检测水稻新株型基因ipa1/IPA1的共显性标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及水稻育种领域，涉及一种检测水稻新株型基因ipa1/IPA1的共显性标记及其应用。 

背景技术

水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，提高产量是水稻育种学家的重要目标。在长期的育种实践基础上，国际水稻所的育种学家首先提出了水稻理想株型的高产育种策略。近来我国科学家成功克隆了控制水稻株型的新基因IPA1（Ideal Plant Architecture 1），发现该基因存在一对等位基因野生型IPA1和突变型ipa1。在DNA水平上，与IPA1相比，ipa1在小RNA（OsmiR156）结合位点存在着单个核苷酸的替换；该单核苷酸的替换干扰了小RNA OsmiR156对该基因转录本的剪切调控，从而影响到水稻株型等一系列农艺性状的发育与表现。李家洋、钱前等人通过研究发现，当突变型ipa1存在时，水稻植株表现出茎秆粗壮、分蘖减少、穗枝梗数和颖花数增加，进而导致水稻植株产量的增加。 

由于ipa1能够影响水稻植株的株型，提高水稻植株的产量，因此，在水稻育种上具有重要利用价值。在利用ipa1基因进行水稻育种过程中，其杂交或回交后代中会分离出含有该基因的不同基因型单株，这就需要对杂交或回交后代植株进行单株基因型的检测，选择出ipa1纯合或杂合的单株，用于随后进一步的回交或自交。由于在DNA序列上，IPA1和其等位基因ipa1仅存在单个核苷酸的差异，在检测ipa1基因时，通常使用PCR对ipa1或IPA1基因进行扩增后，用限制性内切酶Bsp1286Ⅰ对扩增产物进行酶切后电泳，或者对扩增产物进行直接测序的方法，去检测ipa1或IPA1基因。但是，这种酶切和测序的两种方法耗时太长、且成本较高。 

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种检测水稻新株型基因ipa1/IPA1的共显性标记。 

本发明的另一目的在于提供开发上述共显性标记的引物。 

本发明的再一目的在于提供上述共显性标记或引物的应用。 

本发明的目的通过下述技术方案实现： 

一种检测水稻新株型基因ipa1/IPA1的共显性标记，包含3个DNA片段，分别为ipa1和IPA1的共有片段（523bp）、IPA1特有片段（316bp）和ipa1特有片段（249bp），其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示。

开发上述检测水稻新株型基因ipa1/IPA1的共显性标记的引物如下所示： 

CF：5’-GAAGAGCATCGCAGGTTCA-3’；

CR：5’-GCTGGGTTGACAGAAGAGAGGG-3’；

AF：5’-CCACCGACTCGAGCTGTGCAAT-3’；

AR：5’-CATCAAGTGAGACTTCATGTGG-3’。

上述共显性标记或引物在鉴别水稻新株型基因等位基因类型中的应用。 

一种鉴别水稻新株型基因IPA1等位基因类型的方法，包括如下步骤：以待检样品DNA为模板，将上述4种引物等量混合后作为PCR扩增的引物进行PCR扩增，若扩增出523bp和249bp的2条DNA片段，则表明待检样品含有等位基因ipa1；若扩增出523bp和316bp的2条DNA片段，则表明待检样品含有等位基因IPA1；若扩增出523bp、249bp和316bp的3条DNA片段，则表明待检样品同时含有等位基因ipa1和IPA1。 

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明的共显性标记引物能够特异性的对水稻基因组DNA进行标记鉴定，检测水稻材料基因组DNA中IPA1的等位基因类型，检测的准确性高，与传统的酶切和测序的方法相比，具有成本低，操作简单的特点。 

附图说明

图1是等位基因ipa1和IPA1序列差异示意图。 

图2是ipa1/IPA1共显性标记开发原理示意图。 

图3是共显性标记检测ipa1/IPA1的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1～23分别为：ddH₂O、ipa1/IPA1杂合单株、混合模板、HR078、11H225、R1128、E8089、E8034、Moroberekan、Lemont、DL500、LY9505、黄华粘、鄂早18、E3022、金23B、粤泰B、9802S、R287、特青、93-11和SNJ。 

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

本发明利用水稻新株型基因野生型（IPA1）和突变型（ipa1）的序列差异（图1），针对小RNA（OsmiR156）结合位点的SNP 设计出检测ipa1/IPA1的共显性标记，该共显性标记包含3个DNA片段，分别为ipa1和IPA1的共有片段（523bp）、IPA1特有片段（316bp）和ipa1特有片段（249bp），其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3所示。 

根据图2中所示的标记开发原理，通过在SNP位点附近引入错配碱基，设计了检测ipa1/IPA1共显性标记的引物（表1）。 

表1 ipa1/IPA1共显性标记引物序列 

实施例1

选取已进行过IPA1测序的19个水稻品系和1份ipa1/IPA1杂合材料，对本发明的共显性标记进行验证。19个水稻品系为SNJ（少蘖粳）、93-11、特青、明恢63、R287、9802S、粤泰B、金23B、E3022、鄂早18、黄华粘、LY9505、Lemont、Moroberekan、E8034、E8089、R1128、11H225、HR078。对这19个水稻品系，前期已就其IPA1进行了测序分析，发现仅SNJ含有等位基因ipa1，其余18个水稻品系均含有等位基因IPA1。

利用CTAB法提取上述水稻品系叶片的基因组DNA，将表1中的引物等量混合后加入到同一扩增体系中进行PCR扩增，PCR扩增使用rTaq（Takara，大连，中国）和2*GC Buffer Ⅰ（Takara，大连，中国），扩增条件为：94℃ 5min预变性后，94℃ 1min、58℃ 1min和72℃ 1min连续30个循环；随后72℃ 10min，4℃ 5min。使用1.5%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行检测，检测结果见图3。从图3可以看出，在含有等位基因ipa1的材料（SNJ）中，该共显性标记能够扩增出共有片段（523bp）和1条ipa1特有片段（249bp）；在含有等位基因IPA1的材料中，能够扩增出共有片段（523bp）和1条IPA1特有片段（316bp）；为检验该共显性标记在ipa1/IPA1杂合状态下的检测结果，使用了1个混合模板（SNJ和LY9505的DNA等量混合）及1个ipa1/IPA1杂合单株作为PCR扩增的模板，图3结果表明，在混合模板及杂合单株中，该共显性标记能够有效扩增出ipa1和IPA1共有片段以及各自的特有片段，电泳条带清晰。 

本发明开发出检测ipa1/IPA1的共显性分子标记及检测引物，具有成本低、操作简单的特点，能够对ipa1和IPA1进行有效的检测。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

SEQUENCE LISTING

<110>  武汉大学

<120>  检测水稻新株型基因ipa1/IPA1的共显性标记及其应用

<130>  1

<160>  7    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  523

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

<400>  1

gaagagcatc gcaggttcag aagctttacg ttggatttct cctacccaag ggttccaagc       60

agcgtaagga atgcatggcc agcaattcaa ccaggcgatc ggatctccgg tggtatccag      120

tggcacagga acgtagctcc tcatggtcac tctagtgcag tggcgggata tggtgccaac      180

acatacagcg gccaaggtag ctcttcttca gggccaccgg tgttcgctgg cccaaatctc      240

cctccaggtg gatgtctcgc aggggtcggt gccgccaccg actcgagctg tgctctctct      300

cttctgtcaa cccagccatg ggatactact acccacagtg ccgctgccag ccacaaccag      360

gctgcagcca tgtccactac caccagcttt gatggcaatc ctgtggcacc ctccgccatg      420

gcgggtagct acatggcacc aagcccctgg acaggttctc ggggccatga gggtggtggt      480

cggagcgtgg cgcaccagct accacatgaa gtctcacttg atg                        523

<210>  2

<211>  316

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

<400>  2

gaagagcatc gcaggttcag aagctttacg ttggatttct cctacccaag ggttccaagc       60

agcgtaagga atgcatggcc agcaattcaa ccaggcgatc ggatctccgg tggtatccag      120

tggcacagga acgtagctcc tcatggtcac tctagtgcag tggcgggata tggtgccaac      180

acatacagcg gccaaggtag ctcttcttca gggccaccgg tgttcgctgg cccaaatctc      240

cctccaggtg gatgtctcgc aggggtcggt gccgccaccg actcgagctg tgctctctct      300

cttctgtcaa cccagc                                                      316

<210>  3

<211>  249

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

<400>  3

ccaccgactc gagctgtgct atctctcttc tgtcaaccca gccatgggat actactaccc       60

acagtgccgc tgccagccac aaccaggctg cagccatgtc cactaccacc agctttgatg      120

gcaatcctgt ggcaccctcc gccatggcgg gtagctacat ggcaccaagc ccctggacag      180

gttctcgggg ccatgagggt ggtggtcgga gcgtggcgca ccagctacca catgaagtct      240

cacttgatg                                                              249

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  引物CF

<400>  4

gaagagcatc gcaggttca                                                    19

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  引物CR

<400>  5

gctgggttga cagaagagag gg                                                22

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  引物AF

<400>  6

ccaccgactc gagctgtgca at                                                22

<210>  7

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  引物AR

<400>  7

catcaagtga gacttcatgt gg                                                22