烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花

技术领域

本发明是一种烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花， 具体涉及烟草FT(Flowering locus T)基因NtFT1及其在诱导烟草早 花中的应用，属于分子生物学中的基因领域。

背景技术

植物开花是一个非常复杂的过程，受到外部环境因素和内部基因表达 的影响调控。对拟南芥开花分子机理的研究表明，拟南芥的开花受四 条途径控制，即光周期、自主途径、春化途径和赤霉素途径，光周期 途径信号经CO(CONSTANCE)传递给FT（Flowering Locus T），春化 途径和自主途径信号经FLC（Flowering Locus C）传递给FT，FT基 因的表达诱导诱导花分生组织特异基因AP1的表达，从而诱导开花。F T基因是控制植物开花信号的汇集点，所以FT基因在诱导植物早花的基 因工程研究中应用也最为广泛、最为有效。FT基因编码的蛋白质属于 磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）家族。不同作物的FT基因高度保守， 这为分离克隆FT基因提供了方便。转基因研究表明，过量表达FT基因 能够诱导拟南芥早花。另外从水稻、番茄、杨树、柑橘等中克隆的FT 基因的同源基因Hd3a、SFT、PtFT1和CiFT等也都能够诱导植物早花。

利用植物病毒载体表达外源基因是新近发展起来的一种基因瞬时表达 方法。与转基因方法相比，该方法操作简单，可在短期内使外源基因 迅速表达，而且能同时对多个品种进行感染。马铃薯X病毒（Potato  Virus X，PVX）作为外源基因的病毒表达载体被广泛应用。其载体构 建策略是将外源基因插入重复的CP（Ｃoat Protein）启动子之间， 利用CP基因的启动子来指导外源基因的表达。

烟草是我国主要经济作物之一。普通栽培烟草是短日照作物。我国烟 草育种工作虽然取得了明显的成绩，但目前生产上的主栽品种比较单 一。急需加大烟草品种选育工作的进度。烟草生育期比较长，是限制 烟草育种进程的一个主要因素。拟南芥FT基因能够有效缩短烟草开花 时间，而且北卡州立大学烟草育种组已经将该技术成功应用于烟草育 种。但是，由于FT基因受国际专利保护，限制了我国烟草育种家对该 基因的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱 导烟草早花，将源自烟草的控制植物开花时间的NtFT1基因全长编码序 列及其编码的蛋白序列。NtFT1基因是通过同源序列搜索，从中国烟草 基因组测序计划数据中经Blastn比对及剪切位点分析得到的。以此序 列涉及出一对NtFT1基因特异引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，克隆了 该基因。

本发明另一个目的在于还构建了NtFT1基因的PVX病毒表达载体，构建 的病毒表达载体经农杆菌渗滤侵染烤烟品种红花大金元、云烟87和K3 26，能诱导这些品种早花，证明该基因具有诱导烤烟早花的功能。将 NtFT1基因的PVX病毒瞬时表达系统用于烟草育种，可缩短烟草生育期 、加快育成烟草新品种的年限。

本发明是这样完成的：

本发明提供一个首次从烟草中获得植物开花时间调节基因的全长cDNA ，命名为NtFT1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。

本发明提供一对从烟草中克隆烟草NtFT1的PCR引物。引物序列为正向 引物：NtFT1-F: ATGCCAAGAGAACGTGAACC，反向引物NtFT1-R: TCAA TCGGCAGACCTTCTAC。

本发明提供一种从烟草中克隆烟草NtFT1基因的方法。具体而言，首先 利用拟南芥FT基因序列作为搜索序列，在Genbank烟草GSS数据库中用 tblastx程序进行比对，获得一致性最高的烟草基因组序列（FH96974 7.1），利用该序列搜索中国烟草基因组计划测序数据库，将该序列向 两侧延伸得到10000bp左右的基因组序列信息。通过剪切位点分析，获 得候选烟草FT基因的cDNA序列，如序列SEQ ID NO:1所示。根据候选 序列设计PCR引物NtFT1-F和NtFT1-R。取黑烟草Narrow leaf madol e即将开花烟株的叶片，利用Trizon（Invitrogen）试剂提取RNA，用 SuperScript RT Kit（Invitrogen）合成cDNA第一链，然后用NtFT 1-F和NtFT1-R进行RT-PCR（图1），PCR产物测序结果与候选序列100％ 一致。

扩增所述基因的全长或基因中任一片段的引物对属于本发明的保护范 围。

本发明还提供了NtFT1基因编码的多肽序列，其特征在于具有如SEQ  ID NO:2所示的177个氨基酸序列。

本发明的另一目的是这样完成的：构建烟草NtFT1基因的病毒瞬时表达 载体具体过程如下，将已构建的拟南芥FT基因的PVX表达载体pCAM﹕p GR106-FT的FT基因用Cla I和Sal I切下，回收大片段质粒片段。由 于NtFT1基因里有Sal I酶切位点，所以在扩增NtFT1 cDNA片段的正 反引物上分别引物 Cla I和Xho I（F: ATCGAT ATGCCAAGAGAACGTGAACC，下划线所示为Cla  I酶切位点；R: CTCGAGTCAATCGGCAGACCTTCTAC，下划线所示为Xho I酶 切位点 ），Xho I是Sal I的同尾酶。PCR产物经测序验证后与上述 回收的载体片段连接，获得NtFT1 PVX瞬时表达载体pCAM﹕pGR106-N tFT1。构建好的载体进行酶切验证（图2）。

本发明还提供了NtFT1基因在调节烟草开花中的应用。将上述PVX病毒 表达载体pCAM﹕pGR106-NtFT转化农杆菌菌株GV3101，经农杆菌渗滤后 ，使NtFT1在受体烟株中瞬时表达，促使烟草在渗滤后40～50天开花。

构建的重组载体（pCAM﹕pGR106-NtFT1）能够诱导烟草早花，应用于 烟草育种，可以缩短烟草开花时间，达到缩短育种年限的目的，这方 面的应用同时受本发明的保护。

除上述构建的PVX病毒载体外，利用所述基因构建的其他瞬时表达载体 、转基因植物表达载体或利用所述基因任何部分片段构建的RNA干涉载 体，都在本发明的保护范围之内。

本发明还保护利用所述基因及任何部分片段进行的转基因研究。

附图说明

图1 为NtFT1基因全长cDNA片段的RT-PCR扩增电泳图谱。

图2 为NtFT1基因PVX瞬时表达载体的酶切验证电泳图谱。

其中pCAM﹕pGR106-NtFT酶切验证，用Cla I和Sal I酶切得到389bp 片段。

图3 来源于不同植物的FT基因的多序列比对。

图4 A为烟草FT基因NtFT1基因的PVX系统能够诱导烤烟红花大金元。

图4 B为烟草FT基因NtFT1基因的PVX系统能够诱导烤烟云烟87。

图4 C为烟草FT基因NtFT1基因的PVX系统能够诱导烤烟K326早花。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

任何在本发明基本精神上地改进或替代，仍属于本发明权利要求书所 要求保护地范围。下述实施例中地实验方法，如无特殊说明，均为常 规方法。

下述实施例中所用到地试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂 。

NtFT1基因cDNA序列信息的获得

首先利用拟南芥FT基因氨基酸序列（AEE34381.1）作为搜索序列，在 Genbank烟草GSS数据库中用tblastn程序进行比对，获得一致性最高的 烟草基 因组序列（FH969747.1），一致性为68％。利用该序列搜索中国烟草 基因组计划测序数据库，将该序列向两侧延伸，得到10000bp左右的基 因组序列信息。通过剪切位点分析，获得候选烟草FT基因的CDS区序列 。根据候选序列设计扩增基因全长cDNA的PCR引物，正向引物：NtFT1 -F: ATGCCAAGAGAACGTGAACC，反向引物NtFT1-R: TCAATCGGCAGACCT TCTAC。

NtFT1基因全长CDS的克隆

取黑烟草Narrow leaf madole即将开花烟株的叶片，利用Trizon（ Invitrogen）试剂提取RNA，具体步骤如下：叶片用液氮研磨100mg叶 片成粉末后，转入已加有1ml Trizol的1.5ml离心管中，剧烈震荡使 粉末分散，使细胞裂解完全。15～3℃孵育5 min，加入0.2ml 氯仿 ，用力振摇15 sec。15～30℃下孵育2～3min，12,000g 4℃离心15 min，小心吸取上层无色液体移入一新的1.5ml离心管中。加入0.5ml异 丙醇，混匀，15～30℃下孵育10min，12,000g 4℃离心15min。去上 清，沉淀加入1ml DEPC水配制的75％乙醇，轻微振荡15 sec，7,50 0g 4℃离心5min。小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3 ～5min。加入30～50μl DEPC水溶解，-80℃冰箱保存。提取的RNA经 分光光度计（NenoDrop）测定浓度并用甲醛变性电泳检测完整性。

用SuperScript RT Kit（Invitrogen）合成cDNA第一链，然后用Nt FT1-F和NtFT1-R进行RT-PCR（图1），PCR反应体系：cDNA模板1μl，  5X Phusion HF Buffer 4μl，dNTP（10mM）0.4μl，正反向引 物各1μl（10μM），Phusion DNA Polymerase 0.2μl，灭菌蒸馏 水补足20μl。PCR扩增条件为：98℃预变性30sec；98℃变性10sec， 58℃退火30sec，72℃延伸15sec，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物 经1％琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带后连接、测序。测序结果与 候选序列100％一致，序列见SEQ ID NO:1。

NtFT1序列分析

FT基因属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）家族，利用预测的NtFT1蛋 白序列在NCBI 利用Protein Blast搜索同源序列，NtFT1蛋白序列与 番茄（AA031792，一致性95％，E value：1e-120）、黄瓜（BAH282 53，一致性88％，E value：7e-113）、梅（BAH82787，一致性89％ ，E value：6e-112）、番木瓜（ACX85427，一致性90％，E value ：4e-112）、荔枝（AEU08962，一致性87％， E value：1e-111）等的FT基因同源性较高。将以上序列及拟南芥FT 基因（AF152096）进行多序列比对，NtFT1含有PEBP家族典型的保守结 构域DPDxP、氨基酸残基His、GxHR、xYN、氨基酸残基Q等（图3）。

NtFT1 PVX病毒表达载体的构建

构建了NtFT1基因的PVX瞬时表达载体。具体过程如下，将载体pCAM﹕ pGR106-FT用Cla I和Sal I切下，回收大片段质粒片段。由于NtFT1 基因里有Sal I酶切位点，所以在扩增NtFT1 cDNA片段的正反引物上 分别引入Cla I和Xho I（F: ATCGAT ATGCCAAGAGAACGTGAACC，下划线所 示为Cla I酶切位点；R: CTCGAGTCAATCGGCAGACCTTCTAC，下划线所示为X ho I酶切位点 ）酶切位点，Xho I是Sal I的同尾酶。PCR产物经 测回收后连入pCR2.1载体，并测序。测序结果正确的克隆提取DNA，进 行酶切，并与上述回收的载体片段连接，获得NtFT1 PVX瞬时表达载 体pCAM﹕pGR106-NtFT1。构建好的载体进行酶切验证（图2）。

表达载体导入农杆菌

农杆菌GV3101感受态细胞置于冰上解冻，加入2μg pCAM﹕pGR106-N tFT质粒DNA，轻敲离心管混匀，冰上放置30min，置于液氮中1min，迅 速转入37℃水浴5min，在冰上放置2min左右，加入1ml不含抗生素的L B培养基，于28℃振荡培养2h；取200μl涂布于含卡那霉素（100mg/L ）和利福平（25mg/L）的LB培养基上，28℃培养2天。利用菌落PCR方 法检测阳性克隆。

农杆菌渗滤使NtFT1瞬时表达诱导烟草早花

渗滤液准备：将穿刺培养的含有pCAM﹕pGR106-NtFT的农杆菌菌种接种 于3ml 含有卡那霉素的YEP培养基，28℃过夜振荡培养；第二天，将 1ml培养物转入50ml含有MES和抗生素的YEP培养基（45ml YEP，5ml  100mM的MES，50μl 25 mg/L的利福平，50μl 100 mg/L的卡那霉 素，6.67μl 150mM），28℃过夜振荡培养；第三天，分光光度计检 测培养物OD₆₀₀，6000g，4℃离心15min，去上清，利用渗滤buffer（10 mM MgCL₂，10mM MES，150μM acetosyrigone）重悬菌体，并调整 菌液浓度（OD₆₀₀大约为1）。

烟草农杆菌渗滤

烟草品种为红花大金元、云烟87和K326，利用4～5片叶的烟苗（播种 后 40天左右）进行渗滤。选取下部两片叶进行渗滤，并提前用记号笔标 记。具体渗滤过程为，用3ml一次性注射器吸取渗滤液，轻轻压注射器 ，用手指在叶片正面支撑，使渗滤液轻轻渗入叶片背面，可能需要多 次操作，直到整个叶面湿润为止。以空载体pCAM﹕pGR106和渗滤buff er为对照。

渗滤pCAM﹕pGR106-NtFT1处理在渗滤后40～50天开花，而空质粒（pC AM﹕pGR106）和buffer处理仍处于营养生长阶段（图4）。说明NtFT1 具有促进烟草开花的功能。

序列表

<110>  云南省烟草农业科学研究院

<120>  烟草FT基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花

<130>  2012

<160>  2    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  534

<212>  DNA

<213>  Nicotiana tabacum

<220>

<221>  gene

<222>  (1)..(534)

<400>  1

atgccaagag aacgtgaacc tctggtagtt ggtcgagtga taggggatgt attggaccct     60

ttcacaagat ctattggcct aggagttatt tatagggata gagaagttaa taatgggtgt    120

gagcttaggc cttcccaagt tattaaccag cccagggttg aagttggtgg agatgacctt    180

cgtacctttt acactctggt tatggtggac cctgatgctc caagtccaag tgatccaaat    240

ctaagagaat acctccattg gttggtcact gatattccag ctaccacagg tgcaagtttt    300

ggccaggaaa ttgtgtgcta tgaaagtcca aggccaacaa tgggaataca tcgctttgta    360

ttcgtattgt ttagacaatt gggtcgacag acagtgtatg ctccaggatg gcgtcagaat    420

ttcaatacaa aagattttgc tgaactctat aatcttggtt taccagttgc tgctgtctat    480

tttaattgtc aaagagagag tggcagtggt ggacgtagaa ggtctgccga ttga          534

<210>  2

<211>  177

<212>  PRT

<213>  Nicotiana tabacum

< 

Met Pro Arg Glu Arg Glu Pro Leu Val Val Gly Arg Val Ile Gly Asp

1               5                   10                  15     

Val Leu Asp Pro Phe Thr Arg Ser Ile Gly Leu Gly Val Ile Tyr Arg

            20                  25                  30         

Asp Arg Glu Val Asn Asn Gly Cys Glu Leu Arg Pro Ser Gln Val Ile

        35                  40                  45             

Asn Gln Pro Arg Val Glu Val Gly Gly Asp Asp Leu Arg Thr Phe Tyr

    50                  55                  60                 

Thr Leu Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asp Pro Asn

65                  70                  75                  80 

Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro Ala Thr Thr

                85                  90                  95     

Gly Ala Ser Phe Gly Gln Glu Ile Val Cys Tyr Glu Ser Pro Arg Pro

            100                 105                 110        

Thr Met Gly Ile His Arg Phe Val Phe Val Leu Phe Arg Gln Leu Gly

        115                 120                 125            

Arg Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Asn Thr Lys

    130                 135                 140                

Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val Tyr

145                 150                 155                 160

Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ser Gly Ser Gly Gly Arg Arg Arg Ser Ala

                165                 170                 175    

Asp