包含烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸或该烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸的衍生物的药学或者化妆料组合物

技术领域

本发明涉及一种烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)或其衍生物的角质形 成细胞(keratinocyte)分化促进用途。更详细地说，本发明涉及NAADP或其衍 生物的药学或者化妆品学用途及已分离的角质形成细胞的分化促进用途，这些 用途用于再生及改善皮肤屏障，预防、改善或治疗如银屑病或过敏性皮炎的角 质层异常疾病。

背景技术

人的皮肤由真皮(dermis)和表皮(epidermis)形成。真皮主要合成胶原蛋 白和其他蛋白质，主要由用于生产少量的脂质的成纤维细胞(fibroblast)形成。 与此相对，表皮主要生成脂质，主要由实质上不合成胶原蛋白的角质形成细胞 (keratinocyte)形成。尤其，位于皮肤最外围的表皮执行防御从外部来的多种 刺激，例如，化学物质、大气污染物质、干燥的环境、紫外线等的物理化学性 刺激因子，并且阻挡体内水分通过皮肤的散发过多的现象的保护功能。这种保 护功能可通过正常形成且维持由角质形成细胞形成的角质层来实现。表皮中处 于最外层的角质层(Stratum corneum，horney layer)从角质形成细胞形成，由 结束分化的角质细胞和围绕着它的脂质层组成(J.Invest.Dermatol.1983；80： 44-49)。角质细胞是在表皮基底层(stratum basale)持续增殖的基底细胞(basal  cell)向角质层(stratum corneum)移动的同时阶段性经过形态及功能上的变化 而形成的细胞。经过规定期间，过久的角质细胞从皮肤脱落，从表皮基底层生 出的新角质形成细胞(keratinocyte)代替其功能，将这种重复性一系列的变化 过程称为表皮分化(epidermis differentiation)或者角化(keratinization)。在这种 角化过程中角质形成细胞生成天然保湿因子(NMF，Natural Moisturizing Factor) 和细胞间脂质(神经酰胺、胆固醇及脂肪酸)的同时形成角质层，以使角质层 具有坚固性和柔韧性，从而保持作为起到与外部的隔断层作用的皮肤屏障(skin  barrier)的功能。

这种角质层由于过度地洗脸或洗澡等生活习惯性因素、干燥的大气污染物 质等环境要因、及如过敏性皮炎性皮肤或老年性皮肤的内因性疾病等而有可能 容易损失其功能。实际上，进入现代社会之后，对于皮肤的危害要因逐渐增加， 随着因饮食生活方式的变化而角质层的生成及脱落速度变慢，因角质形成细胞 的功能降低而角质层的保湿因子和脂质的量减少，由此角质层未能发挥正常的 皮肤屏障功能的皮肤的人趋于增加。

已公开，被认为现代社会的主要疾病之一的皮肤干燥症的最重要的原因是皮 肤屏障功能异常。银屑病(Psoriasis)为皮肤的炎症性疾病，其以表皮增殖和皮 炎症为特征，因炎症皮肤变厚、变红且起鳞屑(角质)。即使不存在传染性，但 由于难看，因此患者经历着压力及生活质量的降低。作为引起银屑病的原因， 提出了皮肤角质形成细胞的过多增殖及分化的阻碍(Roenigk HH，Marcel Dekker  Inc，pp.233-247，1985)、T细胞或者树突状细胞等白细胞参与的免疫系统的异 常(J.C.Prinz，Clinical and Experimental Dermatology，24，291-295，1999)等。 最近，在10％的少儿中发病的过敏性皮炎(atopic dermatitis)为慢性复发性湿疹 性疾病，虽然发病机制并不明确，但因以慢性皮肤干燥症及由此引发的皮肤屏 障的损伤为主要症状，从而如果不进行适当的管理，则发展成苔藓化、色素变 化、红皮病等病变。并且，在长时间使用或者使用过多类固醇(steroid)制剂的 情况下出现的皮肤萎缩(skin atrophy)现象是皮肤变薄且功能变弱的副作用， 报告指出，其主要原因在于由类固醇(steroid)引起的成纤维细胞的活性抑制及 胶原蛋白生成低下(S.Hammer et al.，J.Cell.Biochem，91，840-851，2004)。

以往，为此实行如下方式：使用具有吸收水分的性质的保湿剂(humectant) 或用于防止水分蒸发的封闭性保湿剂(occlusive moisturizer)，增加在角质层中 保持水分。作为保湿剂，包括甘油、聚丙二醇、1，3-丁二醇、聚乙二醇、山梨糖 醇及2-吡咯烷酮-5-羧酸钠等物质，但是它们具有涂敷于皮肤时严重发黏或感觉 柔韧的缺点。作为封闭性保湿剂，一直使用神经酰胺等脂质成分或必需脂肪酸 及脂质复合物等(J.Invest.Dermatol.(5)，731-740，1994)，但是其在维持乳化 剂型的稳定性方面上存在难点，从而具有不适于制备透明的胶状产品的缺点。 并且，在使用上述通常的具有水分保持功能的保湿剂时，虽然可以期待一时的 症状缓解，但是难以从根本上治疗，这就是实情。因此，开发用于促进角质形 成细胞的分化、促进成纤维细胞的生长来从根源上再生受损的屏障的物质迫在 眉睫。

另一方面，近年来，提出角质层的分化对阻止皮肤水分的干燥方面非常重 要的主张，随之证明了如下事实：只有在从基底层的角质形成细胞向最外围角 质层的角质细胞发达的分化过程正常进行的情况下，才能发挥作为皮肤水分保 持屏障的作用。即，在角化的过程中，细胞会生成天然保湿因子(natural  moisturizing factor，NMF)和细胞间的脂质，其结果，角质层变得坚固且柔韧从 而能够执行作为屏障的功能。对于随着人的年龄增加而皮肤变干燥的倾向，从 生理角度可以解释为，角质层的脱落时间变长或表皮细胞的脂质合成能力降低、 皮肤角质层的保湿因子和脂质的量减少。因此，可以实现如下新的逼近法：通 过促进角质形成细胞的分化，从而能够诱导皮肤屏障的强化，增进皮肤水分维 持功能和从外部环境中的保护功能。

发明内容

技术课题

本发明的目的在于，提供一种作为并非通过单纯的症状缓解、而是通过再 生及强化受损的皮肤屏障来从根源上预防、改善或者治疗皮肤疾病及障碍的医 药或者功能性化妆品的组合物及利用该组合物的上述疾病及障碍的预防、改善 或者治疗方法。并且，本发明的目的在于，提供角质形成细胞的分化促进用组 合物及角质形成细胞的分化促进方法。

解决课题的手段

为了达成上述目的，本发明提供包含由化学式I表示的烟酸腺嘌呤二核苷 酸磷酸(NAADP，nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate)或者其衍生物作 为有效成分的组合物、以及使用该组合物的方法。

[化学式1]

上述化学式1中，R₁、R₂各自独立地为H、C_1-4烷基(未取代或者可被卤素 取代)或者CH₂-CO-CH₃；W选自由NH₂、OH及SH组成的组；X选自由OH、 SH、NH₂及卤素组成的组；并且Y选自由OH、H、NH₂及卤素组成的组。

本发明中所使用的NAADP在细胞内借助包含CD38的腺苷二磷酸-核糖基 环化酶(ADP-ribosyl cyclase)来合成(Chini EN.et al.，Biochem J 362：125-130， 2002；BERRIDGE G.et al.，Biochem.J.，365：295-301，2002；Aarhus R.et al.，J  Biol Chem.，270(51)：30327-30333，1995)，其是在所有生命体的细胞内用于 调节钙的浓度的物质，因此为了维持细胞的生命现象，其是非常重要的。

本发明人在用上述NAADP对角质形成细胞(human normal primary  keratinocyte)进行处理从而进行与分化相关的研究的过程中，世界上最早发现 NAADP具有提高角质形成细胞的分化能力的功能。具体地说，本发明人证明了， NAADP在角质形成细胞中作为钙信号调节分子而促进细胞内的钙游离(图1)， 具有增加作为角质形成细胞的分化标志物的外皮蛋白(involucrin)、角蛋白1、 角蛋白10的表达的效果(图2)。进而，本发明人通过制备含有NAADP的外用 药剂型并应用于动物及人类的皮肤来得到强化皮肤屏障的结果(图3)，从而完 成了本发明。

以下，对本发明进行详细说明。

本发明提供包含由化学式I表示的NAADP或其衍生物作为有效成分的用 于促进角质形成细胞的分化的组合物。

并且，本发明提供包含由化学式I表示NAADP或其衍生物作为有效成分的 用于再生及强化皮肤屏障的组合物。

本发明的包含由化学式I表示的NAADP或其衍生物作为有效成分的组合 物通过促进角质形成细胞的分化来再生及强化皮肤屏障，从而可以有效应用于 预防或者治疗银屑病、过敏性皮炎、鱼鳞癣等慢性皮肤屏障损伤疾病；诸如原 发性接触性皮炎、过敏性接触性皮炎之类的接触性皮炎；诸如过敏性皮炎之类 的急性皮肤屏障损伤疾病；皮肤干燥症、湿疹、因类固醇的副作用引起的皮肤 萎缩、皮肤伤口、疤痕、皱纹、皮肤老化、老年斑的产生、皮肤弹性减弱等皮 肤疾病及障碍；但并不局限于此。其中，皮肤干燥症并不局限于皮肤老化、环 境原因所引起的皮肤干燥症，还包括糖尿病、粘液水肿、淋巴瘤、肿瘤、后天 性免疫缺乏症、诸如唐氏综合症之类的遗传性疾病等其他原因疾病所引起的干 燥症；以及缺锌、服用利尿剂或抗组胺药所引起的干燥症等。生成在损伤的皮 肤的疤痕年龄越大越严重，这是因为皮肤再生能力减退。如果皮肤再生能力减 退，则有可能伤口等恢复迟延且皮肤弹性减少变得严重，因此，本发明的组合 物可通过增加皮肤再生力来改善这种问题。此外已知，角质层内包含有对皮肤 的保湿起到重要作用的天然保湿因子(NMF，natural moisturizing factor)，这种 天然保湿因子在角质形成细胞的最终分化过程中生成。因此，就本发明的包含 由化学式I表示的NAADP或其衍生物作为有效成分的组合物而言，促进角质 形成细胞的分化的成分除了再生皮肤屏障以外，促进NMF的生成，从而还可以 发挥保湿剂的作用。

应理解为，在本发明中使用的NAADP或其衍生物不仅可以以游离物质的形 式提供，还可以以其可药用的盐、可药用的溶剂化物、可药用的多晶型物或者 可药用的前体药物的形式提供。并且，上述有效成分还可以单独使用或者以与 其他药物活性化合物的结合物或者集合物的形态使用。

就本发明的化合物的盐而言，只要是可配合在医药或者化妆品内的形态就 没有特别的限制。其形态包括无机盐或者有机盐，并且可以是酸性盐或者碱性 盐。尤其，在基于阳离子的盐的情况下，可以是钠盐或钙盐等碱金属盐；钙盐、 镁盐及钡盐等碱土金属盐；精氨酸或赖氨酸等的碱性氨基酸盐；铵盐或三环己 铵盐等铵盐；单乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、单异丙醇胺盐、二异丙 醇胺盐及三异丙醇胺盐等各种链烷醇胺盐。上述盐优选为碱金属盐，更优选为 四钠盐。

本发明提供包含由化学式I表示的NAADP或其衍生物作为有效成分的促 进角质形成细胞的分化的药物组合物。并且，本发明提供包含由化学式I表示 的NAADP或其衍生物作为有效成分的用于再生及强化皮肤屏障的医药组合物。 并且，本发明提供包含有效量的上述组合物的用于治疗皮肤障碍及疾病的医药 制剂、尤其是皮肤外用药。

另外，本发明提供通过将上述组合物或制剂施用于哺乳动物来预防、治疗 或者改善上述皮肤障碍及疾病的方法。

本发明的含有NAADP或其衍生物的药物组合物还可以包含在药物组合物 的制备中通常使用的适当的载体、赋形剂及稀释剂。

在配成制剂时，使用通常所用的填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解 剂、表面活性剂等的赋形剂或者稀释剂来制备。还可以包含抗凝剂、润滑剂、 香料、乳化剂、防腐剂等，并且，为了在施用于哺乳动物之后、使活性成分的 释放迅速、持续或者延迟，可以使用本领域中公知的方法来配成制剂。

本发明的含有NAADP或其衍生物的药物组合物可以制成本发明所属技术 领域公知的通常的药剂学剂型。上述剂型包括局部应用制剂(局部涂敷、贴剂 及离子电渗疗法(iontophoresis))、口服给药制剂、注射剂、栓剂、经皮给药制 剂、经鼻给药制剂及吸入给药制剂，且还可以制成不局限于此的任意剂型给药， 但优选地，可以制成经皮给药制剂及用于局部应用的皮肤外用制剂。

在一具体例中，本发明的组合物作为皮肤外用制剂可以制成溶液、悬浮液、 乳液、软膏、糊剂、凝胶剂、乳膏、洗剂(lotion)、粉剂、喷雾剂、塞子(pack)、 透皮贴剂(transdermal patch)、敷料、含水性贴附剂或者非含水性贴附剂等可应 用于皮肤的所有剂型。

在本发明的剂型为糊剂、乳膏或者凝胶的情况下，作为载体成分，可以使 用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄耆胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、 皂土、硅石、滑石或者氧化锌等作为载体成分。

在本发明的剂型为粉剂或者喷雾剂的情况下，作为载体成分，可以使用乳 糖、滑石、硅石、氢氧化铝、硅酸钙或者聚酰胺粉剂，特别是在喷雾剂的情况 下，还可以包含诸如氯氟烃、丙烷/丁烷或者二甲醚之类的推进剂。

在本发明的剂型为溶液或者乳浊液的情况下，作为载体成分，使用溶剂、 溶解剂或者乳浊剂，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、 苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或者失水山梨醇 的脂肪酸酯。

在本发明的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分，可以使用诸如水、乙 醇或丙二醇之类的液状稀释剂；如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯 (polyoxyethylene sorbitol ester)及聚氧乙烯失水山梨醇酯(polyoxyethylene  sorbitane ester)的悬浮剂、微小结晶性纤维素、氢氧化铝氧化物(aluminium  metahydroxide)、皂土、琼脂或者黄耆胶等。

此外，在本发明的皮肤外用制剂中，可以配合适量的用于皮肤或粘膜的化 妆品或者外用的医药品、医药部外品中所配合的公知的各种成分。

这种成分包括：抗氧化剂(例如，诸如抗坏血酸、柠檬酸之类的羧酸类； 如生育酚、二丁基羟基甲苯的苯酚类)、防腐剂(例如，诸如脱氢乙酸、水杨酸、 乙二胺四乙酸二钠之类的羧酸类；诸如对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸甲酯、对 羟苯甲酸异丙酯、麝香草酚之类的苯酚类)、润湿剂(例如，诸如甘油、丙二醇、 二丙二醇、1，3-丁二醇之类的乙二醇类；诸如透明质酸盐之类的有机盐类，诸如 脲之类的酰胺类)、增稠剂(例如，诸如聚乙二醇之类的高分子化合物；诸如羧 甲基纤维素钠、羟丙基纤维素之类的纤维素类)、缓冲剂(例如，诸如柠檬酸、 乳酸、酒石酸之类的有机酸类；诸如盐酸、硼酸的无机酸类；诸如磷酸氢二钠、 柠檬酸钠之类的盐类；诸如三乙醇胺之类的有机碱类；诸如氢氧化钠、氢氧化 钾之类的无机碱)、吸附剂(例如，诸如高岭土、皂土之类的含水硅酸铝类；诸 如氢氧化铝镁、氢氧化铝之类的无机盐类)、基剂(例如，诸如白色凡士林、 Tween60、Tween80、液体石蜡、蜜蜡、凡士林、蓖麻油、硅油、氢化蓖麻油、 天然橡胶、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、聚氧乙烯氢化蓖麻油、天然橡胶胶乳、 1，3-戊二烯共聚树脂之类的有机物；诸如聚丁烯、合成橡胶SBR、聚乙二醇单硬 脂酸酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯十六十八烷基醚(polyoxyethylene  cetostearyl ether)、聚氧乙烯油基十六烷基醚(Polyoxyethylene Oleyl Cetyl ether)、 硅酮、丙烯酸淀粉300、聚丙烯酸钠、甲基丙烯酸/丙烯酸正丁酯共聚物、羧基 乙烯基聚合物之类的高分子化合物；诸如硬脂酸之类的脂肪酸类；诸如十六烷 醇、肉豆寇醇之类的醇类；诸如肉豆蔻酸十八烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、辛酸 十六烷基酯之类的脂肪酸酯类)、溶剂(例如，诸如乙醇、异丙醇、1，3-丁二醇、 正十八烷醇、克罗米通、三(辛酸/癸酸)甘油酯)之类的碳水化合物)、稳定 剂(例如，诸如偏磷酸钠、氧化锌、氧化钛之类的无机盐类；诸如月桂基聚氧 乙烯醚硫酸钠(sodium polyoxyethylene lauryl ether sulfate)、月桂基硫酸钠之类 的有机盐类)、粘结剂(例如，诸如聚丙烯酸钠、二丙二醇之类的高分子化合物)、 乳化剂(例如，诸如失水山梨醇单烯属酸酯(sorbitan mono olefinate)、聚氧乙 烯失水山梨醇单烯属酸酯(polyoxyethylene sorbitan mono olefinate)、D-山梨糖 醇、聚甘油单月桂酸酯、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠之类的碳水化合物)、表面活 性剂(例如，诸如聚甘油单月桂酸酯、油醇聚氧乙烯醚(polyoxyethylene oleyl  alcohol ether)之类的高分子化合物)，此外还包含香料、色素(染料、颜料)、 金属螯合剂、防臭剂、成膜剂、紫外线吸收剂、紫外线散射剂、维生素类等。

此外，为了增大皮肤屏障功能强化效果、皮肤角质形成细胞分化诱导效果 及皮肤保湿效果，用作上述皮肤外用制剂的组合物还可以含有皮肤吸收促进剂。

此外，在制备本发明的皮肤外用药时，只要不阻碍其药理效果，还可以包 含其他药效成分。这些药效成分例如为公知的清凉成分、皮质抑制剂、抗真菌 剂、杀菌剂、抗炎剂、皮肤收敛剂、细胞活化剂、血管扩张剂、血流促进剂、 皮肤功能增强剂及生药等。具体可以举出薄荷醇、水杨酸、雌二醇、甘草酸、 苯扎氯铵、苯酚、樟脑等；麻醉药及兴奋剂类，例如，盐酸乙基吗啡、盐酸羟 考酮、盐酸可卡因、盐酸哌替啶、脱氧麻黄碱盐酸盐、消旋盐酸甲基麻黄碱、 盐酸吗啡、柠檬酸芬太尼、酒石酸利瓦洛凡等；局部杀菌剂，例如，聚维酮碘、 三碘甲烷等；酶制剂，例如，氯化溶菌酶、链激酶、链道酶胰蛋白酶(streptodornase  trypsin)、脱氧核糖核酸酶等；生药类，例如，紫草提取物、荷叶提取物等。

水性悬浮液通常含有一种以上的混悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维 素、羟丙基甲基纤维素、褐藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶及阿拉伯胶；分 散剂或者润湿剂，例如卵磷脂或氧化烯(alkylene oxide)与脂肪酸的缩合产物(例 如聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧乙烷与诸如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadeca  ethyleneoxy cetanol)之类的长链脂肪族醇的缩合产物、或衍生自脂肪酸及己糖 醇的部分酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯 (polyoxyethylene sorbitol monooleate))或环氧乙烷与诸如十七碳亚乙基氧基鲸 蜡醇之类的长链脂肪族醇的缩合产物、或衍生自脂肪酸及己糖醇的部分酯与环 氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)或衍生自脂肪酸及己糖醇 酐的部分酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯 (polyethylene sorbitane mono oleate))，同时含有微粉形态的活性成分。水性悬 浮液还可以含有一种以上的保存剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸 丙酯)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、着色剂、芳香剂和/或甜味剂(例如，蔗糖、 糖精或阿斯巴甜)。

油性悬浮液可通过将活性成分混浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻 油或椰子油)或者矿物油(例如液体石蜡)来配制。油性悬浮液还可以含有如 蜜蜡、硬质石蜡或者鲸蜡醇的增稠剂。可通过添加如上所述的甜味剂和芳香剂 来提供味道好的口服制剂。这些组合物可通过添加诸如抗坏血酸之类的抗氧化 剂来保存。

适于通过添加水来制备水性悬浮液的分散性粉末及颗粒剂通常含有分散剂 或润湿剂、混悬剂及一种以上的保存剂，并且含有活性成分。适宜的分散剂或 润湿剂和混悬剂例示出如上所述的物质。也可以存在其他赋形剂，例如，甜味 剂、芳香剂及着色剂。

本发明的药物组合物也可以以水包油型乳化液的形态存在。油相可以是植 物油(例如橄榄油或花生油)、矿物油(例如液体石蜡)、或者其中任意油的混 合物。适宜的乳化剂例如可以为天然产生的胶(例如阿拉伯胶或者黄蓍胶)、天 然产生的磷脂(例如大豆卵磷脂、衍生自脂肪酸和己糖醇酐(hexitol anhydride) 的酯或部分酯(例如，失水山梨醇单油酸酯)及上述部分酯与环氧乙烷的缩合 产物，例如聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。乳化液还可以含有甜味剂、芳香剂 及保存剂。

糖浆和酏剂可通过使用甜味剂例如丙三醇、丙二醇、山梨糖醇、阿斯巴甜 或蔗糖来配制，其还可以含有缓和剂(demulcent)、保存剂、芳香剂和/或着色 剂。

本发明的组合物的合适的给药量及给药时间虽然根据制剂化方法、给药对 象的年龄、性别、体重、疾病症状的程度、排泄速度及反应灵敏性、给药途径 及期间的不同而不同，但是本领域的技术人员可以适当地选择对治疗有效的目 标给药量。例如，就口服给药制剂而言，以成人为基准，按照一天为0.01g/kg 至10.0g/kg、优选为0.1g/kg至1.0g/kg的方式，可以任意地分多次给药。此外， 就皮肤外用制剂而言，上述1天的有效量以每cm²皮肤表面积计为1nM至 10mM，优选为1nM至100μM范围内，可以将其1天涂敷1次至5次。上述组 合物的给药剂型可以是1天给药或者反复给药剂型，可以将上述1天的有效量 任意地分多次给药。

本发明的药物组合物可以以单独的疗法形式使用，但是，可以与手术、激 素治疗、放射线治疗、药物治疗、使用生物学反应调节剂的方法、饮食疗法等 合并使用。

本发明的组合物除了化学式I的NAADP或其衍生物以外，还可以包含角质 形成细胞等构成皮肤的细胞。

在本发明的其他方式中，本发明提供包含化学式I的NAADP或其衍生物 的、用于改善皮肤屏障功能及用于保湿皮肤的功能性化妆料组合物。本发明的 组合物通过促进角质形成细胞的分化来恢复皮肤屏障功能，从而增进从外部环 境的保护功能，用于预防或者改善皮肤伤口、疤痕、皱纹、弹性降低或者诸如 过敏性皮炎、湿疹或银屑病的皮肤障碍或疾病。此外，通过提高皮肤水分维持 功能，从而具有消除皮肤紧绷、粗糙且增加皮肤润滑的效果。

本发明的含有NAADP或其衍生物作为有效成分的功能性化妆品可以应用 于适于皮肤的所有剂型。更详细地说，不仅制成诸如润肤液、凝胶、乳膏、精 华素、水溶性粉剂、脂溶性粉剂、水溶性液体、粉底、喷雾剂、面膜等化妆品 类，还可以制成洁面泡沫、洁面霜、润肤露、润肤霜、润肤油、沐浴露、香皂、 洗发水、软膏、贴剂等。此外，也可以制成化妆品、洗剂及纤维等与皮肤接触 的皮肤接触物质。

就各剂型的化妆料组合物而言，除了上述NAADP或其衍生物以外，本领域 的技术人员可以在不损害本发明的目的及效果的范围内适当选择配合其他成 分。作为可添加的配合成分，可以举出油脂成分、保湿剂、润滑剂、表面活性 剂、有机及无机颜料、有机粉体、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂， 植物提取物、pH调节剂、醇、色素、香料、血流促进剂、冷却剂、止汗剂、净 水等。

另外，本发明的化妆品除了NAADP或其衍生物以外，还可以包含选自由水 溶性维生素、油溶性维生素、高分子肽、高分子多糖、鞘氨脂质及海藻提取物 组成的组中的成分。

本发明的化妆料组合物可根据欲涂敷的皮肤面积在皮肤上适量涂敷来使 用，并且可根据需要1天1次或数次反复使用。用量和次数可根据个人的皮肤 状态、年龄等按需增减。

在本发明的另一方式中，本发明提供包括如下步骤的促进角质形成细胞的 分化的方法：在体内(in vivo)、体外(ex vivo)或试管内(in vitro)使上述组合 物与皮肤的角质层或者角质形成细胞的培养物相接触。

角质形成细胞的培养不仅广泛应用于诸如烧伤、慢性疾病、白斑症之类的 皮肤损伤的治疗，也应用于细胞的分化步骤的研究。为了在医学上使用角质形 成细胞，需要利用从人体中得到的少量的细胞在培养容器中大量增殖。

在一具体例中，上述方法包括如下步骤：使包含化学式I的NAADP或其衍 生物的组合物与从哺乳动物分离的角质形成细胞或分离培养的角质形成细胞相 接触。通过上述方法得到的已分化的细胞可利用于体内或者体外实验，可以在 用于恢复/再生组织的移植用注射剂及移植物、人工皮肤等中使用，但不局限于 上述用途。上述方法可以进一步包括如下步骤：在需要再生及分化表皮的哺乳 动物个体的皮肤上，使用有效量的本发明的组合物。本领域的技术人员可根据 目的适当选择组合物的有效量、使用次数、间隔及期间等。

本发明还提供包含化学式I的NAADP或其衍生物的试剂盒，其为了促进角 质形成细胞的分化而使用。

在再另一方式中，本发明提供用于制备上述皮肤疾病及障碍的治疗用医药 的上述组合物的使用方法。

在其他方式中，本发明提供使用了本发明的组合物的能够调节试验物质的 角质形成细胞分化功能的物质的筛选方法。上述筛选方法包括如下步骤：准备 已分离的人类角质形成细胞；使已分离的人类角质形成细胞分别与含有NAADP 或其衍生物的组合物及试验物质相接触；对上述角质形成细胞内的钙增加量或 者分化标志物表达量进行检测；以及通过对从与上述组合物及试验物质相接触 的角质形成细胞中检测到的钙增加量或者分化标志物表达量进行比较，从而确 定上述试验物质的角质形成细胞分化诱导功能。

在这种筛选方法中使用的人类角质形成细胞分别在本发明的组合物及试验 物质的存在下进行培养，因此，只要能够明显识别出钙及分化标志物的表达量 的变动，就可以使用任何细胞。优选地，可以适当使用如下培养细胞系统，该 培养细胞系统由来自人类包皮的正常细胞和作为饲养细胞(feeder layer)的人类 角质形成细胞(Epidermal Keratinocyte neonatal，NHEK-Np，CC-2507，Lonza  Co.Ltd.)形成。

角质形成细胞的分化标志物可以利用诸如外皮蛋白、兜甲蛋白、角蛋白1 或角蛋白10之类的特异蛋白质，但并不局限于此，对于该蛋白的表达与否及表 达量，可以使用诸如蛋白免疫印迹法之类的通常的蛋白质的检测方法进行测定。

钙增加量或者分化标志物的表达量通过公知的测定法来得到检测，可以评 价由试验物质引起的角质形成细胞分化诱导功能，进而可以评价再生及强化皮 肤屏障的功效程度。

有益效果

本发明的包含NAADP或其衍生物的组合物显示出通过促进角质形成细胞 的分化来恢复受损的皮肤屏障功能且增加皮肤保湿能力的效果。因此，上述含 有NAADP或其衍生物的组合物可以作为用于再生及强化皮肤屏障以及用于保 湿皮肤的药物组合物或功能性化妆料组合物来使用，并且在体外可以用作角质 形成细胞分化诱导物质。此外，包含上述组合物的医药或者化妆料可有效地用 于预防或者治疗银屑病、过敏性皮炎、鱼鳞癣等慢性皮肤屏障损伤疾病；诸如 原发性接触性皮炎、过敏性接触性皮炎之类的接触性皮炎；诸如过敏性皮炎之 类的急性皮肤屏障损伤疾病；皮肤干燥症、湿疹、因类固醇的副作用引起的皮 肤萎缩、皮肤伤口、疤痕、皱纹、皮肤老化、老年斑的产生、皮肤弹性减弱等 皮肤疾病及障碍。

附图说明

图1是表示不同浓度的含有NAADP的组合物对一次培养的角质形成细胞内 的钙浓度变化产生的影响的曲线图。

图2是利用作为分化标志物的外皮蛋白、角蛋白1、角蛋白10的表达程度 来评价含有NAADP的组合物对一次培养的角质形成细胞的分化产生的影响的 蛋白免疫印迹法的照片图。

图3是在将含有NAADP的组合物涂敷于无毛小鼠的情况下、显示出在不同 浓度时的皮肤角质层的分化诱导程度的小鼠的皮肤组织照片图。。

具体实施方式

以下，通过实施例，对本发明进行更具体的说明。但是，这些实施例仅是 有助于理解本发明的例证，在任何情况下，本发明的范围并不局限于这些实施 例。

实施例1：NAADP对角质形成细胞内的钙上升的效果的验证

在正常的表皮内存在着钙离子浓度梯度(calcium gradient)，并且钙离子的 浓度在基底层和棘层中低，越到上层则越增加，从而在外部颗粒层中最高。对 于皮肤屏障的损伤而言，从皮肤的上部开始引发水分损失，且由此引起的水分 损失导致表皮内钙离子浓度梯度的变化。这种钙离子浓度梯度的变化在皮肤引 发稳态性恢复反应，由此，皮肤屏障功能快速恢复，接着形成正常形态的钙离 子浓度梯度。即证明了，作为在皮肤屏障损伤后开始恢复过程的信号，钙离子 的变化起到重要的作用。

在本实施例中，就本发明的组合物而言，为了确认皮肤屏障恢复效果，评 价了在对培养的角质形成细胞用NAADP进行处理时、诱导细胞内钙增加的功 效。

方法

在CO₂培养基中，对角质形成细胞(Epidermal Keratinocyte neonatal， NHEK-Np，CC-2507，Lonza Co.Ltd.)用细胞内钙标志物即fluo-3AM(Molecular  Probe公司，美国)处理30分钟，然后用KBM基础培养基(角质形成细胞基础 培养基，KBM-2，Lonza Co.Ltd.)清洗三次。细胞内钙的测定在KBM基础培养 基中进行，对于由NAADP引起的细胞内钙的增加进行观察。就细胞内钙的测 定而言，利用安装了具有488nm的激发(excitation)波长和530nm的发射波长 的激光光源的共聚焦显微镜(Confocal microscopy，尼康，日本)，收集在530nm 时的图像来算出钙的浓度。对角质形成细胞(5×10⁵细胞)用0.1nM、1nM、10nM、 100nM、1000nM的NAADP进行处理时测定的钙的变化量分别表示于图1。

结果

确认到，对角质形成细胞用1nM至100nM的NAADP进行处理时诱导细胞 内钙的移动。从钙在受损的皮肤屏障中起到重要的信号传达物质的作用的这一 点，确认到本发明的含有NAADP的组合物显示出皮肤屏障功能的快速的恢复 效果。这样的结果与下述实施的角质形成细胞的分化诱导结果一起暗示，含有 NAADP的组合物对于治疗伤口、过敏性皮炎及银屑病、湿疹、防止皮肤老化等 具有效果。

实施例2：NAADP的角质形成细胞的分化促进功效验证

角质形成细胞为形成皮肤的最外廓层、在皮肤的保湿及保护功能方面起到 非常重要的作用的细胞，因此优选的是，抑制过度的增殖，抑制细胞凋亡，促 进分化。过度的增殖使皮肤角质层异常地肥大，成为皮肤粗糙且变厚的原因， 因异常的分化而不能执行正常的皮肤屏障功能，从而引起诸如皮肤干燥症、过 敏性皮炎、银屑病等各种问题的可能性变高。

利用蛋白免疫印迹法，测定角质形成细胞分化时所生成的分化标志物(外 皮蛋白、角蛋白1及角蛋白10)的表达，从而对NAADP的细胞分化促进效果 进行测试。

方法

将一次培养的人的角质形成细胞放入培养用烧瓶中，使其附着于底部，然 后在培养液中添加按不同浓度稀释的NAADP和作为对照组的视黄酸，并培养 了5天，直到细胞生长达到底面面积的70％至80％左右。将该细胞采集(cell  harvest)并用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，phosphate buffered salin)进行清洗。 接着，加入10mM浓度的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，pH7.4)1ml，其 含有2％的十二烷基硫酸钠(SDS，Sodium Dodecyl Sulfate)、和20mM浓度的二 硫苏糖醇(DTT，Dithiothreitol)，并进行超声波处理(sonication)、煮沸(boiling)、 离心分离，将由此得到的沉淀物重新混悬于1ml的PBS。测定悬浮液中的蛋白 质含量作为评价细胞分化程度时的基准。将对角质形成细胞(5×10⁵细胞)用 视黄酸(1μM)进行处理的组作为阳性对照组，并且在低钙浓度的角质形成细 胞中添加分别不同浓度的NAADP(10pM至10μM)实施试验，将其结果示于 图2。

结果

评价对角质形成细胞的分化产生的影响的结果，如图2所示，可确认到， 在10pM至10μM的浓度的NAADP处理组中分化标志物表达，与角蛋白1及角 蛋白10相比表达出更好的效果。因此，确认到上述物质具有提高角质形成细胞 的分化功能的效果。因此，说明了跟发明的化合物促进角质形成细胞的分化， 最终能够迅速恢复皮肤屏障功能。

实施例3：在无毛小鼠中验证NAADP的皮肤角质层分化诱导功效

在本试验中使用的无毛小鼠(SPF/VAF Crl：SKH1-hr)购自Orient Bio公司 (城南，韩国)。作为本发明试验材料的NAADP，使用了Sigma公司的产品。

方法

在向磷酸盐缓冲溶液中添加1％的DMSO而成的溶液中，按不同浓度溶解 NAADP，从而制备测试物质，并将其用棉棒涂敷于6周龄无毛小鼠(hairless  mouse)的左右背部分，用这种方法实施了试验。按不同浓度分别涂敷5次，在 早上9:00和晚上7:00，1天实施2次。将涂敷了药物1周的动物颈椎脱臼处 死，且以1×1cm切开皮肤，在10％的甲醛溶液中固定一晚。对于固定组织，制 成石蜡块并制作5微米的切片，用同时识别角蛋白1和角蛋白10的抗体(Santa  Cruz #SC53251)以1∶100稀释倍率实施染色。作为二次抗体，使用了结合有 Alexa488的抗小鼠IgG(invitrogen)。

作为对照组，使用了在磷酸盐缓冲溶液中添加1％的DMSO而成的溶液； 作为试验组，使用了在对照组中所用的溶液中按不同浓度稀释NAADP来制备 的溶液。

结果

可以确认到，与对照组相比，NAADP处理组在皮肤外皮部分，角蛋白1及 角蛋白10的表达量增加，还可以获知，出现相关分化标志物的表达量增加的浓 度为100nM以上。

在体外(in vitro)试验中，高浓度NAADP处理时虽然表现出钙增加和分化 标志物的表达减少(参照实施例1及实施例2)，但是在本试验中确认到，角蛋 白1及角蛋白10呈NAADP的浓度依赖性地增加。该原因被判断为，由于仅利 用动物细胞的条件与通过体内(in vivo)的皮肤屏障吸收的过程存在差异。

制剂例

制剂例1.外用乳膏剂(100g)

在净水中加入保湿剂和NAADP，并加热调节至70℃。在加热溶解油性粉之 后，加入乳化剂、防腐剂等，并调节至70℃。将其加入到上述水相中，并利用 高速搅拌机(homomixer)，使乳化粒子均匀化，然后进行脱气泡、过滤、冷却。

制剂例2.外用洗剂(100g)

在净水中加入NAADP和保湿剂，并加热调节至70℃。在加热溶解油性粉 之后，加入乳化剂、防腐剂等，并调节至70℃。将其加入到上述水相中，并利 用高速搅拌机，使乳化粒子均匀化，然后添加透明质酸1水溶液，利用高速搅 拌机均匀混合后，进行脱气泡、过滤、冷却。

制剂例3.凝胶剂(100g)

在净水中添加聚乙二醇(polyethylene glycol)并溶解，添加NAADP并进行 加热溶解。将其冷却至50℃，一边搅拌，一边添加如下制成的物质：在聚丙二 醇及甘油中，添加聚氧乙烯鲸蜡基醚，并加热至约50℃。并且，在连续搅拌的 同时添加氢化钠，将pH调节为约6.8。在冷却至约40℃后，添加异丙醇，并冷 却至约25℃，然后提取到适当的容器。

制剂例4.营养乳霜(100g)

使用下述成分，根据制剂例1的方法制备。