鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法

技术领域

本发明涉及一种脉冲场凝胶电泳分型方法，尤其是一种鱼源链球菌脉冲场 凝胶电泳快速分型方法。

背景技术

链球菌是在自然界中广泛存在的一种条件致病菌，2009年以来，由无乳链 球菌（Streptococcus agalactiae）和海豚链球菌（Streptococcus inia）引起的链球 菌病严重制约了我国罗非鱼产业的发展，并呈现发病区域逐年扩大、发病率和 死亡率逐年升高，易感罗非鱼规格范围逐年扩大等新趋势。传染性疾病的爆发， 需要对致病微生物进行分型，分型方法包括基于表型特征分析的表型方法和基 于基因型特征的基因型方法。目前流行的基因型分型方法包括质粒分型、限制 性内切酶分析（REA）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型和基于PCR（聚合酶链 反应，polymerase chain reaction）技术的随机扩增多态性DNA标记（RAPD）、 扩增片段长度多态性（AFLP）、细菌基因组重复序列PCR技术（rep～PCR）和 多位点序列分型（MLST）等。质粒分型的缺点是检测对象是质粒，而不是遗传 稳定性更高的染色体；REA技术的缺点是大量小片段DNA用传统琼脂糖电泳难 以区分和比较；PCR技术的优点是快速便捷，缺点是检测的都只是染色体的部 分片段；而脉冲场凝胶电泳分型方法应用广泛，重复性和稳定性高，检测的是 整个染色体DNA，不受表型性状易变的影响，被认为是微生物分子分型的金标 准。但目前国际上的链球菌脉冲场凝胶电泳的实验流程一般需要6～8天，耗时 较长。脉冲场凝胶电泳的结果取决于DNA分离应用的实验条件以及所研究的微 生物的属和种。胶块的制备、细胞的裂解、胶块的水洗温度和时间限制性内切 酶选择，电泳参数等许多因素都能影响脉冲场凝胶电泳的结果。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种鱼源链球菌脉冲场 凝胶电泳快速分型方法，其对链球菌具有更强、更快的分型区分能力。

按照本发明提供的技术方案，一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方 法，采用从鱼源上分离并培养得到的链球菌作为分析样品，特征是，包括以下 工艺步骤：

（1）胶块制备：

（1-1）、将链球菌样品在血平板培养基上培养18～24小时后，用无菌接种 环刮取单菌落重悬于2ml的TE缓冲液中，得到细菌悬浊液，调整细菌悬浊液的 OD值为3.6～4.5；

（1-2）、取160～185μL细菌悬浊液于1.5ml离心管中，加入5～10μL浓度 为10mg/ml的溶菌酶，混合均匀；将细菌悬浊液与溶菌酶的混合溶液置于37℃ 水浴中孵育15～30分钟；从水浴中取出离心管，加入5～10μL浓度为20mg/ml 的蛋白酶K和5～20μL浓度为1mg/ml的变溶菌素；

（1-3）、将TBE缓冲液和低熔点琼脂糖混合，每100ml TBE缓冲液中加入 1～1.5g低熔点琼脂糖，得到凝胶溶液；将凝胶溶液放置在42～45℃的水浴中平 衡，备用；

（1-4）、将200μL凝胶溶液加入步骤（1-2）得到的细菌悬浊液中，混合均 匀；

（1-5）、将步骤（1-4）得到的混合物加入成胶模具进行凝固，避免气泡产 生，在室温下凝固15分钟，得到胶块；

（2）细胞裂解：

（2-1）、配制细胞裂解液：将1.5ml的ES缓冲液加入到50～75μL浓度为 20mg/ml的蛋白酶K中，混合均匀，得到细胞裂解液；将细胞裂解液置于冰上， 备用；

（2-2）、将1.5ml细胞裂解液加入到2ml的螺旋盖离心管中；

（2-3）、将步骤（1-5）得到的胶块放入步骤（2-2）的螺旋盖离心管中，用 刀片削去成胶模具表面多余的胶块，并保证胶块在液面以下，不与离心管的管 壁接触；

（2-4）、将步骤（2-3）的螺刻盖离心管放置在54～56℃水浴摇床中孵育90～ 120min，摇床转速为120～170转/分钟；

（3）洗胶块：

（3-1）、将TE缓冲液和纯水放置在50℃的水浴摇床中预热，备用；

（3-2）、将步骤（2-4）处理后的螺旋盖离心管从水浴摇床中拿出，盖上滤 筛盖，倒掉螺旋盖离心管中的细胞裂解液；将胶块转移至5ml的螺旋盖离心管 中，向该5ml的螺旋盖离心管中加入4ml经步骤（3-1）预热后的纯水，确保胶 块位于液面以下，将螺旋盖离心管放回50℃水浴摇床中摇10～15分钟，水浴处 理结束将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；再次向螺刻盖离心管中加入4ml步骤 （3-1）预热后的纯水，50℃水浴摇床中摇10～15分钟，水浴处理后将螺旋盖离 心管中的纯水倒掉；

（3-3）、向步骤（3-2）处理后的胶块中加入4ml经步骤（3-1）预热后的TE 缓冲液，再在50℃的水浴摇床中摇10～15分钟，倒掉TE缓冲液；

（3-4）、重复步骤（3-3）2～3次后，向胶块中加入4ml的TE缓冲液，放 置在4℃的冰箱中保存备用；

（4）胶块内DNA的酶切：

（4-1）、配制酶缓冲稀释液：将180μL纯水与20μL的Sma I限制性内切酶 10×缓冲液混合，得到200μL酶缓冲稀释液；

（4-2）、在1.5ml离心管中加入200μL酶缓冲稀释液；

（4-3）、将步骤（3-4）得到的胶块放在培养皿上，切成2mm宽的小胶块， 将小胶块放入步骤（4-2）的离心管中，确保小胶块处在液面以下，并将离心管 放在冰上孵育10～15分钟；

（4-4）、配制Sma I限制性内切酶的缓冲液：将174μL纯水、2μL浓度为 1mg/ml的牛血清蛋白、20μL的Sma I限制性内切酶10×缓冲液和40U的Sma I 限制性内切酶混合，得到200μL的Sma I限制性内切酶的缓冲液；

（4-5）、向经步骤（4-3）孵育后的离心管中加入200μL的Sma I限制性内 切酶的缓冲液，保证小胶块位于液面以下，常温孵育3～5小时；

（5）加样：

（5-1）、使电泳梳子齿与胶槽的底面距离为1～2mm，调整胶槽至水平位置；

（5-2）、倒掉步骤（4-5）所述离心管中的Sma I限制性内切酶缓冲液，并 向离心管中加入200μL的TBE缓冲液，备用；

（5-3）、将电泳梳子平放在胶槽上，把步骤（5-2）所述离心管中的小胶块 取出加在电泳梳子齿上，用吸水纸边缘吸去小胶块周围的液体，在室温下风干 3～5分钟；

（5-4）、将步骤（5-3）加过样的电泳梳子放入胶槽，确保电泳梳子齿上所 有的胶块在一条直线上，并且胶块与胶槽的底面距离为1～2mm；从胶槽的下部 中央缓慢倒入100ml温度为50～60℃的脉冲场琼脂糖溶液，避免气泡的生成， 再在室温下凝固20～30分钟；所述脉冲场琼脂糖溶液由1g脉冲场琼脂糖加入 100ml的TBE溶液中得到；

（6）电泳：

（6-1）、在电泳槽中加入2.2L的TBE缓冲液，关上盖子，保持电泳槽中的 温度为14℃；

（6-2）、将经步骤（5-4）凝固好的胶块放入经步骤（6-1）处理后的电泳槽 中，进行电泳；所述电泳时的电压为6V/cm，脉冲时间为10～45秒，电场夹角 为120°，电泳时间为22小时；

（7）图像获取：

（7-1）、取出经步骤（6-2）电泳处理的胶块，放在盛放有400ml浓度为 0.5μg/ml的EB溶液的托盘内，将托盘放置在摇床上摇20～30分钟；再在托盘 中的EB溶液换成400ml纯水，于摇床上脱色30～60分钟；

（7-2）、从托盘中取出胶块，吸除胶块上多余的水份，在凝胶成像系统下拍 摄图像。

步骤（1-1）所述TE缓冲液的组份为：100mM Tris、100mM EDTA，pH 为7.6。

步骤（3-1）所述TE缓冲液的组份为：10mM Tris、1mM EDTA，pH为7.6。

步骤（1-3）、步骤（5-2）、步骤（5-4）、步骤（6-1）所述的TBE缓冲液为 0.5×TBE缓冲液。

步骤（2-1）所述的ES缓冲液的组份为：0.5M EDTA、1g/100ml十二烷基 肌氨酸，pH为9.0。

本发明与已有技术相比具有以下优点：

本发明从溶菌酶、蛋白酶K和变溶菌素的用量、洗胶块的水浴温度和电泳 参数三方面优化了现有技术中的链球菌PFGE方案，使其成为一种适用于鱼源 链球菌的PFGE的最佳方案。与现有技术中的链球菌PFGE方案相比，本发明方 法对鱼源链球菌的区分能力更强，整个实验流程耗时缩短了3～4天，这对于鱼 源链球菌病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等具有非常重要的意义。

附图说明

图1为采用实施例1的方法对2009～2011年我国罗非鱼主产区收集的无乳 链球菌（菌株信息见表1中标号1～14）进行脉冲场凝胶电泳分型后的电泳结果； 1～14泳道，显示无乳链球菌有4种不同的带型，表明有4种不同基因型。

图2为采用实施例2的方法对2009～2011年我国罗非鱼主产区收集及广西 水产研究所赠送的链球菌（菌株信息见表1中标号15～21）进行脉冲场凝胶电 泳分型后的电泳结果；15～18泳道为无乳链球菌，显示有2种不同的带型，表明 有2种不同基因型；19～21泳道为海豚链球菌，显示有3种不同的带型，表明有 3种不同基因型。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明中所使用的Sma I限制性内切酶为市售产品，其中Sma I限制性内切 酶10×缓冲液是购买Sma I限制性内切酶时提供的和Sma I限制性内切酶配套使 用的10×缓冲液。

本发明实施例1、实施例2所采用的链球菌样品是从海南、广西等罗非鱼养 殖场分离获得的19株菌株，以及由广西水产研究所赠送的2株链球菌菌株，具 体如表1所示。

表1 2009～2011年我国罗非鱼主产区收集的链球菌

实施例一：一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，采用表1中标 号1～14的链球菌作为分析样品，具体包括以下工艺步骤：

（1）胶块制备：

（1-1）、将链球菌样品在血平板培养基上培养24小时后，用无菌接种环刮 取单菌落重悬于2ml的TE缓冲液中，得到细菌悬浊液，调整细菌悬浊液的OD 值为3.6；所述TE缓冲液的组份为：100mM Tris、100mM EDTA，pH为7.6；

（1-2）、取185μL细菌悬浊液于1.5ml离心管中，加入5μL浓度为10mg/ml 的溶菌酶，混合均匀；将细菌悬浊液与溶菌酶的混合溶液置于37℃水浴中孵育 15分钟；从水浴中取出离心管，加入5μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K和5μL 浓度为1mg/ml的变溶菌素；

（1-3）、将0.5×TBE缓冲液和低熔点琼脂糖混合，每100ml0.5×TBE缓冲 液中加入1.5g低熔点琼脂糖，得到凝胶溶液；将凝胶溶液放置在42℃的水浴中 平衡，备用；

（1-4）、将200μL凝胶溶液加入步骤（1-2）得到的细菌悬浊液中，混合均 匀；

（1-5）、将步骤（1-4）得到的混合物加入成胶模具进行凝固，避免气泡产 生，在室温下凝固15分钟，得到胶块；

（2）细胞裂解：

（2-1）、配制细胞裂解液：将1.5ml的ES缓冲液加入到75μL浓度为20mg/ml 的蛋白酶K中，颠倒混合均匀，得到细胞裂解液；将细胞裂解液置于冰上，备 用；所述的ES缓冲液的组份为：0.5M EDTA、1g/100ml十二烷基肌氨酸，pH 为9.0；

（2-2）、将1.5ml细胞裂解液加入到2ml的螺旋盖离心管中；

（2-3）、将步骤（1-5）得到的胶块放入步骤（2-2）的螺旋盖离心管中，用 刀片削去成胶模具表面多余的胶块，并保证胶块在液面以下，不与离心管的管 壁接触；

（2-4）、将步骤（2-3）的螺刻盖离心管放置在55℃水浴摇床中孵育90min， 摇床转速为120转/分钟；

（3）洗胶块：

（3-1）、将TE缓冲液和纯水放置在50℃的水浴摇床中预热，备用；所述 TE缓冲液的组份为：10mM Tris、1mM EDTA，pH为7.6；

（3-2）、将步骤（2-4）处理后的螺旋盖离心管从水浴摇床中拿出，盖上滤 筛盖，倒掉螺旋盖离心管中的细胞裂解液；将胶块转移至5ml的螺旋盖离心管 中，向该5ml的螺旋盖离心管中加入4ml经步骤（3-1）预热后的纯水，确保胶 块位于液面以下，将螺旋盖离心管放回50℃水浴摇床中摇15分钟，水浴处理结 束将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；再次向螺刻盖离心管中加入4ml步骤（3-1） 预热后的纯水，50℃水浴摇床中摇15分钟，水浴处理后将螺旋盖离心管中的纯 水倒掉；

（3-3）、向步骤（3-2）处理后的胶块中加入4ml经步骤（3-1）预热后的TE 缓冲液，再在50℃的水浴摇床中摇15分钟，倒掉TE缓冲液；

（3-4）、重复步骤（3-3）3次后，向胶块中加入4ml的TE缓冲液，放置在 4℃的冰箱中保存备用；

（4）胶块内DNA的酶切：

（4-1）、配制酶缓冲稀释液：将180μL纯水与20μL的Sma I限制性内切酶 10×缓冲液混合，得到200μL酶缓冲稀释液；

（4-2）、在1.5ml离心管中加入200μL酶缓冲稀释液；

（4-3）、将步骤（3-4）得到的胶块放在干净的培养皿上，切成2mm宽的小 胶块，将小胶块放入步骤（4-2）的离心管中，确保小胶块处在液面以下，并将 离心管放在冰上孵育10分钟；

（4-4）、配制Sma I限制性内切酶的缓冲液：将174μL纯水、2μL浓度为 1mg/ml的牛血清蛋白、20μL的Sma I限制性内切酶10×缓冲液和40U的Sma I 限制性内切酶混合，得到200μL的Sma I限制性内切酶的缓冲液；

（4-5）、向经步骤（4-3）孵育后的离心管中加入200μL的Sma I限制性内 切酶的缓冲液，保证小胶块位于液面以下，常温孵育3小时；

（5）加样：

（5-1）、使电泳梳子齿与胶槽的底面距离为1～2mm，调整胶槽至水平位置；

（5-2）、倒掉步骤（4-5）所述离心管中的Sma I限制性内切酶缓冲液，并 向离心管中加入200μL的0.5×TBE缓冲液，备用；

（5-3）、将电泳梳子平放在胶槽上，把步骤（5-2）所述离心管中的小胶块 取出加在电泳梳子齿上，用吸水纸边缘吸去小胶块周围的液体，在室温下风干3 分钟；

（5-4）、将步骤（5-3）加过样的电泳梳子放入胶槽，确保电泳梳子齿上所 有的胶块在一条直线上，并且胶块与胶槽的底面距离为1～2mm；从胶槽的下部 中央缓慢倒入100ml温度为55℃的脉冲场琼脂糖溶液，避免气泡的生成，再在 室温下凝固20分钟；所述脉冲场琼脂糖溶液由1g脉冲场琼脂糖加入100ml的 0.5×TBE溶液中得到；

（6）电泳：

（6-1）、在电泳槽中加入2.2L的0.5×TBE缓冲液，关上盖子，保持电泳 槽中的温度为14℃；

（6-2）、将经步骤（5-4）凝固好的胶块放入经步骤（6-1）处理后的电泳槽 中，进行电泳；所述电泳时的电压为6V/cm，脉冲时间为10～45秒，电场夹角 为120°，电泳时间为22小时；

（7）图像获取：

（7-1）、取出经步骤（6-2）电泳处理的胶块，放在盛放有400ml浓度为 0.5μg/ml的EB溶液的托盘内，将托盘放置在摇床上摇20分钟；再在托盘中的 EB溶液换成400ml纯水，于摇床上脱色30分钟；

（7-2）、从托盘中取出胶块，吸除胶块上多余的水份，在凝胶成像系统下拍 摄图像；所得到的图像如图1所示，图1的图像中显示了表1中标号1～14菌株 的泳道，表明无乳链球菌有4种不同的带型，表明有4种不同的基因型。

实施例二：一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，采用表1中标 号15～21的链球菌作为分析样品，包括以下工艺步骤：

（1）胶块制备：

（1-1）、将链球菌样品在血平板培养基上培养18小时后，用无菌接种环刮 取单菌落重悬于2ml的TE缓冲液中，得到细菌悬浊液，调整细菌悬浊液的OD 值为4.5；所述TE缓冲液的组份为：100mM Tris、100mM EDTA，pH为7.6；

（1-2）、取160μL细菌悬浊液于1.5ml离心管中，加入10μL浓度为10mg/ml 的溶菌酶，混合均匀；将细菌悬浊液与溶菌酶的混合溶液置于37℃水浴中孵育 30分钟；从水浴中取出离心管，加入10μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K和20μL 浓度为1mg/ml的变溶菌素；

（1-3）、将0.5×TBE缓冲液和低熔点琼脂糖混合，每100ml0.5×TBE缓冲 液中加入1g低熔点琼脂糖，得到凝胶溶液；将凝胶溶液放置在42℃的水浴中平 衡，备用；

（1-4）、将200μL凝胶溶液加入步骤（1-2）得到的细菌悬浊液中，混合均 匀；

（1-5）、将步骤（1-4）得到的混合物加入成胶模具进行凝固，避免气泡产 生，在室温下凝固15分钟，得到胶块；

（2）细胞裂解：

（2-1）、配制细胞裂解液：将1.5ml的ES缓冲液加入到50μL浓度为20mg/ml 的蛋白酶K中，混合均匀，得到细胞裂解液；将细胞裂解液置于冰上，备用； 所述的ES缓冲液的组份为：0.5M EDTA、1g/100ml十二烷基肌氨酸，pH为9.0；

（2-2）、将1.5ml细胞裂解液加入到2ml的螺旋盖离心管中；

（2-3）、将步骤（1-5）得到的胶块放入步骤（2-2）的螺旋盖离心管中，用 刀片削去成胶模具表面多余的胶块，并保证胶块在液面以下，不与离心管的管 壁接触；

（2-4）、将步骤（2-3）的螺刻盖离心管放置在55℃水浴摇床中孵育90min， 摇床转速为170转/分钟；

（3）洗胶块：

（3-1）、将TE缓冲液和纯水放置在50℃的水浴摇床中预热，备用；所述 TE缓冲液的组份为：10mM Tris、1mM EDTA，pH为7.6；

（3-2）、将步骤（2-4）处理后的螺旋盖离心管从水浴摇床中拿出，盖上滤 筛盖，倒掉螺旋盖离心管中的细胞裂解液；将胶块转移至5ml的螺旋盖离心管 中，向该5ml的螺旋盖离心管中加入4ml经步骤（3-1）预热后的纯水，确保胶 块位于液面以下，将螺旋盖离心管放回50℃水浴摇床中摇10分钟，水浴处理结 束将螺旋盖离心管中的纯水倒掉；再次向螺刻盖离心管中加入4ml步骤（3-1） 预热后的纯水，50℃水浴摇床中摇10分钟，水浴处理后将螺旋盖离心管中的纯 水倒掉；

（3-3）、向步骤（3-2）处理后的胶块中加入4ml经步骤（3-1）预热后的TE 缓冲液，再在50℃的水浴摇床中摇10分钟，倒掉TE缓冲液；

（3-4）、重复步骤（3-3）2次后，向胶块中加入4ml的TE缓冲液，放置在 4℃的冰箱中保存备用；

（4）胶块内DNA的酶切：

（4-1）、配制酶缓冲稀释液：将180μL纯水与20μL的Sma I限制性内切酶 10×缓冲液混合，得到200μL酶缓冲稀释液；

（4-2）、在1.5ml离心管中加入200μL酶缓冲稀释液；

（4-3）、将步骤（3-4）得到的胶块放在培养皿上，切成2mm宽的小胶块， 将小胶块放入步骤（4-2）的离心管中，确保小胶块处在液面以下，并将离心管 放在冰上孵育15分钟；

（4-4）、配制Sma I限制性内切酶的缓冲液：将174μL纯水、2μL浓度为 1mg/ml的牛血清蛋白、20μL的Sma I限制性内切酶10×缓冲液和40U的Sma I 限制性内切酶混合，得到200μL的Sma I限制性内切酶的缓冲液；

（4-5）、向经步骤（4-3）孵育后的离心管中加入200μL的Sma I限制性内 切酶的缓冲液，保证小胶块位于液面以下，常温孵育3小时；

（5）加样：

（5-1）、使电泳梳子齿与胶槽的底面距离为1～2mm，调整胶槽至水平位置；

（5-2）、倒掉步骤（4-5）所述离心管中的Sma I限制性内切酶缓冲液，并 向离心管中加入200μL的0.5×TBE缓冲液，备用；

（5-3）、将电泳梳子平放在胶槽上，把步骤（5-2）所述离心管中的小胶块 取出加在电泳梳子齿上，用吸水纸边缘吸去小胶块周围的液体，在室温下风干3 分钟；

（5-4）、将步骤（5-3）加过样的电泳梳子放入胶槽，确保电泳梳子齿上所 有的胶块在一条直线上，并且胶块与胶槽的底面距离为1～2mm；从胶槽的下部 中央缓慢倒入100ml温度为60℃的脉冲场琼脂糖溶液，避免气泡的生成，再在 室温下凝固30分钟；所述脉冲场琼脂糖溶液由1g脉冲场琼脂糖加入100ml的 0.5×TBE溶液中得到；

（6）电泳：

（6-1）、在电泳槽中加入2.2L的0.5×TBE缓冲液，关上盖子，保持电泳 槽中的温度为14℃；

（6-2）、将经步骤（5-4）凝固好的胶块放入经步骤（6-1）处理后的电泳槽 中，进行电泳；所述电泳时的电压为6V/cm，脉冲时间为10～45秒，电场夹角 为120°，电泳时间为22小时；

（7）图像获取：

（7-1）、取出经步骤（6-2）电泳处理的胶块，放在盛放有400ml浓度为 0.5μg/ml的EB溶液的托盘内，将托盘放置在摇床上摇30分钟；再在托盘中的 EB溶液换成400ml纯水，于摇床上脱色60分钟；

（7-2）、从托盘中取出胶块，吸除胶块上多余的水份，在凝胶成像系统下拍 摄图像；所得到的图像如图1所示，图1的图像表明了表1中标号15～18菌株 的泳道；其中，15～18泳道为无乳链球菌，显示有2种不同的带型，表明有2种 不同的基因型；19～21泳道为海豚链球菌，显示有3种不同的带型，表明有3种 不同基因型。