孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法

技术领域

本发明属于分离提取DNA技术领域。

背景技术

出生缺陷指婴儿出生时就存在的各种包括身体结构、智力或代谢等方面的异常。我国是世界上缺陷新生儿的高发国家之一，全国每年出生的2000万名新生儿有5%存在出生缺陷，每30秒就有一个缺陷儿出生。出生缺陷可由染色体畸变、基因突变等遗传因素引起,也可由这两种因素交互作用或其他不明原因所致。现有的科研成果显示基因突变在出生缺陷发生中发挥重要性，所以对胎儿DNA变异的产前筛查是降低出生缺陷的重要手段。

胎儿DNA变异检测的材料必须来自胎儿自身，传统的产前诊断是建立在羊膜腔穿刺、绒毛吸取等侵入性基础上进行的细胞遗传学诊断，虽然诊断准确，但因其操作有创伤性，易引起宫内感染、流产、甚至对胎儿有一定的影响，属于侵入性检查。而孕妇血浆中胎儿游离DNA的提取只需要采集孕妇血浆标本，无需穿刺羊膜腔和插入绒毛组织，具有对胎儿无任何创伤、可在妊娠早期诊断等优点， 属于非侵入性胎儿遗传病产前筛查，安全而易于推广。

由于通常人类血浆中游离DNA的总浓度为1-100 ng/mL，胎儿DNA只占孕妇血浆中总DNA的5％ ～7％，比例较低。大量母源DNA背景无疑增加了对于胎儿游离DNA检测的难度，而且游离于母血中的胎儿DNA为短片断，一般小于200bp，不易捕获。因此，从孕妇外周血富集到高浓度和高纯度的胎儿DNA是开展非侵入性产前胎儿筛查的关键，需要开发专用技术。

人血浆或血清中纯化并浓缩游离DNA和RNA的技术和试剂盒主要用于血浆中总DNA的提取，不能满足从孕妇血浆或血清中纯化并浓缩胎儿DNA的需要，难以进行胎儿遗传病产前筛查，而且进口的试剂和试剂盒价格昂贵。中国专利200610013153.5公开了一种富集孕妇血浆中胎儿游离DNA的方法，能够有效提高孕妇血浆中胎儿DNA的提取率，但其对于胎儿DNA的提取率太低，难以保证产前筛查的准确性，不能满足胎儿遗传病产前筛查的要求。

发明内容

本发明提供一种孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，采用蛋白酶复合剂将蛋白质降解为小肽或氨基酸，从而实现DNA与蛋白质高效分离，提取液中胎儿DNA占总DNA的90%以上，能够满足胎儿遗传病产前筛查的需要，为开展非侵入性胎儿遗传病产前筛查提供必要的技术保障。

本发明所采取的技术方案是：

一种孕妇外周血中胎儿DNA的提取方法，包括下述步骤：

（1）采集孕妇外周血5-10mL，加入EDTA抗凝，4℃下1200-1700g离心5-10分钟，吸取上清液；

（2）在步骤（1）所得上清液中加入蛋白酶复合剂，4℃下1200-1700g离心5-10分钟，吸取上层水相；

（3）在步骤（2）所得上层水相中加入Tris饱和酚混匀，4 ℃下4000-4600g离心25-35分钟，吸取上层清液；

（4）在步骤（3）所得上层清液中加入氯仿/异戊醇混合液充分混匀, 4℃下4000-4600g，离心5-10 分钟，吸取上层水溶液；

（5）在步骤（4）所得上层水溶液中加入体积浓度为95 %的乙醇充分混匀，4 ℃下7000-9000g高速离心5-10 分钟，取得DNA沉淀；

（6）加20-100mL TE溶解DNA沉淀，TE溶解的DNA溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，选择切取目的条带固定，得到胎儿DNA粗回收液；

（7）胎儿DNA粗回收液用100-200mL无水乙醇沉淀DNA, 20-100mL TE溶解DNA沉淀，得到DNA提取液。

蛋白酶复合剂中蛋白酶K的浓度为5-20mg/mL、纤维蛋白溶酶的浓度为1000-5000pg/mL，木瓜蛋白酶的浓度为100-400ng/mL和胃蛋白酶的浓度为5-10ng/mL。

氯仿/异戊醇的混合液中氯仿/异戊醇的体积比为24：1。

步骤（2）中加入上清液总体积8-14%的蛋白酶复合剂。

步骤（3）中加入与上层水相等体积的Tris饱和酚。

步骤（4）中加入与上层清液等体积的氯仿/异戊醇混合液。

步骤（5）中体积浓度为95 %的乙醇的加入量为上清水溶液体积的1.5-3.0倍。

步骤（5）中所述乙醇的温度为4℃。

血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，人体外周血游离 DNA分子常常以与蛋白质结合的形式存在，染色质的基本结构就是由DNA与组蛋白结合构成。同时血浆中含有丰富的蛋白，包括白蛋白与纤维蛋白等，易于同DNA结合，因此清除蛋白质是提取外周血游离DNA的关键。制备 DNA的原则是既要将 DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持 DNA 分子的完整性。目前，采用蛋白酶K（proteinase K）对蛋白质进行水解，为了提高水解效率，本发明的蛋白酶复合剂不但含有蛋白酶K，还增加了低浓度的纤维蛋白溶酶（fibrinolysin），木瓜蛋白酶﹙Papain﹚和胃蛋白酶。其中，纤维蛋白溶酶在纤维蛋白溶解过程中能够起到催化作用，胃蛋白酶作为一种消化性蛋白酶，可以将蛋白质分解为小的肽片段，木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性条件下均能分解蛋白质的蛋白酶。因此，蛋白酶复合剂可以高效地溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，从而使 DNA与蛋白质分开。同时蛋白酶复合剂能迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，以保证DNA分子不被降解，可使孕妇外周血游离DNA富集效果在原有基础上提高了20%。

在胎儿游离DNA提取过程中，抗凝剂的使用、离心速度等都会影响提取DNA的量和实验结果的准确性、可靠性。离心技术用于外周血细胞的清除，血浆蛋白的清除和200bp DNA片段的沉淀等目的，离心速度、时间会影响外周血细胞和血浆蛋白的清除，以及DNA的纯度和得率。过低的温度使得酶反应不充分而影响对蛋白质的降解，从而对胎儿游离DNA造成污染，过高的温度可降解DNA分子，影响离心最终获得DNA的质和量，因此将温度设定为4℃。

为了保证提取DNA的量和实验结果的准确性、可靠性，本申请对抗凝血的离心速度、时间、温度等参数等均进行了调整与优化，以提高提取样本的可靠性。

分别采用蛋白酶K和蛋白酶复合剂进行进行DNA提取，提取结果见下表：                                                

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本申请采用蛋白酶复合剂将蛋白质降解为小肽或氨基酸，从而实现DNA与蛋白质高效分离，提取液中胎儿DNA占总DNA的90%以上，能够满足胎儿遗传病产前筛查的需要，为开展非侵入性胎儿遗传病产前筛查提供必要的技术保障。

具体实施方式

实施例1

（1）采集孕妇外周血8mL，加入EDTA抗凝，4℃下1700g离心8分钟，吸取上清液；

（2）在步骤（1）所得上清液中加入上清液体积14%的蛋白酶复合剂，4℃下1700g离心5分钟，吸取上层水相；

（3）在步骤（2）所得上层水相中加入等体积的Tris饱和酚混匀，4 ℃下4300g离心28分钟，吸取上层清液；

（4）在步骤（3）所得上层清液中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液充分混匀, 4℃下4000g，离心10 分钟，吸取上层水溶液；氯仿/异戊醇的混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。

（5）在步骤（4）所得上层水溶液中加入2.5倍体积的的乙醇（95 %，v/v）充分混匀，4 ℃下9000g高速离心5分钟，取得DNA沉淀；乙醇的温度为4℃。

（6）加50mL TE溶解DNA沉淀，TE溶解的DNA溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，选择切取目的条带固定，得到胎儿DNA粗回收液；

（7）胎儿DNA粗回收液用180mL无水乙醇沉淀DNA,100mL TE溶解DNA沉淀，得到DNA提取液。

本实施例中，蛋白酶复合剂中蛋白酶K的浓度为5mg/mL、纤维蛋白溶酶的浓度为2000pg/mL，木瓜蛋白酶的浓度为100ng/mL和胃蛋白酶的浓度为6ng/mL。

经检测，本实施例中得到的提取液中胎儿DNA占总的DNA的质量分数为91%。

实施例2

（1）采集孕妇外周血10mL，加入EDTA抗凝，4℃下1500g离心10分钟，吸取上清液；

（2）在步骤（1）所得上清液中加入上清液体积12%的蛋白酶复合剂，4℃下1600g离心6分钟，吸取上层水相；

（3）在步骤（2）所得上层水相中加入等体积的Tris饱和酚混匀，4 ℃下4000g离心35分钟，吸取上层清液；

（4）在步骤（3）所得上层清液中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液充分混匀, 4℃下4600g离心5分钟，吸取上层水溶液；氯仿/异戊醇的混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。

（5）在步骤（4）所得上层水溶液中加入2.0倍体积的的乙醇（95 %，v/v）充分混匀，4 ℃下7000g高速离心10分钟，取得DNA沉淀；乙醇的温度为4℃。

（6）加20mL TE溶解DNA沉淀，TE溶解的DNA溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，选择切取目的条带固定，得到胎儿DNA粗回收液；

（7）胎儿DNA粗回收液用150mL无水乙醇沉淀DNA,80mL TE溶解DNA沉淀，得到DNA提取液。

本实施例中，蛋白酶复合剂中蛋白酶K的浓度为10mg/mL、纤维蛋白溶酶的浓度为1000pg/mL，木瓜蛋白酶的浓度为300ng/mL和胃蛋白酶的浓度为8ng/mL。

经检测，本实施例中得到的提取液中胎儿DNA占总的DNA的质量分数为90%。

实施例3

（1）采集孕妇外周血5mL，加入EDTA抗凝，4℃下1300g离心6分钟，吸取上清液；

（2）在步骤（1）所得上清液中加入上清液体积10%的蛋白酶复合剂，4℃下1200g离心10分钟，吸取上层水相；

（3）在步骤（2）所得上层水相中加入等体积的Tris饱和酚混匀，4 ℃下4600g离心25分钟，吸取上层清液；

（4）在步骤（3）所得上层清液中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液充分混匀, 4℃下4200g，离心6分钟，吸取上层水溶液；氯仿/异戊醇的混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。

（5）在步骤（4）所得上层水溶液中加入3.0倍体积的的乙醇（95 %，v/v）充分混匀，4 ℃下8000g高速离心8分钟，取得DNA沉淀；乙醇的温度为4℃。

（6）加100mL TE溶解DNA沉淀，TE溶解的DNA溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，选择切取目的条带固定，得到胎儿DNA粗回收液；

（7）胎儿DNA粗回收液用100mL无水乙醇沉淀DNA,20mL TE溶解DNA沉淀，得到DNA提取液。

本实施例中，蛋白酶复合剂中蛋白酶K的浓度为20mg/mL、纤维蛋白溶酶的浓度为3000pg/mL，木瓜蛋白酶的浓度为400ng/mL和胃蛋白酶的浓度为5ng/mL。

经检测，本实施例中得到的提取液中胎儿DNA占总的DNA的质量分数为91%。

实施例4

（1）采集孕妇外周血7mL，加入EDTA抗凝，4℃下1200g离心5分钟，吸取上清液；

（2）在步骤（1）所得上清液中加入上清液体积8%的蛋白酶复合剂，4℃下1400g离心8分钟，吸取上层水相；

（3）在步骤（2）所得上层水相中加入等体积的Tris饱和酚混匀，4 ℃下4500g离心32分钟，吸取上层清液；

（4）在步骤（3）所得上层清液中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液充分混匀, 4℃下4300g，离心8 分钟，吸取上层水溶液；氯仿/异戊醇的混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。

（5）在步骤（4）所得上层水溶液中加入1.5倍体积的的乙醇（95 %，v/v）充分混匀，4 ℃下7500g高速离心9分钟，取得DNA沉淀；乙醇的温度为4℃。

（6）加80mL TE溶解DNA沉淀，TE溶解的DNA溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，选择切取目的条带固定，得到胎儿DNA粗回收液；

（7）胎儿DNA粗回收液用200mL无水乙醇沉淀DNA,80mL TE溶解DNA沉淀，得到DNA提取液。

本实施例中，蛋白酶复合剂中蛋白酶K的浓度为13mg/mL、纤维蛋白溶酶的浓度为5000pg/mL，木瓜蛋白酶的浓度为200ng/mL和胃蛋白酶的浓度为10ng/mL。

经检测，本实施例中得到的提取液中胎儿DNA占总的DNA的质量分数为92%。