用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒与疫苗

技术领域

本发明涉及一种用哺乳动物细胞系生产的禽呼肠孤病毒与疫 苗的方法及产品，属于兽用疫苗领域。

背景技术

禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus，简称ARV)在世界范围内广泛存 在，广泛流行于鸡、火鸡中，它引起的关节炎、腱鞘炎及免疫抑制等 给养鸡业带来重大经济损失。目前，我国控制禽呼肠孤病毒的主要手 段是使用减毒活疫苗或全病毒灭活苗通过免疫接种来控制鸡呼肠孤 病毒感染，而我国目前所用的禽呼肠孤病毒疫苗均为国外进口疫苗， 使用鸡胚或鸡胚成纤维细胞培养生产病毒，使得制备的疫苗价格很 高，且工艺复杂，造成养殖户防治ARV的成本升高。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用哺乳动物细胞系 生产的禽呼肠孤病毒及禽呼肠孤病毒灭活疫苗及其方法，以提供 一种鸡胚源的灭活疫苗批间差异更小，免疫效力更佳的禽呼肠孤病 毒灭活疫苗，从而实现更安全、更有效地生产禽呼肠孤病毒及疫苗 的目的。

技术方案

用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒的方法，包括以下步骤：

1)将收获的禽呼肠孤病毒，接种至长满单层的哺乳动物细胞系， 使用细胞维持液培养；

2)接种培养后，收获禽呼肠孤病毒

优选地，用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒的方法，上述步骤 1)具体地包括：

a)细胞毒种的繁殖，即：使用禽肾细胞对禽呼肠孤病毒继代；

b)禽呼肠孤病毒适应哺乳动物细胞的步骤，即：将经过继代处理 的禽呼肠孤病毒，接种于长满单层的哺乳动物细胞系，使用细胞维持 液培养，至出现CPE大于75％时，收获禽呼肠孤病毒，作为制苗用 毒种；

c)制苗毒液的繁殖，即：将收获的禽呼肠孤病毒，接种至长满单 层的哺乳动物细胞系，使用细胞维持液培养；

优选地，上述步骤2)为制苗毒液的收获，即：接种培养6～7天 后，收获禽呼肠孤病毒。

本发明对所用的哺乳动物细胞系没有特别的限制，即本发明可 以使用任意的哺乳动物细胞系；优选地，可以使用Vero细胞系(非 洲绿猴肾细胞系)、MDCK细胞系(马-达二氏犬肾细胞系)、PK-15 细胞系(猪肾细胞系)、Marc145细胞(上皮样细胞系，来源于猴 肾细胞)、ST细胞(猪睾丸细胞系)、IBRS-2细胞(猪肾细胞系) 任意一种或几种细胞系；更优选地，使用Vero细胞系或MDCK细 胞系；最优选地，使用Vero细胞系生产禽呼肠孤病毒与疫苗。

优选地，本发明的禽呼肠孤病毒在接种至哺乳动物细胞系生产 前，要使用禽类肾细胞继代(在本发明中也可以称为传代)14代～ 18代；更优选地，使用SPF鸡胚肾细胞(CK细胞)进行继代(或 传代)；最优选地，在继代处理后还包括在使用前在禽肾细胞继代 (或传代)一次。

优选地，本发明步骤2)收获的禽呼肠孤病毒的效价为大于 4×10⁷TCID₅₀/ml。

本发明对禽呼肠孤病毒没有特别的限制，即本发明的方法可以 使用哺乳动物细胞系生产任意类型的禽呼肠孤病毒；优选地，本发 明所述的禽呼肠孤病毒是禽呼肠孤病毒AV2311株。

本发明的另一目的在于提供一种用哺乳动物细胞系生产禽呼肠 孤病毒灭活疫苗的方法，即使用上述方法获得的禽呼肠孤病毒，加 入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂，乳化后获得禽 呼肠孤病毒灭活疫苗。

由上可知，本发明可以使用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒 及禽呼肠孤病毒灭活疫苗。即，发明人意外地发现在禽呼肠孤病毒 在禽类肾细胞继代处理后，可以帮助禽呼肠孤病毒更适应在哺乳动 物细胞上的生长与繁殖，从而获得一种高滴度、质量批次稳定的禽 呼肠孤病毒；另外，发明人还发现在利用哺乳动物细胞培养禽呼肠 孤病毒前，使用至少一次的禽源细胞预培养或适应，可以使得禽呼 肠孤病毒在哺乳动物细胞的生产更有利。因此，本发明可以利用哺 乳动物细胞来生产禽呼肠孤病毒，而利用本发明的禽呼肠孤病毒在 哺乳动物细胞系获得的禽呼肠孤病毒灭活疫苗比鸡胚源的灭活疫苗 批间差异更小，免疫效力更佳。

具体实施方式

本发明实施例中使用了常见的商业化的容易培养的细胞系如 Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、BHK-21细胞(幼仓鼠肾传代细胞)、 PK-15细胞(猪肾细胞)、Marc145细胞(上皮样细胞，来源于猴肾 细胞)、ST细胞(猪睾丸细胞)、IBRS-2细胞(猪肾细胞)等细胞 或细胞系生产禽呼肠孤病毒及疫苗。

本发明对禽呼肠孤病毒没有特别的限制，即本发明的方法可以使 用哺乳动物细胞系生产任意类型的禽呼肠孤病毒；本发明实施例中所 用的禽呼肠孤病毒是禽呼肠孤病毒AV2311株(购自中国兽医药品监 察所保藏号为CVCC AV2311，于1979年11月30号保藏与国家兽医 微生物菌种保藏管理中心)。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本 发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的 范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法 进行。

实施例1：使用Vero细胞制备禽呼肠孤病毒及禽呼肠孤病毒灭活疫苗

(1)制苗用细胞的选择：选用非洲绿猴肾(Vero)细胞，购自上海生 化所。

(2)制苗用细胞的传代与培养：Vero细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消 化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传 代或接种病毒。

(3)细胞毒种繁殖：

鸡胚肾细胞(CK细胞)的制备：取17-20日龄SPF鸡胚10只，剪 开腹腔，移出内脏，用镊子仔细分离肾脏的包膜，然后取出肾脏，以Hank’ s液洗3次，再将其剪成1mm³的方块，加入适量0.25％胰酶，以37℃ 水浴消化15min。倒出胰酶，再以Hank’s液洗3次，经大口吸管吹打分 散，以水解乳蛋白培养液悬浮细胞，上层液经8层纱布过滤，收集的细 胞液定量至细胞数约为100万/ml。加入10％小牛血清，分装后于37℃ 培养48h即可长成单层。禽呼肠孤病毒在CK细胞上传代(即继代)14 代。

先将AV2311株病毒液在禽肾细胞上传代(即继代)一次，将有细 胞病变(CPE)的培养物接种于长满单层的Vero细胞，加入细胞维持液， 置37℃继续培养，待出现75％CPE时，弃去维持液，加入2ml灭菌纯水， -70℃反复冻融3次后收获，作为生产用细胞毒种。

(4)制苗毒液的繁殖：取已形成单层的Vero细胞培养瓶，弃去细 胞生长液，接种含3％v/v生产用细胞毒种的维持液，置37℃继续培养， 接毒后6日收获病毒液，-15℃以下保存，使病毒效价检测达到 4×10⁷TCID50/ml。病毒效价的测定方法如下：a.取一瓶细胞，消化， 吹匀后，加于96孔板中，置于5％的CO2培养箱37℃中培养，96孔板 中细胞长至细胞方瓶底面面积的60％-70％时，一般是24h之内；b.用无 血清的DMEM培养液对病毒进行10倍体积连续倍比稀释(即 10-10-10-10)。c.从CO2培养箱中取出96孔细胞板，用无血清的DMEM 培养液洗涤一次，以除去血清，避免血清对病毒吸附的干扰。d.将稀释 后的病毒液加到96孔细胞板中，每个稀释度至少接种4孔，每孔100ul。 并设正常细胞对照。e.37℃，5％的CO2培养箱孵育1h后，换成含1.5％v/v 胎牛血清的维持液，继续培养72h，观察CPE，按Reed-Muench法计算 TCID50。

(5)疫苗灭活：将收获的病毒液，使用甲醛灭活16h，所述甲醛溶 液浓度为34％，加入量为灭活溶液体积的2‰，37℃灭活16h，每2h摇 动一次。

(6)乳化：加入乳化剂吐温-80，吐温-80占水相体积的1％，水相 与油相比例为3∶5，其中水相即是灭活的病毒液，油相为乳化时用的白 油，用乳化机以12,000转/分乳化10min，制成禽呼肠孤病毒灭活疫苗， 每0.2ml含病毒含量10^3.5TCID50。

该疫苗经性状测定为油包水类型，稳定性良好，粘度适中。疫苗 在20℃放置4个月，4℃放置59个月，未出现分层。

安检：取使用剂量的10倍量即10^4.5TCID₅₀/0.2ml足垫免疫1日龄 SPF鸡，观察2周，足垫接种部位无炎症反应等情况出现。

效检：用使用剂量即10^3.5TCID₅₀/0.2ml颈背部皮下免疫1日龄鸡， 2周后，用强毒攻击，保护率达到100％。免疫鸡只1周内产生免疫应答， 2周内，即可产生足够的免疫力，免疫期为2个月，免疫期间攻毒保护 率为96.2％-98.9％。

上述方法中所用细胞生长液的配方是：95％体积DMEM液、5％体 积胎牛血清、加适量抗菌素，PH值调整为7.2。

上述所用细胞维持液的配方是：98.5％体积DMEM液、1.5％体积 胎牛血清、加适量抗菌素，PH值调整为7.4。

实施例2：细胞源ARV灭活疫苗与鸡胚源ARV鸡胚源灭活疫苗的检验 结果比较

1材料

1.1疫苗 按照实施例1制备ARV灭活疫苗(细胞系源)3批，批号： 试Vero20110301、试Vero20110302、Vero20110303。鸡胚源3批，批 号：201101、201102、201103，制备方法见本实施例2.1。

1.2SPF蛋和SPF鸡 购自北京梅里亚维通生物技术有限公司。

2ARV鸡胚源灭活疫苗制备方法与结果

2.1制备鸡胚源ARV灭活疫苗：

a.病毒繁殖：将AV2311株毒种在鸡胚上繁殖传代，使病毒效价检 测达到10^10.5EID₅₀/0.2ml；b.疫苗灭活：甲醛灭活16h，所述甲醛溶液浓 度为34％，加入量为灭活溶液体积的2‰；c.油相制备：在白油中按2‰ 加入硬脂酸铝，按5‰加入司本-80熬制而成；d.乳化：加入乳化剂吐 温-80，吐温-80占水相体积的1％，水相与油相体积比为3∶5，其中水 相即是灭活的病毒液体，油相为乳化时用的白油。用乳化机以12000转 /分乳化10分钟，制成ARV鸡胚源灭活疫苗。

2.2物理性状检验：肉眼观察疫苗外观，6批疫苗均为乳白色均匀 乳剂；剂型均为油包水(W/O)型；取6批苗各1管(15ml)在37℃放 置21日，均无破乳；用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm) 吸取25℃左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需 的时间，结果6批疫苗流出时间分别为3.5秒、3.5秒、3.6秒、3.5秒、 3.7秒、3.5秒，均在8秒以内。

2.3无菌检验 按现行《中国兽药典》对6批ARV疫苗进行检验， 均无细菌生长。

2.4安全检验 用3周龄SPF鸡120只，分为6组，每组20只，每 批苗分别肌肉注射疫苗2羽份(1ml)，观察21天，结果见表1。

表1安全检验结果比较

2.5效力检验：用2周龄SPF鸡130只，分成7组，前6组每组20 只，第7组10只，每批苗分别肌肉注射1羽份(0.5ml)，第7组10只 不接种作为对照，21日后，对所有免疫鸡和对照鸡采血，分离血清，采 用禽病毒性关节炎ELISA抗体检测试剂盒检测血清抗体效价，在波长 405～410nm处读取各样品的OD值。当阴性对照血清的OD值不高于 0.250、阳性对照血清的OD值在0.250～0.900之间时，试验成立。免疫 鸡血清平均OD值应比对照鸡血清的OD值至少高0.2.

采血后，对免疫鸡和对照鸡进行攻毒，每只肌肉注射禽病毒性 关节炎强毒Olson WVU2937株10^3.0EID₅₀，观察21日。对照组应至少出 现病毒性关节炎临床症状或足垫肿胀，免疫组应至少14只鸡存活且无 病毒性关节炎临床症状或足垫肿胀。6批苗的效力检验结果见表2。

表2效力检验结果比较

3小结

参照《兽用生物制品质量标准汇编》(2010年版)禽病毒性关节炎 灭活苗成品检验方法，结果显示：用细胞系生产的3批ARV灭活苗安 全检验均合格；从免疫后21天采血测抗体结果可以看出，3批细胞系源 苗比鸡胚源苗批间差异小；通过攻毒试验证明，肌肉注射3批细胞系源 苗0.5羽份均能抵抗ARV强毒的攻击，且一半的免疫剂量产生的保护率 高于鸡胚源灭活苗。

因此，利用本发明的禽呼肠孤病毒在哺乳动物细胞系获得的禽 呼肠孤病毒灭活疫苗比鸡胚源的灭活疫苗批间差异更小，免疫效力 更佳。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。