利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自 交亲和新种质的方法。

背景技术

梨树是我国的第三大果树，也是我国出口创汇的传统果品，其种类品种多、 分布广，除海南省之外，全国均有栽培。梨是蔷薇科典型的配子体自交不亲和性 果树，在目前栽培的品种中表现自花结实的寥寥无几，因此生产中必须配置授粉 树或人工授粉，才可以获得相应的产量。从物种进化以及杂种优势利用的角度来 说，自花授粉不结实性对植物是有利的。然而，对以收获果实为目的的果树生产 来说，自花不结实或结实率低无疑是不利的。据粗略统计，我国每年人工辅助授 粉的梨园面积达500多万亩，花费在6亿元以上。因此，许多果树研究工作者孜 孜以求，寻找良策，以摆脱自花不结实性在果树生产上的负面影响，已有不少国 家，如日本、美国、加拿大等，把选育自花结实性品种作为重要的育种目标之一。 若能实现自花授粉结实，就能避免或减少因春季气候不稳定而导致的传粉及授粉 困难、引起坐果率低并导致减产的问题，同时有利于简化梨园管理步骤及程序， 因此具有重要的实践意义和推广价值。

目前，自花结实种质创新的方法主要是传统的杂交育种和突变类型的选择。 但是众所周知，果树杂交新品种选育所需周期长、难度大，更新换代慢，而田间 自然突变类型的发现和利用具有频率低、不确定性的特点，这在很大程度上限制 了自花结实性种质的创新和应用。因此，建立高效的遗传改良技术体系，利用目 标性状的定向改良来实现梨自花结实性新种质的创新则是一条较为有效地解决 途径。

梨的自交不亲和性由单一位点的复等位基因控制，其中包括分别控制花柱和 花粉自交不亲和性的S基因，当花粉的S基因型和花柱中S等位基因之一相同时， S基因表达产物S糖蛋白（即S-RNase）具有酶活性，会降解花粉管中的rRNA， 使得花粉管不能伸长，无法完成授粉受精，因此不能结实。目前，鉴定不同梨的 S-RNase技术较为成熟，GenBank中已登录的梨S-RNase基因共有56个，获得全 长的有30个。通过提取和比较不同梨品种花柱中可溶性蛋白含量，发现花柱中 S糖蛋白表达量高的品种，自交不亲和性强度越大，相反当S糖蛋白表达量低时， 表现自交亲和性。

发明内容

本发明的目的是提供了一种利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲 和新种质的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方法，包含以下步 骤：

（1）构建反义表达载体pGSA1285-S3：

①根据S₃-RNase基因的mRNA序列，设计正反向引物S₃PF：5’-TGCCTCGCT CTTGAACAAA-3’（SEQ ID NO.1）、S₃PR：5’-TATATACTAGCTAGCCCCGC-3’（SE Q ID NO.2），以‘丰水’梨花柱cDNA为模版，PCR扩增获取S₃-RNase基因cDNA 序列全长；

②将S₃-RNase基因全长转化PMD19载体，以转化质粒为模板，用带有酶切 位点的特异引物（上游引物5’端添加的酶切位点为Nco I，下游引物5’端添 加的酶切位点为BamH I）S₃-PF₂：5’-CAGCCATGGAATGTTCTCCGCTTTTGTCACTG-3’ （SEQ ID NO.3）和S₃-PR₂：5’-CGAGGATCCGTTGTTTACGGTTCACGGTTTGT-3’（SEQ  ID NO.4）PCR扩增长度为449bp的S₃-RNase基因反义表达片段，将带有酶切 位点的反义表达片段转化PMD19载体，获得含S₃-RNase基因反义表达片段的PM D19重组质粒PMD-S₃；

③对重组质粒PMD-S₃以及真核表达载体pGSA1285进行Nco I/BamH I双酶 切，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收S₃-RNase基因反义表达片段和pGSA12 85线性载体并连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑取 氯霉素抗性单克隆，检测确定为成功构建的反义表达载体pGSA1285-S₃；

（2）获得转基因苗：利用花粉介导转化pGSA1285-S3载体至‘丰水’花柱，完 成授粉受精，并获得后代种子，通过冬季层积处理，春季播种培育获得幼苗；

（3）PCR检测转基因植株：提取上述获得的幼苗叶片基因组DNA，以pGSA1285 载体中35S启动子为上游引物35S-F：5’-ACGCACAATCCCACTATCCTTC-3’（SEQ  ID NO.5），以目的基因下游引物为下游引物S₃-PR2：5’-CGAGGATCCGTTGTTTACG GTTCACGGTTTGT-3’（SEQ ID NO.4），对样品DNA进行PCR扩增，扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，存在约1000bp的反义表达载体目的片段，确定为阳性转 基因植株。

所述的利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方法，还包 括步骤(4)转基因植株的自交亲和性鉴定：采集植株开花前1～2d的花蕾，切 取0.5g左右花柱，通过提取液提取、层析柱分离、蛋白质沉淀和透析，获得 花柱S糖蛋白，计算每1μg花柱可溶性蛋白中含总S糖蛋白含量≦0.7ng， 即为自交亲和性植株。

本发明方法中所述的PCR扩增的反应体系为25μL，包括2.5μL10×Bu  ffer，2.0mmol·L^-1MgCl₂，0.2mmol·L^-1，0.1μmmol·L^-1正向引物、0.1 μmmol·L^-1反向引物，0.2μLTaq酶（Takara公司）和60μg模板，PCR扩增 程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，持续38个循环后，72℃延伸10min，10℃10min。

所述的花粉介导转化pGSA1285-S₃载体的方法为：利用花粉介导法，将‘黄 花梨’花粉悬浮于15%蔗糖溶液中，先进行超声波处理，然后再向溶液中加入p GSA1285-S₃质粒，对混合后的溶液按相同的方式再次进行超声波处理，然后将处 理后的花粉略经沉淀，用毛笔蘸取并及时涂抹于大蕾期的‘丰水’花柱上，完成 授粉受精。

所述的超声波处理条件为功率160-170W、处理时间6S、间隙时间7S、 处理次数7次。

S-RNase基因反义表达载体pGSA1285-S₃在创制梨自交亲和性种质中的应用， 所述的S-RNase基因反义表达载体pGSA1285-S₃通过以下方法构建：

①根据S₃-RNase基因的mRNA序列，设计正反向引物S₃PF：SEQ ID NO.1、S₃PR： SEQ ID NO.2，以‘丰水’梨花柱cDNA为模版，PCR扩增获取S₃-RNase基因cDN A序列全长；

②将S₃-RNase基因全长转化PMD19载体，以转化质粒为模板，用带有酶切位点 的特异引物S₃-PF₂：SEQ ID NO.3和S₃-PR₂：SEQ ID NO.4PCR扩增长度为449 bp的S₃-RNase基因反义表达片段，将带有酶切位点的反义表达片段转化PMD19 载体，获得含S₃-RNase基因反义表达片段的PMD19重组质粒PMD-S₃；

③对重组质粒PMD-S₃以及真核表达载体pGSA1285进行Nco I/BamH I双酶切， 用1%琼脂糖凝胶电泳分离，并分别回收S₃-RNase基因反义表达片段和pGSA1285 线性载体并连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑取氯霉素抗性 单克隆，检测确定为成功构建的反义表达载体pGSA1285-S₃。

有益效果

本发明提供的利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方 法，具有以下优点：

（1）本发明通过反义表达载体转化抑制S-RNase基因表达，达到克服梨自 交不亲和性、创新自交亲和新种质的目的。该策略可实现对任何S等位基因的遗 传改良，不受现有少数S等位基因突变产生自交亲和性的限制，可实现对目前优 良栽培品种的自交不亲和性定向遗传改良，从而快速获得自交亲和优良新品种。

（2）利用花粉介导法是一种不依赖于组织培养的转基因方法，可避免冗长 繁琐的组培过程，且不受植株基因型及组培再生率的限制。同时，采用的杂交授 粉技术是育种实践中常用的方法，不需要农杆菌介导法和基因枪轰击法等常用转 基因方法所要求配备的特殊试验条件和仪器设备，利于在育种实践中推广应用。

（3）本发明创新梨自交亲和性种质的效率高，通过1次授粉组合，即获得 3株自交亲和新种质，而目前国际范围内发掘保存的自交亲和梨品种仅有6个， 在很大程度上补充了自交亲和梨种质来源不足和匮乏的局面。

附图说明

图1花柱S₃-RNase基因PCR扩增结果，

其中1为S₃-RNase基因全长扩增；M为Marker。

图2PMD重组载体S₃-RNase反义目的片段扩增产物的检测结果，

其中，1、2、3、4泳道为S₃-RNase反义目的片段的扩增产物；M为2000bp  Marker。

图3PMD-S₃、pGSA1285质粒双酶切结果，

其中1、4泳道分别为PMD-S₃、pGSA1285质粒经过NcoI和BamH I的双酶切结果， 2、3泳道分别为未进行酶切的PMD-S₃、pGSA1285质粒，M₁为2000bp的Marker， M₂为15000bp Marker。

图4pGSA1285-S₃阳性菌落PCR检测结果，

其中M为Marker,1-5泳道为反义表达载体阳性菌落，6泳道为阴性载体；7泳 道为PMD-S₃质粒阳性对照。

图5转基因植株PCR验证结果，

其中，1泳道为阳性对照以pGSA1285-S₃载体质粒为模板的扩增结果，2泳道为 阴性对照植株DNA为模板的扩增结果，3-8泳道为以本试验所得杂交苗DNA为模 板的PCR扩增结果，第5、6、8泳道为获得的转基因阳性植株。

具体实施方式

实施例1

1.反义表达载体pGSA1285-S₃的构建

根据NCBI中登陆的S₃-RNase基因mRNA序列全长，设计引物对S₃PF：5’- TGCCTCGCTCTTGAACAAA-3’（SEQ ID NO.1）、S₃PR：5’-TATATACTAGCTAGCCCCG C-3’（SEQ ID NO.2）。提取‘丰水’梨花柱RNA，反转录成cDNA，以合成的c  DNA为模版，用S₃PR/S₃PF引物进行PCR扩增，获取S₃-RNase基因cDNA序列全长。 扩增反应体系为25μL，包括2.5μL10×Buffer，2.0mmol·L^-1MgCl₂，0.2 mmol·L^-1，0.1ummol·L^-1正向、反向引物，0.2μLTaq酶（Takara公司）和 60μg cDNA。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退 火30s，72℃延伸30s，持续38个循环后，72℃再延伸10min，10℃10m in。图1所示，以‘丰水’梨花柱cDNA为模板，用S₃PR/S₃PF引物扩增获得S₃-RNase基因全长，片段大小在750bp左右，与设计的片段S₃-RNase（734bp）， 大小相一致。

将S₃-RNase全长转化PMD19载体，S₃-RNase基因PMD19载体连接体系如下： PMD19-T vector0.5μL，S₃-RNase基因PCR回收产物3.5μL，Solution I4 μL，将混合溶液置于16℃90min。

将S₃-RNase全长转化PMD19载体，以测序检测正确的带有S₃-RNase基因全 长的PMD质粒为模板，用带有酶切位点的特异引物扩增S₃-RNase基因449bp反 义表达片段。引物序列为S₃-PF₂：5’-CAGCCATGGAATGTTCTCCGCTTTTGTCACTG-3’ （SEQ ID NO.3）和S₃-PR₂：5’-CGAGGATCCGTTGTTTACGGTTCACGGTTTGT-3’（SEQ  ID NO.4）。上游引物5’端添加的酶切位点为Nco I，下游引物5’端添加的酶 切位点为BamH I。扩增反应体系和条件同S₃-RNase基因全长克隆。

用带有酶切位点的反义表达片段转化PMD19载体，获得S₃-RNase基因反义 表达片段的PMD19重组质粒PMD-S₃。图2所示，以带有酶切位点的S-RNase基因 反义片段转化PMD19质粒，设计引物扩增目的片段大小为449bp的S-RNase基 因片段。扩增图谱检测S₃-RNase目的片段在500bp左右，与引物设计目的片段 大小一致，因此，所扩增的PCR产物为构建表达载体所需目的片段。

对测序检测正确的已插入S₃-RNase基因反义片段的PMD19重组质粒PMD-S₃以及真核表达载体pGSA1285进行Nco I/BamH I双酶切，酶切体系为：1μL Ba  mHI，1μL NcoI，10μL质粒，18μL双蒸水。为使酶切充分，在37℃条件 下，酶切5h。用1%琼脂糖凝胶电泳分离，图3所示，为双酶切PMD-S₃、pGSA 1285质粒的琼脂糖凝胶电泳检测结果，由电泳结果看，第1泳道PMD-S₃质粒被 BamHI和NcoI酶双酶切后的小片段和目的基因片段大小一致，在450bp左右。 第4泳道pGSA1285质粒也成功酶切。分别回收S₃-RNase基因反义片段和pGSA1 285线性载体并连接，连接体系为：目的片段16.5μL，酶切过的空表达载体 pGSA12852.5μL，T4连接酶1μL。连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α 感受态细胞，挑取氯霉素抗性单克隆，经PCR验证和测序后，确定反义表达载体 构建成功。图4所示为pGSA1285-S₃反义表达载体的阳性克隆检测，由图可见， 质粒阳性对照和菌液PCR扩增片段大小相同，pGSA1285-S₃反义表达载体目的片 段大小为449bp，而ddH₂O空白对照无条带。因此，可以判断阳性菌落中成功转 入了已构建的pGSA1285-S₃反义表达载体。

2.利用花粉介导法转化pGSA1285-S₃载体

将适量‘黄花梨’花粉悬浮于15%蔗糖溶液中，按超声波处理参数（超声 波处理功率160-170W、处理时间6S、间隙时间7S、处理次数7次）进行1 次处理，然后再向溶液中加入pGSA1285-S₃质粒，对混合后的溶液按相同的方式 再次进行超声波处理，在第2次处理后，将处理后的花粉略经沉淀，用毛笔蘸取 并及时涂抹于大蕾期的‘丰水’花柱上，完成授粉受精，并挂牌标记。

‘丰水’梨成熟期采收果实，并采集种子。于第二年1月中下旬，将种子置 于清水中浸泡12h左右，淋干多余水，将种子和湿沙混匀，置于干燥阴凉处。 期间不定期翻看，待40d左右种子露白后，洗净，种植于32孔育苗穴盘，置于 25℃环境中，培育成苗。

3.转基因植株的检测

提取杂交幼苗植株叶片基因组DNA，并以其为模板，以pGSA1285载体中35 S启动子为上游引物35S-F：5’-ACGCACAATCCCACTATCCTTC-3’（SEQ ID NO.5）， 以目的基因的下游引物为下游引物S₃-PR2：5’-CGAGGATCCGTTGTTTACGGTTCACGG TTTGT-3’（SEQ ID NO.4），扩增所用体系同实验方法步骤1，扩增产物用1%琼脂 糖凝胶电泳检测，图5所示，为转基因植株的检测结果，结果显示，第5、6、8 泳道样品扩增条带大小与第1泳道阳性对照相一致（1000bp左右片段），其中 第6泳道条带有些杂的背景，但是主带明亮，且主带大小与阳性对照相一致，因 此可以确认第5、6、8泳道为转基因成功的植株，而其他泳道没有目的片段的特 异扩增，不是转基因植株。

4.自交亲和性鉴定

对获得的转基因植物，采集开花前1～2d的花蕾，切取花柱，称取0.5g 于研钵，加入少许液态氮研磨后加蛋白质提取液，经离心(4℃，20000×g, 10min)的上清液用Sephadex G-25层析柱分离，回收液用(NH4)₂SO₄沉析，得 到的蛋白质沉淀用50mmol/L Tris-HCl缓冲液透析后，即获得总的S糖蛋白。可 溶性蛋白质含量以牛血清白蛋白做标准曲线，并计算相应含量，按每1μg花柱 可溶性蛋白中含总S糖蛋白分别≦0.7ng为自交亲和性，获得的3个转基因植株 花柱S糖蛋白含量在0.58～0.62ng/μg，均为自交亲和性梨种质。