明的是，在制作对在C末 端结合有4个甘氨酸的Venus(Venus-G4)进行编码的DNA时，使用表1所示的引物 P10_F、P-V_F、引物P-V_R和引物Venus_R。在制作对南瓜2S白蛋白的信号肽 进行编码的DNA时，使用引物2Ssp_F、2Ssp<――p10m、2Ssp――>p10m和P10 _R(参照文献22)。

通过利用引物伸长法将上述编码Venus-G4的DNA与上述编码信号肽的DNA以 及对上述除终止密码子外的气孔蛋白基因的开放阅读框进行编码的DNA连结，来制 作气孔蛋白-Venus融合基因。将所得到的融合基因导入至载体[Invitrogen社制造，商 品名：pENTR/D-TOPO]中。其后，使用所得到的构建体和LR Clonase，将上述DNA 由上述构建体转移至载体pB2GW7[由Gent University VIB提供]中。由此得到气孔蛋 白-Venus表达用载体。

将所得到的气孔蛋白-Venus表达用载体导入至农杆菌(品系GV3101)中。用所得 到的农杆菌感染拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)，从而将上述DNA导入至拟南 芥Col-0品系中。其后，使所得到的拟南芥生长，采集种子。将所采集的种子播种在 含有草铵膦的GM培养基中，在22℃维持一定光量的条件下使其生长。由此来挑选 出草铵膦抗性的个体。对于所挑选的个体(T1)，使每个个体生长，得到第二代种子(T2)。 T2种子之中，进一步播种于含有草铵膦的GM培养基中在22℃维持一定光量的条件 下使其生长，挑选此时生存个体：死亡个体(数比)为3：1的种子，采集第二代种子(T3 种子)。接下来，T3种子之中，播种于含有草铵膦的GM培养基中在22℃维持一定光 量的条件下使其生长，确定此时全部个体存活的品系(同倍体，ホモ個体)。将所得到 的个体作为气孔蛋白-Venus表达株(制备例9)。

另外，通过引物伸长法将上述编码信号肽的DNA与上述对除终止密码子以外的 气孔蛋白基因的开放阅读框进行编码的DNA连结，从而得到编码STOMAGEN^*(在 成熟型气孔蛋白的N末端添加有信号肽的多肽)的DNA。其后，不使用气孔蛋白-Venus 融合基因而使用编码STOMAGEN^*的DNA，除此以外进行与上述同样的操作，得到 STOMAGEN^*表达株(制备例10)。

进一步地，将上述编码信号肽的DNA与上述编码Venus-G4的DNA通过引物伸 长法连结，从而得到对信号肽与Venus的融合物(SP-Venus)进行编码的DNA。除了 不使用气孔蛋白-Venus融合基因而使用编码SP-Venus的DNA以外，进行与上述同 样的操作，得到SP-Venus表达株(制备例11)。

(试验例7)

对于拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]、制备例4中得到的气孔蛋白 过量表达株10、制备例10中得到的STOMAGEN^*表达株和制备例9中得到的气孔蛋 白-Venus表达株，分别采集发芽后第23天的第一叶。使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss) 社制造，商品名：Axioskop plus Microscope]对上述第一叶的表面进行观察，对0.22mm²正方形范围中的气孔数进行测定。并且计算出气孔密度。需要说明的是，在统计分析 中，使用统计分析软件R(网址http://www.R-project.org)。并且进行Student双侧t检 验。将试验例7中对气孔蛋白基因的表达模式与气孔密度的关系进行研究的结果示于 图14。图中，泳道1表示野生株，泳道2表示气孔蛋白过量表达株10，泳道3表示 STOMAGEN^*表达株，且泳道4表示气孔蛋白-Venus表达株。并且，在图中，误差 条表示标准偏差，且星号表示与野生株比较p值小于0.01。

由图14所示的结果可知，制备例10中得到的STOMAGEN^*表达株和制备例9 中得到的气孔蛋白-Venus表达株显示出了与气孔蛋白表达株同样的表型。

(试验例8)

利用脱盐水或0.8M甘露醇对制备例9中得到的气孔蛋白-Venus表达株发芽后第 3天的子叶进行处理。处理后的子叶利用荧光色素[Invitrogen社制造，商品名：FM4-64] 进行染色。

使用共聚焦显微镜对利用FM4-64进行了染色的气孔蛋白-Venus表达株发芽3天 后的子叶下表皮进行观察。此时，在基于Venus的荧光检测中，使用激发滤光片[蔡 司(Zeiss)社制造，商品名：BP450-490]、分色镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：FT510]、 吸收滤光片[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：BP515-565]。另外，在基于FM4-64的荧光 检测中，使用激发滤光片[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：BP515-560)、分色镜[蔡司(Zeiss) 社制造，商品名：FT510]、吸收滤光片[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：BP515-565]。将 表示试验例8中对利用FM4-64进行了染色的气孔蛋白-Venus表达株发芽3天后的子 叶下表皮进行观察的结果的共聚焦显微图像示于图15中。图中，(a)、(b)和(c)为利用 脱盐水处理的子叶，(d)、(e)和(f)为利用0.8M甘露醇处理的子叶。并且，图中，(a) 和(d)表示对基于FM4-64的荧光进行检测的结果，(b)和(e)表示对基于Venus的荧光 进行检测的结果，(c)和(f)表示对基于FM4-64的荧光进行检测的结果与对基于Venus 的荧光进行检测的结果的合并。

另外，除了不使用制备例9中得到的气孔蛋白-Venus表达株而使用制备例11中 得到的SP-Venus株或Lti6b-GFP株[Stanford University，Cris Somerville博士提供]以 外，与上述同样地对发芽3天后的子叶下表皮进行观察。需要说明的是，基于GFP 的荧光检测中，使用激发滤光片[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：BP450-490]、分色镜[蔡 司(Zeiss)社制造，商品名：FT510]、吸收滤光片[蔡司(Zeiss)社制造，商品名： BP515-565]。将表示试验例8对利用FM4-64进行了染色的SP-Venus表达株发芽3 天后的子叶下表皮进行观察的结果的共聚焦显微图像示于图16(A)，并将表示试验例 8中对利用FM4-64进行了染色的Lti6b-GFP株发芽3天后的子叶下表皮进行观察的 结果的共聚焦显微图像示于图16(B)。图16(A)和(B)中，(a)、(b)和(c)为脱盐水处理的 子叶，(d)、(e)和(f)为0.8M甘露醇处理的子叶。并且，图16(A)中，(a)和(d)表示对基 于FM4-64的荧光进行检测的结果，(b)和(e)表示对基于Venus的荧光进行检测的结果， (c)和(f)表示对基于FM4-64的荧光进行检测的结果与对基于Venus的荧光进行检测的 结果的合并。图16(B)中，(a)和(d)表示对基于FM4-64的荧光进行检测的结果，(b) 和(e)表示对基于GFP的荧光进行检测的结果，(c)和(f)表示对基于FM4-64的荧光进 行检测的结果与对基于GFP的荧光进行检测的结果的合并。

由图15和图16所示的结果可知，在质壁分离的细胞外侧观察到了Venus的荧光。 由该结果暗示出，气孔蛋白从细胞分泌至质外体。以往，在对“叶肉-表皮的相互作 用”进行研究的情况下，现有的见解始终停留在叶肉组织空隙与气孔位置是否具有关 系这样的形态学的问题方面(文献12、15)。但是，根据本发明人的这些见解，提供了 通过表皮-叶肉相互作用而对气孔密度进行调节这一新颖而重要的视点。

(实施例2)

对拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生型]或制备例9中得到的气孔蛋白 -Venus表达株7g进行破碎，将破碎产物溶解在溶液[组成：50mM三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐缓冲液(pH7.5)、50mM氯化钠、1体积%CAPS液]5mL中。接下来，将所得到 的试样与蛋白质分离用试剂盒[Milteny Biotech社制造，商品名：μMACS GFP-tag  protein isolation kit]中的anti-GFP珠200μL混合。将所得到的混合物在4℃静置。将 珠利用磁性柱吸附后，利用上述蛋白质分离用试剂盒中所附的缓冲溶液对珠上所粘的 蛋白质进行洗脱。

使用所得到的级分和制备例2中得到的抗气孔蛋白抗体，基于文献24所记载的 方法进行Western印迹分析。需要说明的是，抗气孔蛋白抗体以1/1000的浓度进行使 用。作为二次抗体，以1/5000的浓度使用辣根过氧化物酶结合型抗兔IgG-羊抗体[GE Healthcare社制造，商品名：NA934]。将在实施例2中使用抗气孔蛋白抗体对于由气 孔蛋白-Venus表达株得到的级分进行Western印迹分析的结果示于图17。

由图17所示的结果可知，由于检测出了单一条带，因而上述级分中含有抗气孔 蛋白抗体结合多肽。

接下来，利用SDS-PAGE对上述级分进行分离。将所得到的分离产物在PVDF 膜(Immobilon-P，Millipore社制造)上点样，利用CBB染色或抗气孔蛋白抗体进行检 测。并且将与抗气孔蛋白抗体结合区域所对应的CBB染色区域切下，然后提取多肽。 使用自动肽序列测序仪[Life Technology社制造，商品名：Procise 492cLC]来确定所提 取多肽(气孔蛋白)的N末端氨基酸序列。将实施例2中对气孔蛋白-VenusN末端氨基 酸序列进行分析的结果示于图18。

气孔蛋白基因编码由102氨基酸构成的小蛋白质，该102氨基酸具有在N末端 侧具有推测为信号肽的氨基酸序列(参照图1)。由图18所示的结果可知，气孔蛋白 -Venus表达株中产生的多肽的N末端氨基酸序列为IGSTAPTXTY(X为不能确定)(序 列编号1的部分氨基酸残基)，在由气孔蛋白基因推测的氨基酸序列中，与从第58异 亮氨酸起的序列相同。

接下来，基于文献27所记载的方法通过质量分析来鉴定上述多肽。首先利用 SDS-PAGE分离上述级分，通过银染进行染色。分别单独切出各条带，在缓冲溶液[组 成：50mM碳酸铵(pH8.0)、2体积%乙腈]中利用胰蛋白酶或赖氨酰肽链内切酶(Promega 社制造)处理1天来进行凝胶内消化。将消化产物供给至使用了质谱仪[Brucker  Daltonics社制造，商品名：ultraflex TOF/TOF]的基质辅助激光解析飞行时间质谱仪 [matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)]中进行质量分析。将实施例2中使用赖氨酰肽链内切酶通过质量 分析对气孔蛋白-Venus的N末端氨基酸序列进行分析的结果示于图19(a)，并且将实 施例2中使用胰蛋白酶通过质量分析对气孔蛋白-Venus的N末端氨基酸序列进行分 析的结果示于图19(b)。

由图19所示的结果可知，胰蛋白酶分解产物的氨基酸序列为 IGSTAPTCTYNECR(序列编号1的部分氨基酸残基)，赖氨酰肽链内切酶分解产物的 氨基酸序列为IGSTAPTCTYNECRGCRYK(序列编号1的部分氨基酸残基)。该结果 与肽测序仪的分析结果一致。由这些结果可知，气孔蛋白按照在植物中产生具有6 个半胱氨酸的45氨基酸的肽的方式被切断。

Clustal W对于气孔蛋白在稻(Oryza sativa(Os01g0914400))、葡萄(Vitis  vinifera(AM444732))、白杨(Populus trichocarpa(Pt02g2557))和江南卷柏(Selaginella  moellendorffii(Sm084711))各自中的直向同源序列进行了研究。图20中示出了实施例 2中Clustal W所研究的气孔蛋白在稻(Oryza sativa(Os01g0914400))、葡萄(Vitis  vinifera(AM444732))、白杨(Populus trichocarpa(Pt02g2557))和江南卷柏(Selaginella  moellendorffii(Sm084711))各自中的直向同源序列的多重比对的结果。

在带有信号肽的气孔蛋白过量表达的转化体(SP-气孔蛋白表达株)中，气孔密度得 到增加(10个独立品系、利用T2植物观察，参照图14)。这表示45氨基酸的肽对于 诱导气孔分化是充分的。并且，由图20所示的结果可知，在各种植物中发现有编码 气孔蛋白样肽的基因，有趣的是，在作为原始的维管束植物的江南卷柏(Selaginella  moellendorffii)中也发现了该种基因。由这些结果可以推测，气孔蛋白在维管束植物中 广泛分布。因而认为该气孔蛋白在以维管束植物为代表的植物中发挥功能。

(实施例3)

为了得到高纯度的气孔蛋白(stomagen)，在烟草培养细胞BY-2中导入气孔蛋白 基因(STOMAGEN)。

将番茄花叶病毒载体pBICER8-ToMV-C0.3-HuIFNγ-SRz22中的HuIFNγ基因区 域置换为编码气孔蛋白的DNA，得到用于表达气孔蛋白的载体(下文称为“气孔蛋白 表达载体”)。

将所得到的气孔蛋白表达载体导入至具有XVE(该XVE为可被雌激素诱导的转 录因子)的BY-2细胞中，得到气孔蛋白表达BY-2细胞。接下来，按照文献20所记 载的方法，利用β-雌激素进行诱导。其后，对培养物以100000×g进行1小时超离心 分离，得到上清(培养上清)。另外，将细胞破碎后，对所得到的破碎物以800rpm进 行3分钟的离心分离，得到上清(细胞提取物)。

使用上述培养上清或细胞提取物和制备例2中得到的抗气孔蛋白抗体，基于文献 24所记载的方法进行Western印迹分析。需要说明的是，抗气孔蛋白抗体以1/1000 的浓度进行使用。作为二次抗体，以1/5000的浓度使用辣根过氧化物酶结合型抗兔 IgG-羊抗体[GE Healthcare社制造，商品名：NA934]。另外，作为对照，使用BY-2 细胞培养物的上清。在实施例3中，使用抗气孔蛋白抗体对气孔蛋白表达BY-2细胞 的培养物进行Western印迹分析，结果示于图21。图中，“C”表示细胞提取物，“M” 表示培养上清。另外，在图中，“T”表示气孔蛋白表达BY-2细胞，“NT”表示BY-2 细胞。

由图21所示的结果可知，在培养上清中含有抗气孔蛋白抗体所结合的多肽，即 含有气孔蛋白。因此，使用上述培养上清按如下所述进行操作，来进行气孔蛋白的精 制。使上述培养上清通过0.22μm孔的过滤器[Millex社制造]进行过滤。将所得到的 滤液填充到反相HPLC柱[Pharmacia社制造，商品名：mRPC C2/C18SP4/6]中，之后 利用清洗溶液[组成：5体积%甲醇、0.5体积%三氟乙酸(下文称为“TFA”)、余量为 水]对上述柱进行清洗。接下来使用展开溶剂A[组成：90体积%甲醇、0.5体积%TFA、 余量为水]与清洗溶液，按照甲醇浓度梯度为5体积%至90体积%来施加线性梯度， 在上述柱中流通，来进行溶出。分取1mL的溶出液。对于各级分进行溶剂的蒸发， 从而浓缩为约100μL。图22中示出了在实施例3中使用反相HPLC柱进行气孔蛋白 的精制时的色谱图。并且，图23中示出了表示在实施例3中对于使用反相HPLC柱 的色谱法的各级分通过SDS-PAGE进行分析的结果的电泳图。

由图22和图23所示的结果可知，在一些级分中发现有约5kDa大小的单条带。 于是通过埃德曼降解来确定第10～13级分中所含有的气孔蛋白的N末端氨基酸序 列。图24中示出了在实施例3中通过埃德曼降解对第10～13级分中所含有的气孔蛋 白的N末端氨基酸序列进行分析的结果。另外，在图25中示出了实施例3中经精制 的重组气孔蛋白的电泳图。

由图24和图25所示的结果可知得到了与野生型气孔蛋白具有同样的N末端序 列的重组气孔蛋白。

(实施例4)

利用灭菌后的B5培养基[日本制药株式会社制造，目录编号：399-00621]来维持 拟南芥[Lti6b-GFP株]的种子使其发芽。对于发芽后第2天的Lti6b-GFP株给予实施例 2中得到的精制重组气孔蛋白使其浓度为2μM。其后使Lti6b-GFP株在22℃生长3 天，利用共聚焦显微镜对子叶下表皮进行观察。作为对照，使用未给予气孔蛋白的 Lti6b-GFP株，与上述同样地进行操作，对子叶下表皮进行观察。将实施例4中未给 予精制重组气孔蛋白的Lti6b-GFP表达株的子叶下表皮的共聚焦显微图像示于图 26(a)，并将实施例4中给予了精制重组气孔蛋白(2μM)的Lti6b-GFP表达株的子叶下 表皮的共聚焦显微图像示于图26(b)。图中，比例条表示50μm。

由图26所示的结果可知，与未给予精制重组气孔蛋白的Lti6b-GFP表达株子叶 下表皮[参照图26(a)]相比，给予了精制重组气孔蛋白的Lti6b-GFP表达株子叶下表皮 [参照图26(b)]的气孔数和气孔密度有所增加。另外使用硫代硫酸银对于液体培养时乙 烯的影响进行了评价，结果确认到气孔蛋白的效果与乙烯无关。因而，该结果暗示出， 通过对植物给予气孔蛋白，可以使植物中的气孔数和/或气孔密度增加。

(实施例5)

对由序列编号1所示氨基酸序列中的第58～102氨基酸残基构成的多肽(45氨基 酸)进行化学合成。将含有所得到的多肽的多肽溶液(0.5mg/mL)溶解在溶液[20mM三 羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(pH8.8)、50mM氯化钠]中。其后，对于所得到的试样， 使用透析膜[Spectrum Laboratories社制造，商品名：Spectra/Por3MWCO、3500]在4℃ 进行1天相对于透析用水溶液[组成：0.5mM谷胱甘肽(氧化型和还原型这两者，和光 纯药株式会社制造；氧化型目录编号：077-03334、还原型目录编号：194679)、200mM L-精氨酸(pH8.0)]的透析。所得到的透析产物相对于溶液[20mM三羟甲基氨基甲烷盐 酸盐缓冲液(pH8.8)、50mM氯化钠]用1.5天进行3次透析，去除谷胱甘肽。由此得 到合成气孔蛋白。另外，所得到的合成气孔蛋白通过SDS-PAGE确认了纯度等。

(实施例6)

利用灭菌后的B5培养基来维持拟南芥[Lti6b-GFP株]的种子使其发芽。对于发芽 后第2天的Lti6b-GFP株给予实施例5中得到的合成气孔蛋白使其浓度为300nM。其 后使Lti6b-GFP株在22℃生长3天。接下来采集子叶，使用共聚焦显微镜[蔡司(Zeiss) 社制造，商品名：LSM510 META MICROSCOPE]对其表面进行观察，对0.22mm²正 方形范围中的气孔数进行测定。并且计算出气孔密度。需要说明的是，在统计分析中 使用统计分析软件R(网址http://www.R-project.org)。另外，作为对照，使用未给予 气孔蛋白的Lti6b-GFP株，与上述同样地进行操作，计算出气孔密度。将在实施例6 中对合成气孔蛋白量与气孔密度的关系进行研究的结果示于图27。

由图27所示的结果可知，与未给予合成气孔蛋白的Lti6b-GFP表达株子叶下表 皮相比，给予了合成气孔蛋白的Lti6b-GFP表达株子叶下表皮中的气孔密度得以增加。 另外使用硫代硫酸银对于液体培养时乙烯的影响进行了评价，结果确认到气孔蛋白的 效果与乙烯无关。因而该结果暗示出，通过对植物给予合成气孔蛋白，可以使植物的 气孔密度增加。由以上的结果可知，BY-2细胞中所表达的重组气孔蛋白(实施例2) 和经化学合成的气孔蛋白(实施例4)这两者均可浓度依赖性地增加气孔密度。由该结 果证实了气孔蛋白为气孔诱导因子。

(制备例12)

使由Arabidopsis stock center(ABRC，美国)订购的种子(品系编号SAIL_36_B6) 发芽，提取萌芽中的DNA，使用表1所示的引物spch SAIL_36_B6LP和引物SAIL _36_B6_RP进行PCR，从而挑选出在SPCH基因中插入有T-DNA的个体。由此 得到SPCH基因缺损的变异体拟南芥(spch变异株)。

(制备例13)

在制备例4中，不使用拟南芥Col-0品系而使用制备例12中得到的spch变异株， 除此以外，进行与制备例4同样的操作，得到气孔蛋白过量表达spch变异株。

(试验例9)

气孔系的形成认为是通过被称为SPEECHLESS(SPCH)的bHLH型转录因子引发 的(参照文献13和文献14)。因此，使用制备例12中得到的spch变异株和制备例13 中得到的气孔蛋白过量表达spch变异株来对气孔蛋白的影响进行研究。

利用灭菌后的B5培养基维持spch变异株的种子或拟南芥Col-0品系(储藏编号 CS60000)[野生株]的种子使其发芽。对于发芽后第2天的spch变异株或野生株，按照 其浓度为2μM给予实施例2中得到的精制重组气孔蛋白。其后，使spch变异株或野 生株在22℃生长3天，使用共聚焦显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：LSM510META MICROSCOPE]对子叶下表皮进行观察。作为对照，使用未给予气孔蛋白的spch株， 与上述同样地进行操作，对子叶下表皮进行观察。将试验例9中未给予精制重组气孔 蛋白的spch变异株子叶下表皮的共聚焦显微图像示于图28(a)，将试验例9中给予了 精制重组气孔蛋白(2μM)的spch变异株子叶下表皮的共聚焦显微图像示于图28(b)， 并将试验例9中给予了精制重组气孔蛋白(2μM)的野生株子叶下表皮的共聚焦显微图 像示于图28(c)。

另外，对于spch变异株、气孔蛋白过量表达spch变异株或制备例4中得到的气 孔蛋白过量表达株(气孔蛋白过量表达株10)，分别采集发芽后第23天的子叶。接下 来，通过进行与试验例1同样的操作，将上述子叶固定、透明化，然后对气孔进行染 色。其后，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope] 对上述第一叶的下表皮进行观察。将表示试验例9中对spch变异株子叶下表皮进行 观察的结果的微分干涉图像示于图28(d)，将表示试验例9中对气孔蛋白过量表达spch 变异株子叶下表皮进行观察的结果的微分干涉图像示于图28(e)，并且将表示试验例9 中对气孔蛋白过量表达株子叶下表皮进行观察的结果的微分干涉图像示于图28(f)。 需要说明的是，图28中，比例条表示50μm。

由图28所示的结果可知，在对spch变异株给予气孔蛋白的情况下以及使spch 变异株中的气孔蛋白过量表达的情况下，气孔均无增加[参照图28(b)和(e)]。因而， 这些结果暗示出，气孔蛋白基因增加气孔时依赖于SPCH基因所支配的通路。

(制备例14)

在制备例12中，不使用由ABRC订购的种子(品系编号SAIL_36_B6)而使用品 系编号SALK_011958，不使用表1所示的引物spch SAIL_36_B6LP和引物SAIL _36_B6_RP而使用表1所示的引物tmm SALK_011958-LP和引物SALK_ 011958-RP，除此以外，进行与制备例12同样的操作，得到TMM基因缺损的变异体 拟南芥(tmm变异株)。

(制备例15)

在制备例4中，不使用拟南芥Col-0品系而使用制备例14中得到的tmm变异株， 除此以外，进行与制备例4同样的操作，得到气孔蛋白过量表达tmm变异株。

(制备例16)

在制备例5中，不使用拟南芥Col-0品系而使用制备例14中得到的tmm变异株， 除此以外，进行与制备例5同样的操作，得到气孔蛋白表达抑制tmm变异株。

(试验例10)

SPCH调节受体样蛋白质TMM及其配体候选物EPF1和EPF2的基因表达(文献 5、13、14)。在气孔分化中，TMM在叶中发挥负作用，但在茎中发挥正作用(文献16)。 另一方面，EPF1和EPF2在两种器官中发挥负作用(文献4、5)。

因此，首先对气孔蛋白与受体样蛋白质TMM的相互作用进行了研究。对于拟南 芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]、制备例5中得到的气孔蛋白表达抑制株(气 孔蛋白表达抑制株10)、制备例4中得到的气孔蛋白过量表达株(气孔蛋白过量表达株 10)、制备例14中得到的tmm变异株、制备例15中得到的气孔蛋白表达抑制tmm变 异株和制备例16中得到的气孔蛋白过量表达tmm变异株，分别采集成熟的茎或第一 叶。接下来，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus  Microscope]对茎或第一叶的表面进行观察，对0.22mm²正方形范围中的气孔数进行测 定。并且计算出气孔密度。需要说明的是，在统计分析中使用统计分析软件R。另外， 进行Kruskal-Wallis检验。将试验例10中对植物体种类与茎中气孔密度的关系进行研 究的结果示于图29(a)，并将试验例10中对植物体种类与叶中气孔密度的关系进行研 究的结果示于图29(b)。图中，泳道1表示野生株，泳道2表示气孔蛋白表达抑制株， 泳道3表示气孔蛋白过量表达株，泳道4表示tmm变异株，泳道5表示气孔蛋白表 达抑制tmm变异株，且泳道6表示气孔蛋白过量表达tmm变异株。

另外，通过进行与试验例1同样的操作，对于野生株、气孔蛋白表达抑制株、气 孔蛋白过量表达株、tmm变异株、气孔蛋白表达抑制tmm变异株和气孔蛋白过量表 达tmm变异株各自的成熟第一叶或茎进行固定、透明化，然后对气孔进行染色。其 后，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope]对 上述第一叶下表皮或茎进行观察。将表示试验例10中对野生株、气孔蛋白表达抑制 株、气孔蛋白过量表达株、tmm变异株、气孔蛋白表达抑制tmm变异株和气孔蛋白 过量表达tmm变异株各自第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干涉图像示于图 30(A)，将表示试验例10中对野生株、气孔蛋白表达抑制株、气孔蛋白过量表达株、 tmm变异株、气孔蛋白表达抑制tmm变异株和气孔蛋白过量表达tmm变异株各自的 茎进行观察的结果的微分干涉图像示于图30(B)。需要说明的是，图中，(a)表示野生 株，(b)表示气孔蛋白表达抑制株，(c)表示气孔蛋白过量表达株，(d)表示tmm变异株， (e)表示气孔蛋白表达抑制tmm变异株，且(f)表示气孔蛋白过量表达tmm变异株。并 且，图中比例条表示100μm。

由图29和图30所示的结果吃惊地发现，在tmm变异株(10个独立品系T2植物) 中，即使进行气孔蛋白基因的过量表达使其为野生株中气孔蛋白基因表达量的 44.8±16.7倍的表达量，叶与茎这两者中的气孔数也无法增加。并且可知，即使在tmm 衍生体(10个独立品系T2植物)中进行气孔蛋白基因的表达抑制，也没有效果(在10 个独立品系T2植物中进行观察，参照图29和图30)。这些结果显示出，在气孔蛋白 对气孔产生的正调节中，TMM是必要的。并且认为EPF1和EPF2通过作为配体与 TMM结合而对气孔分化进行负调节。图29和图30所示的结果暗示出了气孔蛋白是 在与EPF1或EPF2竞争的情况下与TMM结合的可能性。

(制备例17)

在制备例12中，不使用由ABRC订购的种子(品系编号SAIL_36_B6)而使用品 系编号SALK_137549，并且不使用表1所示的引物spch SAIL_36_B6LP和引物 SAIL_36_B6_RP而使用表1所示的引物epf1SALK_137549-LP和引物SALK_ 137549-RP，除此以外，进行与制备例12同样的操作，得到EPF1基因缺损的变异体 拟南芥(epf1变异株)。

(制备例18)

在制备例5中，不使用拟南芥Col-0品系而使用制备例17中得到的epf1变异株， 除此以外，进行与制备例5同样的操作，得到气孔蛋白表达抑制epf1变异株。

(制备例19)

在制备例12中，不使用由ABRC订购的种子(品系编号SAIL_36_B6)而使用品 系编号SALK_047918，并且不使用表1所示的引物spch SAIL_36_B6 LP和引物 SAIL_36_B6_RP而使用表1所示的引物epf2SALK_047918-LP和引物SALK_ 047918-RP，除此以外，进行与制备例12同样的操作，得到EPF2基因缺损的变异体 拟南芥(epf2变异株)。

(制备例20)

在制备例5中，不使用拟南芥Col-0品系而使用制备例20中得到的epf2变异株， 除此以外，进行与制备例5同样的操作，得到气孔蛋白表达抑制epf2变异株。

(制备例21)

使制备例17中得到的epf1变异株与制备例19中得到的epf2变异株杂交，使后 代的F2代个体发芽，之后提取DNA，使用表1所示的引物epf1SALK_137549-LP 和引物SALK_137549-RP以及引物epf2SALK_047918-LP和引物SALK_ 047918-RP，挑选出在EPF1基因和EPF2基因这两者中插入有T-DNA的个体。由此 得到EPF1基因和EPF2基因缺损的双变异体拟南芥(epf2·epf2双变异株)。

(制备例22)

在制备例5中，不使用拟南芥Col-0品系而使用制备例21中得到的epf2·epf2 双变异株，除此以外，进行与制备例5同样的操作，得到气孔蛋白表达抑制epf2·epf2 双变异株。

(试验例11)

为了对气孔蛋白与EPF1或EPF2的“竞争性结合”的可能性进行研究，对于epf1 变异株或epf2变异株进行气孔蛋白基因表达的抑制，对“气孔密度”与“非气孔细 胞密度(气孔以外的细胞密度)”这两个指标进行分析。

对于拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)[野生株]、制备例5中得到的气孔蛋白 表达抑制株(气孔蛋白表达抑制株10)、制备例17中得到的epf1变异株、制备例18 中得到的气孔蛋白表达抑制epf1变异株、制备例19中得到的epf2变异株、制备例 20中得到的气孔蛋白表达抑制epf2变异株、制备例21中得到的epf1·epf2双变异株 和制备例22中得到的气孔蛋白表达抑制epf1·epf2双变异株，分别采集成熟第一叶。 接下来，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope] 对第一叶的表面进行观察，对0.22mm²正方形范围中的气孔数进行测定。并且计算出 气孔密度和非气孔细胞密度。另外，在统计分析中使用统计分析软件R。并进行Student 双侧t检验。将试验例11中对植物体种类与气孔密度的关系进行研究的结果示于图 31。并将试验例11中对植物体种类与非气孔细胞密度的关系进行研究的结果示于图 32。图中，泳道1表示野生株，泳道2表示气孔蛋白表达抑制株，泳道3表示epf1 变异株，泳道4表示气孔蛋白表达抑制epf1变异株，泳道5表示epf2变异株，泳道 6表示气孔蛋白表达抑制epf2变异株，泳道7表示epf1·epf2双变异株，且泳道8 表示气孔蛋白表达抑制epf1·epf2双变异株。星号表示p值小于0.01。

并且，对于野生株、气孔蛋白表达抑制株、epf1变异株、气孔蛋白表达抑制epf1 变异株、epf2变异株、气孔蛋白表达抑制epf2变异株、epf1·epf2双变异株和气孔蛋 白表达抑制epf1·epf2双变异株，分别采集成熟第一叶。并且通过进行与试验例1 同样的操作将上述第一叶固定、透明化，然后对气孔进行染色。其后使用微分干涉显 微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope]对上述茎进行观察。将 试验例11中表示对植物体第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干涉图像示于图 33。图中，(a)为表示试验例11中对野生株第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干 涉图像的附图代用照片，(b)为表示试验例11中对气孔蛋白表达抑制株第一叶的下表 皮进行观察的结果的微分干涉图像的附图代用照片，(c)为表示试验例11中对epf1变 异株第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干涉图像的附图代用照片，(d)为表示试 验例11中对气孔蛋白表达抑制epf1变异株第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干 涉图像的附图代用照片，(e)为表示试验例11中对epf2变异株第一叶的下表皮进行观 察的结果的微分干涉图像的附图代用照片，(f)为表示试验例11中对气孔蛋白表达抑 制epf2变异株第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干涉图像的附图代用照片，(g) 为表示试验例11中对epf1·epf2双变异株第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干 涉图像的附图代用照片，并且(h)为表示试验例11中对气孔蛋白表达抑制epf1·epf2 双变异株第一叶的下表皮进行观察的结果的微分干涉图像的附图代用照片。图中，比 例条表示100μm。

由图31和图33所示的结果可知，epf1变异株和epf2变异株各自的气孔密度高 于野生株的气孔密度，但在epf1变异株和epf2变异株各株中，在气孔蛋白基因的表 达被抑制的情况下，该气孔密度减少。由这些结果暗示出，气孔蛋白与EPF1、EPF2 独立地对气孔密度进行调节。

另一方面，在对“非气孔细胞密度”进行研究时，得到了不同的结果(参照图32)。 EPF2具有对于向气孔系细胞的分化进行负调节的功能。由图32所示的结果可知，epf2 变异体的非气孔细胞密度高于野生株的非气孔细胞密度。另外可知，在野生株中，在 气孔蛋白基因的表达受到抑制的情况下，非气孔细胞密度减少(在14个独立品系T2 植物中进行观察)。另一方面，在epf2变异体中，在气孔蛋白基因的表达受到抑制的 情况下，非气孔细胞密度并未减少(在11个独立品系T2植物中进行观察)。根据这些 结果认为，气孔蛋白以依赖于EPF2的形式对气孔系细胞的分化进行调节。由上述内 容可推测出，气孔蛋白基因具有EPF2依赖性的气孔系细胞的分化、以及EPF1或EPF2 非依赖性的气孔细胞的分化这两个功能。

根据以上结果，认为3种信号传递因子，也即气孔蛋白、EPF1和EPF2通过共 同的受体TMM对气孔分化进行调节。除了这些信号传递因子以外，已知SDD1基因 在TMM基因的上游发挥作用(文献9)。SDD1被认为是通过切断负调节因子的前体而 对气孔分化进行负调节的(文献9、18)。但是，SDD1显示出了与EPF1和EPF2的遗 传独立性(文献4～6)。作为其它可能性，认为有这样的假设：即，SDD1通过对作为 正调节因子的气孔蛋白(stomagen)进行分解而在气孔分化中发挥出负影响。

并且，由以上的结果暗示出，气孔的分化通过具有作为促进性信号的气孔蛋白与 作为抑制性信号的EPF1和EPF2这样的2种相反性质的信号进行调节。这样的基于 双向信号的调节系统对于更为精密地调节气孔密度是很重要的。并且还示出了来源于 叶肉细胞的气孔蛋白(stomagen)使表皮细胞中的气孔系细胞分化为气孔。这样的组织 间相互作用使气孔分化的概念得到发展。即，提供了“为了进行二氧化碳的有效摄取， 进行光合成的组织(叶肉)使气孔密度最佳化”这一新见解。并且，气孔蛋白(stomagen) 在应用上也是很重要的。以上结果暗示，通过进行气孔蛋白(stomagen)的基因重组； 或对发育中的作物、树木等植物直接给予气孔蛋白，可以增加气孔数和/或气孔密度， 使二氧化碳吸收量增大。

(试验例12)

使制备例5中得到的气孔蛋白表达抑制株(气孔蛋白表达抑制株10)、拟南芥Col-0 品系(CS60000)[野生株]或制备例4中得到的气孔蛋白过量表达株(气孔蛋白过量表达 株10)在短日条件下生长9周。

使用大气CO₂对光合成测定装置[LI-Cor社制造，商品名：LI-6400]进行校准。接 下来，设定光合成测定装置腔室的光强度。然后夹住野生株、气孔蛋白表达抑制株或 气孔蛋白过量表达株的叶子，保持该状态直至光合成测定装置的测定值稳定为止。其 后，对于气孔蛋白表达抑制株、野生株或气孔蛋白过量表达株，进行光合成速度以及 作为气体交换能力指标的气孔导度的测定。将试验例12中对气孔蛋白基因的表达模 式与光合成速度的关系进行研究的结果示于图34。并且，将试验例12中对气孔蛋白 基因的表达模式与气孔导度的关系进行研究的结果示于图35。图中，泳道1表示气 孔蛋白表达抑制株，泳道2表示野生株，并且泳道3表示气孔蛋白过量表达株。

由图34和图35所示的结果可知，气孔蛋白过量表达株中的光合成速度最大，且 气体交换能力最高。另一方面，由图34和图35所示的结果可知，气孔蛋白表达抑制 株中的光合成速度最小，且气体交换能力最低。由这些结果暗示出，植物中气孔蛋白 基因的表达量越多则光合成速度越大，且气体交换能力越高。

(实施例7)

将编码气孔蛋白的cDNA导入至pB2GW7中，得到气孔蛋白表达用载体。使用 所得到的气孔蛋白表达用载体，按照文献28所述的方法，在北海道大学山田哲也博 士的带领下制作出气孔蛋白过量表达大豆。

(试验例13)

分别采集实施例7中得到的气孔蛋白过量表达大豆和大豆(Kariyutaka)[野生株]的 叶。接下来，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope]对叶的表面进行观察，对0.22mm²正方形范围中的气孔数进行测定。并且 计算出气孔密度。另外，在统计分析中使用统计分析软件R。将试验例13中对植物 体种类与气孔密度的关系进行研究的结果示于图36。图中，泳道1表示气孔蛋白过 量表达大豆，且泳道2表示野生株。

另外分别采集气孔蛋白过量表达大豆和大豆(Kariyutaka)[野生株]的叶。并且通过 进行与试验例1同样的操作将上述叶固定、透明化，然后对气孔进行染色。其后，使 用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：Axioskop plus Microscope]对上述叶 进行观察。将试验例13中表示对气孔蛋白过量表达大豆的叶进行观察的结果的微分 干涉图像示于图37。并且将试验例13中表示对大豆(Kariyutaka)[野生株]的叶进行观 察的结果的微分干涉图像示于图38。图中，被框围住的部分表示气孔。另外，图中 比例条表示100μm。

由图36、图37和图38所示的结果可知，在大豆中，在气孔蛋白过量表达的情 况下，与大豆(Kariyutaka)[野生株](参照图38)相比，气孔密度也有所增加。因而，由 该结果可知，通过使气孔蛋白过量表达，可以增加大豆中的气孔数和/或气孔密度。

(试验例14)

将稻[品系「日本晴」]的种子播种在加入有脱盐水5mL的容器[50mL容积，Greiner 社制造]中，然后添加80μM的气孔蛋白(实施例5中得到的合成气孔蛋白)200μL。其 后将种子在22℃维持8天。然后使植物体在灭菌后的B5培养基中于22℃进行生长。 采集播种后第32天的稻的第二叶。并且通过进行与试验例1同样的操作将上述第二 叶固定、透明化，然后对气孔进行染色。其后，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制 造，商品名：Axioskop plus Microscope]对上述第二叶的下表皮进行观察。作为对照， 使用不给予气孔蛋白的稻，与上述同样地进行操作，对播种后第32天的稻的第二叶 下表皮进行观察。将试验例14中给予了合成气孔蛋白的稻的第二叶下表皮的微分干 涉显微图像示于图39(a)，并将试验例14中未给予合成气孔蛋白的稻的第二叶下表皮 的微分干涉显微图像示于图39(b)。图中，被框围住的部分表示气孔。图中比例条表 示50μm。

由图39所示的结果可知，与未给予合成气孔蛋白的稻的第二叶下表皮[参照图 39(b)]相比，给予了合成气孔蛋白的稻的第二叶的下表皮[参照图39(a)]中的气孔数和 气孔密度有所增加。因而，该结果暗示出，通过对稻给予气孔蛋白，可使稻中的气孔 数和气孔密度增加。

(实施例8)

将大豆(Kariyutaka)的种子播种在包含有培养土的罐中，使之发芽，之后一直生长 到第二叶期，将实施例5中得到的合成气孔蛋白添加至茎顶使其浓度为1μM、10μM 或100μM。其后，进行一周生长，使用微分干涉显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名： Axioskop plus Microscope]进行观察，对0.22mm²正方形范围中的气孔数进行测定。 并且计算出气孔密度。另外，在统计分析中使用统计分析软件R。并且，除了不添加 实施例5中得到的合成气孔蛋白而添加惰性多肽(气孔蛋白的氨基酸序列中的6个半 胱氨酸残基被置换为丝氨酸而成的多肽)使其浓度为100μM以外，进行与上述同样的 操作，计算出气孔密度。将实施例8对气孔蛋白浓度与气孔密度的关系进行研究的结 果示于图40。需要说明的是，图中，白三角、白方形和白圆形分别表示不同的个体。

由图40所示的结果可知，气孔蛋白浓度与气孔密度具有正相关关系。

(试验例15)

将含有¹¹C标记二氧化碳(¹¹CO₂)的空气供于拟南芥Col-0品系(储藏编号 CS60000)[野生株]或制备例5中得到的气孔蛋白表达抑制株(气孔蛋白表达抑制株10) 中。其后，使用正电子成像装置[浜松光电株式会社制造，商品名：PETIS]，对野生 株或气孔蛋白表达抑制株所摄取的¹¹CO₂进行测定。将试验例15对野生株或气孔蛋 白表达抑制株所摄取的¹¹CO₂进行测定的结果示于图41。图中，(a)表示通常的照片， (b)表示正电子图像。

由图41所示的结果可知，正常表达气孔蛋白的野生株中的二氧化碳固定量显著 高于气孔蛋白表达抑制株中的二氧化碳固定量。这些结果暗示出，通过植物中的气孔 蛋白的表达可增加二氧化碳固定能力。由此暗示了，可利用气孔蛋白来谋求植物体产 率的增加。

(试验例16)

对于实施例5中得到的化学合成气孔蛋白在60℃进行5分钟培养(试样编号3)或 在90℃进行5分钟培养(试样编号4)。并对实施例5中得到的化学合成气孔蛋白进行 冷冻干燥(试样编号5)。

利用灭菌后的B5培养基维持拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)的种子使其发 芽。对于发芽后第2天的拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)给予未处理气孔蛋白 (试样编号2)、于60℃进行5分钟培养的气孔蛋白(试样编号3)、于90℃进行5分钟 培养的气孔蛋白(试样编号4)、或冷冻干燥的气孔蛋白(试样编号5)，使其浓度为3μM。

其后，使拟南芥Col-0品系(储藏编号CS60000)在22℃生长3天。接下来采集子 叶，使用共聚焦显微镜[蔡司(Zeiss)社制造，商品名：LSM510META MICROSCOPE] 对其表面进行观察，对0.22mm²正方形范围中的气孔数进行测定。并且计算出气孔密 度。需要说明的是，在统计分析中使用统计分析软件R(网址 http://www.R-project.org)。另外，作为对照，使用未给予气孔蛋白的拟南芥Col-0品 系(储藏编号CS60000)，与上述同样地进行操作，计算出气孔密度(试样编号1)。将试 验例16中对试样种类与气孔密度的关系进行研究的结果示于图42。

由图42所示的结果可知，气孔蛋白对于热、干燥具有稳定性。

由以上结果暗示出，通过植物中气孔蛋白的过量表达或对植物给予气孔蛋白，可 使植物中的气孔数和/或气孔密度增加，并且可由此来谋求植物体产率的增加。

文献目录

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序列编号7为P10_prom_F的序列。

序列编号8为P10_prom_R的序列。

序列编号9为P10_F的序列。

序列编号10为P10_R的序列。

序列编号11为EPF1_F的序列。

序列编号12为EPF1_R的序列。

序列编号13为GFP-CfusF Bst的序列。

序列编号14为GFP-CfusR Bst的序列。

序列编号15为P-V_F的序列。

序列编号16为P-V_R的序列。

序列编号17为Venus_R的序列。

序列编号18为2Ssp_F的序列。

序列编号19为2Ssp<--p10m的序列。

序列编号20为2Ssp-->p10m的序列。

序列编号21为P10m_F的序列。

序列编号22为CACC_amiA的序列。

序列编号23为P10ami1_I miR-s的序列。

序列编号24为P10ami1_II miR-a的序列。

序列编号25为P10ami1_III miR*s的序列。

序列编号26为P10ami1_IV miR*a的序列。

序列编号27为P10ami2_ImiR-s的序列。

序列编号28为P10ami2_IImiR-a的序列。

序列编号29为P10ami2_IIImiR*s的序列。

序列编号30为P10ami2_IVmiR*a的序列。

序列编号31为amiB的序列。

序列编号32为P10_RNAi_F的序列。

序列编号33为P10_RNAi_R的序列。

序列编号34为tmm SALK_011958-LP的序列。

序列编号35为SALK_011958-RP的序列。

序列编号36为epf1SALK_137549-LP的序列。

序列编号37为SALK_137549-RP的序列。

序列编号38为epf2SALK_047918-LP的序列。

序列编号39为SALK_047918-RP的序列。

序列编号40为spch_SAIL_36_B6LP的序列。

序列编号41为SAIL_36_B6_RP的序列。