木糖异构酶和木糖醇脱氢酶组合用于木糖发酵为乙醇,以及脆弱拟杆菌木糖脱氢酶

发明背景

以商业规模通过发酵从纤维素原料中生产乙醇的能力是长期寻找 的目标。为了节约，乙醇产量必须足以值得上原料制备和最终产品加工的 成本。为生产足量乙醇需要一种发酵微生物，这种微生物在乙醇生产方面 相比于其他代谢产物的生产是生物学上高效的。效率是由产量和生产力确 定的，产量表示为转化为乙醇的糖原料（典型地是蔗糖或葡萄糖）的重量 百分比，生产力表示为由于乙醇毒性而发酵停止前，可以被生产的乙醇最 大量与发酵介质的体积/体积百分比。在这一点，到目前为止，最有效的 乙醇生产微生物是面包酵母中的酿酒酵母。

酿酒酵母的有效乙醇生产菌株能够将90%-93%（以wt/wt为基础） 的糖基碳源转化为乙醇，并且乙醇可以典型地积累至16%-17%的发酵介质 的体积。用于乙醇的商业规模生产的糖常规地通过从甜菜或甘蔗中榨取获 得，或通过玉米淀粉水解产生葡萄糖获得。然而，蔗糖或玉米淀粉仅代表 植物材料中总糖的一小部分，它们中的大部分包含在β葡萄糖苷聚合物纤 维素和半纤维素中，后者是一种C6糖类葡萄糖和甘露糖、C5糖类木糖和 阿拉伯糖的支链聚合物。

本领域存在若干方法用于制造纤维素和半纤维素的水解产物，以 生产包含葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的原料。对于来自玉米秸秆的 典型水解产物，葡萄糖代表该糖类的14.4%、甘露糖0.9%、木糖66.1%、 阿拉伯糖11.8%。对于典型的玉米纤维水解产物葡萄糖代表该糖类的48.6% 、木糖25.2%、阿拉伯糖17.6%。在天然厌氧代谢中，葡萄糖和甘露糖有效 地转化为乙醇，然而，酿酒酵母，缺乏将优势糖类，木糖转化为乙醇的酶 催化机制。为了达到这个目的，需要使用基因工程的方法使酿酒酵母表达 可以将木糖转化为磷酸木酮糖——是戊糖磷酸途径的一部分的C5代谢物， 该途径最终产生的中间物可以进入到糖酵解途径并在厌氧发酵期间转化 为乙醇。正常地，在戊糖磷酸途径中，磷酸木酮糖通过差向酶作用衍生自 磷酸核酮糖，但是此外，酿酒酵母包含的酶，木酮糖激酶可以直接磷酸化 木酮糖。然而木酮糖是一种稀有代谢物，木酮糖激酶在酿酒酵母中的表达 水平是低的。但是更重要地，木酮糖激酶不磷酸化木糖，并且酿酒酵母缺 乏转化木糖至木酮糖的所必需的酶，因此不能在没有代谢工程的情况下利 用木糖作为碳源。

存在两种方法来工程化酿酒酵母以从木糖生产木酮糖。第一种是 XR-XD-XK三基因途径，由Ho（何）等人的美国专利号5,789,210代表， 该途径同时过表达木酮糖激酶（XK）、与一种还原木糖至木糖醇的外源木 糖还原酶（XR）和氧化木糖醇至木酮糖的一种木糖醇脱氢酶（XD）。然而 该方法在酿酒酵母中引起了氧化还原失衡，因为木糖还原酶利用NAD(H) 作为还原辅因子同时木糖醇脱氢酶使用NADP+氧化辅因子。该失衡负面地 影响酿酒酵母的生长和生产力，关闭了来自木糖的乙醇的有效生产。一个 克服该问题的选项是使用一种与NADP⁺相比，具有更低K_m的NAD⁺的突 变体木糖还原酶，由此恢复该氧化还原反应平衡,如已经由Petschacher（佩 奇切尔）B等人举例描述（Biochem（《生物化学》）J2005,385：75-83）。

第二种方法是该XI-XK两基因途径，该途径过表达木酮糖激酶与 外源木糖异构酶（XI），该外源木糖异构酶直接转化木糖至木酮糖而没有 还原和随后的氧化。该方法由美国专利号7,622,284和美国专利公开号 US20060216804、US20080261287代表。来自木糖异构酶的多种细菌和真菌 来源的基因公用常用名xylA。xylA基因的若干种类已经被鉴定来自细菌和 真菌来源，并且一些而不是所有已经被示出，在同时与木酮糖激酶一起过 表达，从木糖生产乙醇中有用。用于这类xylA基因的提出的细菌来源包括 极端嗜热菌（美国专利号7,622,284）、多形拟杆菌（US20060216804， US20080261287）和黄单胞菌。xylA基因的若干真菌来源也已经提出，包括 来自Neocalimastix、Caecomyces、Piromyce、Orpinomyces、或R mnomyces 。（US20080261287）。也见于Curr Op Biotech（《生物技术近期述评》）17:320 （2006）。在这些中，只有来自Piromyces（20080014620）Orpinomyces （Madhavan（马德哈万）A,Tamalampudi（塔玛拉普迪）S,Ushida（牛田） K,Kanai（金井）D,Katahira（片平）S,Srivastava（斯利瓦斯塔瓦）A,Fukuda （福田）H,Bisaria（比萨拉）VS,Kondo（近藤）A.Appl Microbiol Biotechnol. （《应用微生物学和生物技术》）.200982(6):1067-78.）和多形拟杆菌 （US20080261287）的xylA基因已经示出当与木酮糖激酶共同过表达时， 用来改进在酿酒酵母中的乙醇生产。也见于FEMS Yeast Res（《欧洲微生物 学会联合会酵母研究期刊》）4:69、FEMS Yeast Res（《欧洲微生物学会联合 会酵母研究期刊》）5:399、FEMS Yeast Res（《欧洲微生物学会联合会酵母 研究期刊》）4:655,FEMS Yeast Res（《欧洲微生物学会联合会酵母研究期刊 》）5:925。

虽然从三基因方法和两基因方法这二者中乙醇生产已经被证明， 但是对于仅包含那些特征的菌株，来自木糖的乙醇产量仍低于预期。为了 改进生产力，需要另外的基因操作，通过突变、遗传选择亦或另外的基因 工程。例如，US20070082386提出通过二基因亦或三基因途径，来自木糖 醇的乙醇生产可以通过一种木糖转运酶的增加表达和/或通过木糖磷酸途 径的编码酶的基因的过表达来改进。US20060234364披露了在编码一种非 特异性醇醛还原酶的内源性gre3基因中具有缺失的突变体可以使用两基因 方法改进来自木糖醇的乙醇生产。US20070155000从一个不同的视角，教 授了与利用两基因途径，从包含水解产物的木糖的乙醇生产相比，可以通 过对于生长抑制剂抗性的进一步选择来改进，这些生长抑制剂例如典型地 在木质纤维素生物质水解产物中发现的糠醛和羧甲基糠醛。

在本领域中，对于发现其他木糖异构酶基因和其他多基因组合以 改进在酿酒酵母中的木糖利用率用于乙醇生产，仍存在需要。本披露随后 以来自脆弱拟杆菌的具体木糖异构酶的xylA基因的形式呈现了这类替代 方案，以及包括木糖异构酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶活性的同时过表 达而不需要过表达木糖还原酶的三基因途径替代方案。

发明概述

在此描述的是重组酵母菌株和从其生产乙醇的方法，其中木糖是 碳源，用于生长和乙醇生产。一个广泛方面包括酿酒酵母菌株，这些菌株 具有包括编码外源木糖异构酶和外源木糖醇脱氢酶的序列的重组核酸，每 一个序列可操作地连接至一个启动子以过表达外源基因，其条件是在酿酒 酵母菌株中菌株也不过表达以及外源木糖还原酶活性。示例性外源木糖异 构酶的一个特征是，与来自大肠杆菌的同源物木糖异构酶相比，该外源异 构酶更不受木糖醇抑制。一个具体实例是衍生自来自脆弱拟杆菌菌株的 xylA基因的木糖异构酶。也描述了示例性序列和编码这类基因的载体。这 些方面也任选地被包括在也过表达木酮糖激酶活性的酵母菌株中。

另一个方面是通过亲本菌株以上类型的进化选择来获得的酵母菌 株。进化选择包括在一个亲本酵母菌株中表达编码外源木糖异构酶的核 酸，在该亲本酵母菌株中该核酸可操作地连接至一个启动子以表达该外源 木糖激酶。在一种包含木糖作为主要碳源的液体培养基中进行该亲本酵母 菌株的第一生长以生产一个后代酵母菌株群体，在包含木糖作为主要碳源 的固体培养基上进行该子代酵母菌株群体的第二生长。该选择是为了从该 后代酵母菌株中获得一种快速生长的子代菌株，其特征在于在固体培养基 上，该快速生长的子代酵母菌株比在该后代酵母菌株群体中的其他酵母生 长更快速。重复第一生长、第二生长以及选择步骤，以最终获得从木糖中 比亲本酵母菌株生产更多乙醇的最终选择的酵母菌株。该方法在此用一种 酵母菌株举例说明，该木糖异构酶由一个脆弱拟杆菌的xylA基因编码。当 亲本菌株进一步表达编码外源木糖醇脱氢酶的核酸（该核酸可操作地连接 至启动子以在该亲本酵母菌株中表达该外源木糖醇脱氢酶）时，该方法可 以进一步被实施。通过该方法制造的示例性菌株在图中以Y500+bsd+Xibf “e”描述并且保藏为菌株号NRRL Y-50424。

附图简要说明

图1展示了在YEP培养基+2%的木糖上酿酒酵母烧瓶培养随时间 （小时）的生长（OD600）。所有菌株衍生自亲本乙醇生产菌株Y500并且 每一个携带杀稻瘟菌素抗性标记（bsd)。421i是携带由来自酿酒酵母的 HXT7启动子驱动的来自脆弱拟杆菌的XI（xylA）的转化体，在2010年10 月12日，421i已经在布达佩斯条约的条目下被保藏在the Agricultural  Research Services Northern Regional Research Laboratories（农业研究服务北方 区域研究实验室），作为保藏号NRRL Y-50423。437i携带相同XI和由树干 毕赤酵母XD启动子驱动的来自树干毕赤酵母的XD（xyl2），也被保藏， 保藏号NRRL Y-50424。437:xks携带相同XI和XD加上携带来自酿酒酵母 的XKS（xks）的额外拷贝，也被保藏，保藏号NRRL Y-50425。

图2示出了大肠杆菌木糖异构酶和脆弱拟杆菌木糖异构酶活性在 不同木糖醇浓度存在下的比较。活性被报告为在木糖醇缺失下获得的活性 百分比。

图3描绘了bsdYEMhxt-XIbf-cycl的质粒图谱，该质粒是携带在酿 酒酵母hxt7启动子控制下的来自脆弱拟杆菌的xylA的酵母复制型质粒。

图4描绘了bsdYIMrDNA Pxd-XD Phxt-XIbf质粒图谱，该质粒是 整合载体，用于使在酿酒酵母hxt7启动子控制下的来自脆弱拟杆菌的xylA 和树干毕赤酵母xd启动子控制下的来自树干毕赤酵母的XD（参见美国专 利号5,789,210）跨界进入酿酒酵母的染色体。

图5描绘了质粒421的质粒图谱，该质粒是酵母整合载体，用于 使酵母hxt7启动子控制下的来自脆弱拟杆菌的xylA和杀稻瘟菌素抗性跨 界进入酿酒酵母染色体。

图6描绘了质粒426的质粒图谱，该质粒是酵母整合载体，用于 使酵母hxt7启动子控制下的来自脆弱拟杆菌的xylA跨界进入酿酒酵母染 色体。

图7示出了来自脆弱拟杆菌xylA基因的XI的野生型蛋白序列 （SEQ.ID号：2）。

图8示出了对于来自脆弱拟杆菌的xylA基因的XI而言的突变体 蛋白序列，其中在核苷酸序列中有一个改变以增强转录，生成突变体蛋白， 其中在2号位上一个丝氨酸代替了丙氨酸（SEQ.ID号：4）。

图9示出了对于来自脆弱拟杆菌xylA而言的野生型核苷酸序列。 （SEQ.ID号：1）

图10示出了根据SEQ.ID NO：4编码突变体xylA的突变体核酸 序列（SEQ.ID号：3）。

图11示出了被优化用于在酿酒酵母中表达的根据SEQ.ID号：4 还编码突变体xylA的另一个突变体核苷酸序列（SEQ.ID号：5）。

发明详细描述

以下说明和以上背景引用了某些参考文献，这些参考文献可以协 助本领域普通技术人员理解本发明并且可以提供材料、信息、技术、蛋白 、载体和核苷酸序列，这些可以辅助本领域的一个普通技术人员在其最全 范围内制造和使用本发明的方面。因此，每一个引用的参考文献被合并到 本申请中，就像与此被最初提交至以下程度：引用的参考文献的教授内容 不与本申请的教授内容冲突，在这种情况下，本申请的教授内容应被认为 控制通过引用结合在此的技术的冲突的教授内容。

本发明的一个方面是以下发现：与其他木糖异构酶相比，来自脆 弱拟杆菌的木糖异构酶对木糖醇抑制更不敏感。其他木糖异构酶的实例包 括，但不局限于，来自真菌Piromyces或Orpinomyces的那些或之前本领域 已经描述的来自大肠杆菌、乳酸明串珠菌和多形拟杆菌的姐妹细菌异构酶 的那些。本发明的两个脆弱拟杆菌异构酶对于木糖醇抑制具有减少的敏感 性，这些酶各自地具有根据图7和图8示出的SEQ ID号：2和SEQ ID号： 4的肽序列。SEQ.ID号：2是一个对于来自脆弱拟杆菌xylA基因而言的野 生型序列，该序列由本发明的诸位发明人分离并且由根据图9示出的SEQ. ID号：1的核苷酸序列编码。SEQ ID号：4本发明的诸位发明人为增强在 酿酒酵母中的转录而制造的一种突变体xylA，并且该突变xylA由根据在图 10中示出的SEQ.ID号：3的核苷酸序列编码。根据SEQ.ID号：2和SEQ  ID号：4的XI蛋白是相同的，除了为了增强转录的突变还导致在根据SEQ  ID号：4的蛋白的2号位上改变丙氨酸为丝氨酸。SEQ.ID号：4还由在 图11中示出的SEQ ID号：5编码，保留了在核苷酸序列中的改变用于增 强转录，但是也具有密码子使用中的改变，以优化用于在酿酒酵母中的蛋 白合成。根据SEQ.ID号：2和SEQ ID号：4的脆弱拟杆菌X1蛋白与对 于来自Piromyces的XI的蛋白序列仅78.5%相同，与来自Orpinomyces的 序列77.9%相同，与来自乳酸明串珠菌的序列46.2%相同，与来自艰难梭状 芽孢杆菌的序列52.5%相同，与来自大肠杆菌的序列47.3%相同，与来自多 形拟杆菌的序列90%相同。因此，用于本发明的一种脆弱拟杆菌的XI与 SEQ.ID号：2或SEQ.ID号：4具有大于90%、大于92.5%、大于95%或大 于98%的氨基酸序列一致性。

在此描述的脆弱拟杆菌异构酶的一个区别特征是这些酶与来自其 他微生物的直系同系物XI序列相比，更不受木糖醇抑制。图3示出了根 据SEQ.ID号：4来自脆弱拟杆菌的XI与其大肠杆菌直系同系物相比，木 糖醇抑制的比较。在12.5mM的木糖醇，大肠杆菌XI活性>97%被抑制， 与脆弱拟杆菌XI形成对比，在相同木糖醇浓度下，它保持其活性的至少 30%。

尽管解释对于脆弱拟杆菌酶的木糖醇更低抑制的蛋白结构中的精 确差异目前还不知道，但是结构的和更重要的功能的差异间的关系可以用 不同方式特征化。在此提供的脆弱拟杆菌XI的范围的一个特征化是，它 是编码木糖异构酶活性以转化木糖为木酮糖并与SEQ.ID号：2或SEQ ID 号：4具有至少90%的一致性的蛋白。另一个特征化是它是编码木糖异构 酶活性以转化木糖为木酮糖的蛋白，并且它是与来自Piromyces、 Orpinomyces、大肠杆菌或多形拟杆菌的XI蛋白序列相比，与SEQ.ID号： 2或SEQ ID号：4更一致的蛋白。但是另一个特征化是这是编码木糖异构 酶活性以转化木糖为木酮糖的蛋白，与一种来自Piromyces、Orpinomyces 、大肠杆菌或多形拟杆菌的XI蛋白序列相比，更不受木糖醇抑制的蛋白 。在此提供的多核苷酸与体以上特征化的编码这类功能性蛋白的核苷酸序 列遵循相同的功能性定义，和/或在严格杂交条件下这些核苷酸序列会杂 杂交至SEQ.ID号：1，SEQ ID号：3或SEQ ID号：5，在该条件下，它 们不会杂交至编码具有来自Piromyces、Orpinomyces或多形拟杆菌蛋白的 XI活性的蛋白的核苷酸序列。

本教授内容的另一个方面是以上脆弱拟杆菌XI基因和表达的蛋 白的用途，由此工程化酿酒酵母用于从木糖生产乙醇。在一个第一实施例 中，根据SEQ.ID号：4编码XI蛋白的根据SEQ ID号：5的xylA多核苷 酸，可操作地连接至图3示出的多拷贝自主复制酵母质粒 bsdYEMhxt-XIbf-cycl中的酿酒酵母hxt7启动子和eye终止子。在其他实施 例中，用于表达脆弱拟杆菌XI蛋白的相同转录单元也被工程化进入在图5 和图6各自地示出的整合质粒421bsd rDNA Phxt-Xibf（421构建体）和423 rDNA Phxt-XIbf（423构建体）。这些整合质粒的每一个包含对于酵母核糖 体RNA基因的核苷酸序列，用于靶向重组进入染色体，该染色体处于编 码核糖体RNA的区域中，在酿酒酵母中该核苷酸序列是多拷贝基因。该 423质粒携带对于卡那霉素抗性的标记基因，同时该421质粒额外携带该 标记基因bsd，赋予对杀真菌剂杀稻瘟素的抗性。

421构建体被整合进入亲本酿酒酵母菌株Y500的染色体中，这是 一个示例性的商业化的乙醇生产酵母菌株。在乙醇生产力方面，该商业化 菌株具有其他可商购菌株（例如Ethanol Red^TM，从Lesaffre Group（乐思福 集团）可得（Cedar Rapids（锡达拉皮兹）Iowa（爱荷华州）））的典型特 征。针对杀稻瘟素抗性，选择包含421构建体的转化体。针对其在包含酵 母提取物和蛋白胨（YEP）与2%wt/v木糖作为唯一碳源的培养基的烧瓶 中的生长能力，测试在图1中所提及的初始转化体421i，与包含有相同bsd 载体但是缺乏脆弱拟杆菌XI编码区（Y500+bsd）的对照比较。如在图1 示出，在最初的几个小时内，对照组菌株在YEP培养基中停止生长，推测 是在该YEP培养基中残留碳源耗尽后。相比之下，承载421构建体的表达 脆弱拟杆菌XI的菌株在木糖上持续生长至少150小时的时期。

本发明的另一个方面是认识到，使用木糖异构酶/木酮糖激酶的用 于从木糖中生产乙醇的两基因途径的问题之一是，在细胞内木糖醇的意外 积累。这是一个令人惊讶的发现，因为酿酒酵母天然地不包含木糖还原酶 活性。尽管并不受理论限制，但是据信一种或更多非特异性醛醇还原酶（例 如那些由酿酒酵母gre3基因编码的那些）的活性，可以转化重要的一部分 醛醇糖类（包括木糖）为木糖醇。因为如上提到，木糖醇是木糖异构酶的 抑制剂，木糖醇的细胞内积累可以抑制木糖异构化为木酮糖，减慢了从木 糖醇生产乙醇。美国专利公开号20080261287可以在另一系统中至少部分 地解决该问题，通过缺失gre3基因并且同时过表达在酿酒酵母中的 Piromyces木糖异构酶xylA基因。然而，尽管据报道这类菌株几乎不积累 木糖醇，但是来自木糖的乙醇产量仍然保持低的，本发明的诸位发明人相 信这是由于可以引起木糖醇积累的其他因素。

为了对此进行补偿，本发明的一个实施例是同时表达外源木糖醇 脱氢酶连同外源木糖异构酶。这代表了一种新颖的2基因解决方案，其中 木糖不直接由XI转化为木酮糖，同时，木糖醇的该非特异性积累池也通 过XD阻止由木糖醇抑制木糖至木酮糖的XI转化，被朝向木酮糖清除。

Y500连同染色体整合载体被工程化，在图4中示出质粒 bsdYIMrDNA.Pxd-XD Phxt-Xibf(437)。该质粒携带bsd、抗性基因、编码在 酵母Hxt7启动子的控制下可操作地连接的来自脆弱拟杆菌的XI的xylA基 因，如在以上提及的421构建体和423构建体中，但是另外携带编码在树干 毕赤酵母启动子控制下可操作地连接的XD的来自树干毕赤酵母（参见US. 5,789,210）的xyl2基因。选择具有他整合进入Y500染色体的它的载体的杀 稻瘟素抗性菌株，测试其利用木糖进行生长并发酵木糖以产生乙醇的能力 。

图1示出在含有2%木糖作为唯一添加碳源的培养基上，在摇瓶中 XI/XD构建体437的生长，与对照菌株Y500相比，Y500只表达XD，并 且Y500只表达XIbf。同时表达XI和XD的菌株的生长速率被增强超过每 一个对照菌株。

同时表达XI和XD的解决方案也可以有利地与一个三基因解决方 案一起被实施，该三基因解决方案另外包括过表达木酮糖激酶（XK）。不 同于使用木糖还原酶和木糖醇脱氢酶和过表达木酮糖激酶的组合的三基 因途径，本发明不要求，并且的确优先省略木糖还原酶活性的表达。XK 的过表达将改进来自木糖的乙醇生产，如果其中木糖的该过量积累是速率 限制的话。情况可以是这样，其中一种或更多XI或XD活性也被过表达， 或者当时那些活性已经被修饰以生产更高转化数或减少变构抑制。