一种来源于放线菌的腈水合酶基因在大肠杆菌中高效表达的方法

技术领域：

一种来源于放线菌的腈水合酶基因在大肠杆菌中高效表达的方法，本发明涉及一种在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功表达腈水合酶的方法，属于微生物基因工程领域。

背景技术：

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，是一种能将腈类物质水合成更有价值的酰 胺类化合物的金属酶。NHase在微生物中分布比较广泛，目前已经在红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌 属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、丛 毛单胞菌属(Comamonas)中部可以得到腈水合酶的基因序列。

各国研究者获取腈水合酶基因的方式基本相同，一般都是提取野生菌的基因组DNA，然后通过查阅 各种基因文库确定该菌株中腈水合酶的基因序列，根据两端的序列设计引物，并以聚合酶链式反应(PCR) 的方法扩增得到所需的克隆片段。然后将商用质粒和扩增片段通过酶切后连接，构建重组质粒，再转入宿 主菌株进行表达。

目前用于表达腈水合酶载体主要有pET21a(+)、pET24a(+)、pET28a(+)、pBluescript II SK(+)以及一 些穿梭质粒。而宿主则以红球菌和大肠杆菌为主，包括红球菌DSM43985、红球菌ATCC12674、大肠杆菌 BL21、JM109、DH5α和TG1等。

由于一些放线菌来源的腈水合酶基因在以大肠杆菌为宿主的体系中表达时，所受到的调控机制与野生 菌区别较大，表达出来的蛋白极易聚集形成包涵体，因而放线菌来源的腈水合酶基因的异源表达在过去 10多年中研究进展缓慢。

Kobayashi等在大肠杆菌中表达玫瑰色红球菌J1的腈水合酶，表达水平极低，其比酶活仅为 0.012U/mg。本发明旨在开发出一种能在大肠杆菌中高效表达红球菌属来源的腈水合酶的方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种在大肠杆菌中高效表达红球菌属来源的腈水合酶的方法。

所述的腈水合酶基因BAE，详见NAGASAWA等Characterization of a new cobalt-containing nitrile hydratase  purified from urea-induced cells of Rhodococcus rhodochrous J1。Eur.J.Bio-chem。196(1991)581-589。

所述编码腈水合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的具体步骤如下：

1)根据腈水合酶原始序列设计引物(BAE up、BAE down)，扩增全长腈水合酶基因BAE后酶切(Nde  I\Hind III)连接至载体pET24a(+)，交予上海生工生物工程公司进行测序。

2)设计带有大肠杆菌SD序列(AAGGAG)、间隔序列(ATATACAT)及两端分别与B基因下游和 A基因上游具有部分重叠的上游引物(SD2)，同时设计带有大肠杆菌SD序列、间隔序列及两端 分别与A基因下游和E基因上游具有部分重叠的下游引物(SD3)，B基因上游使用pET24a(+) 载体上自身所带有的SD序列(如SEQ ID 6所示)和间隔序列(如SEQ ID 7所示)；

3)采用上一步中所设计的一对引物，以步骤1中所构建的pET24a(+)-BAE为模板进行全质粒扩 增，插入并且替换BAE基因原始间隔序列；

4)将上一步中获得的全质粒PCR产物pET24a(+)-(rbs)B(rbs)A(rbs)E用Dpn I 37℃酶切 4h，确保原始模板pET24a(+)-BAE都被切除，然后化转大肠杆菌JM109，涂布含有抗性的平 板后37℃培养；

5)挑取单菌落转至含有抗性的液体LB培养基培养，提取质粒进行核酸电泳验证，酶切验证以及PCR 验证，然后交予上海生工生物工程公司进行测序；

6)将序列正确的重组质粒，转化BL21(DE3)，进行诱导表达，SDS-PAGE检测蛋白表达情况，HPLC 检测酶活力。

本发明所述的腈水合酶基因来源于红球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)，属于放线菌的一种。正确识 别腈水合酶基因序列的ORF，采用全质粒扩增的方法在腈水合酶B基因、A基因和E基因序列上游插入 大肠杆菌的SD序列(AAGGAG)和间隔序列(ATATACAT)。PCR产物经Dpn I消化去除原始模板pET24a (+)-BAE后，化转大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。

本发明的有益效果：本发明提供了一种在大肠杆菌中高效表达红球菌属来源的腈水合酶的方法，该方 法能在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达放线菌来源的腈水合酶基因。

附图说明：

图1.腈水合酶全基因PCR

1、DNA分子量标准；2、腈水合酶全基因PCR

图2.腈水合酶全质粒PCR插入大肠杆菌SD序列和间隔序列

1、DNA分子量标准；2、腈水合酶全质粒PCR产物(B、A、E上游序列替换成大肠杆菌中的SD序列(如 SEQ ID 6所示)和间隔序列(如SEQ ID 7所示)

图3.腈水合酶表达的SDS-PAGE电泳图

1、蛋白分子量标准；2、pET24a(+)-(rbs)B(rbs)A(rbs)E细胞破碎上清。

具体实施方式：

材料和检测方法

LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，pH 7.0。

TB培养基：1.2％胰蛋白胨，2.4％酵母提取物，0.4％甘油，17Mm KH₂PO₄，72mM K₂HPO₄。

腈水合酶HPLC检测条件：流动相磷酸乙腈缓冲液；检测波长210nm；色谱柱为C18柱。

实施例1

1)PCR获取腈水合酶全长基因

通过查阅红球菌中腈水合酶基因序列设计引物(BAE up、BAE down)扩增全长腈水合酶基因序列。

上游引物BAE up(含有Nde I酶切位点)如SEQ ID NO.2所示，下游引物BAE down(含有HindIII 酶切位点)如SEQ ID NO.3所示；

2)设计具有大肠杆菌SD序列及间隔序列的一对引物

大肠杆菌BL21中表达红球菌中天然的腈水合酶全序列，国际上已多有报道，但均不理想，通过将腈 水合酶α基因及调控蛋白e基因的上游间隔序列替换成大肠杆菌的SD序列(如SEQ ID 6所示)和间隔 序列(如SEQ ID 7所示)，可成功表达大量可溶的腈水合酶。

SD1(含有A基因上游的SD序列和间隔序列)如SEQ ID NO.4所示，SD2(含有B基因上的SD序列和 间隔序列)如SEQ ID NO.5所示。

3)全质粒PCR法插入替换SD序列；

通过全质粒PCR法，可以一步将腈水合酶原始的间隔序列替换成带有大肠杆菌SD序列的腈水合酶基 因；

4)将上一步骤中全质粒PCR产物，经过Dpn I处理后，克隆到pET24a(+)转化大肠杆菌BL21(DE3) 中诱导表达；

5)HPLC检测改造后腈水合酶酶活；

腈水合酶HPLC检测条件：流动相磷酸乙腈缓冲液；检测波长210nm；色谱柱采用C18柱。