摘要:为建立禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,Sal Ⅰ单酶切得到线性化转录模板DNA,体外转录出RNA,梯度稀释作为阳性模板,用于标准曲线的制定.根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域设计一对扩增片断为147bp的特异性引物,以体外转录的RNA作为标准品,应用SYBR Green Ⅰ染料法建立了检测禽呼肠孤病毒的一步法实时荧光定量RT-PCR方法.对禽呼肠孤病毒阳性样品进行了特异性、敏感性和重复性试验,结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,比常规的RT-PCR敏感103倍,可检测到每个反应相当于5.2×102个拷贝的标准品RNA,与NDV、IBDV、MG都不反应;从攻毒鸡的关节组织可以检测到病毒,病毒含量在105-107个拷贝/uL之间.建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染ARV的检测.