一种止嗽定喘丸的含量测定方法

技术领域

本发明属于中药制剂鉴别技术领域，涉及一种止嗽定喘丸的含量测定方法。

背景技术

止嗽定喘丸（浓缩丸）源自汉代张仲景《伤寒论》中麻杏石甘汤，由麻黄、石膏、甘草、苦杏仁组成，具有辛凉宣泄、清肺平喘的功效。收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二十册。方中君药麻黄有清肺平喘的功效，有效成分为麻黄碱、伪麻黄碱等生物碱类成分，止嗽定喘丸标准中无这两种成分的定量测定方法。为了提高止嗽定喘丸的质量控制水平，现将其质量标准进行了提高、完善，从而完成了本发明。

发明内容

本发明公开了一种止嗽定喘丸的含量测定方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）对照品溶液的制备：

取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml各含50μg、15μg的混合溶液备用；

（2）供试品溶液的制备：

取本品，除去薄膜衣，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟（功率600W，频率50kHz），放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液备用；

（3）测定：将步骤（1）、步骤（2）提取得到的对照品溶液、供试品溶液，分别精密吸取5μl，注入高效液相色谱仪中进行测定，色谱条件：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂固定相；以乙腈：0.092%磷酸溶液体积比为2：100为流动相；检测波长为210nm；柱温：25℃；流速：0.5ml/min，理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000，

止嗽定喘丸中每1g含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的总量不得少于2.1mg。

本发明所述的含量测定方法，其中其中0.092%磷酸混合溶液指的是：该混合溶液中含有0.092%的磷酸、0.04%的三乙胺和0.02%的二正丁胺。

本发明所述的含量测定方法，可测定相同或相近含有盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱组成的任何一种剂型。包括水蜜丸、大蜜丸、片剂、浓缩丸、颗粒或胶囊

本发明更加详细的制备方法及测定方法如下：

1、钙盐的鉴别反应

本项为新增项目。方法参照中国药典2010年版一部附录Ⅵ一般鉴别试验项下钙盐鉴别方法（2）制定此标准。

取本品0.5g，除去包衣，研细，加稀盐酸10ml，加热使溶解，过滤。取滤液2ml，加草酸铵试液，即生成白色沉淀，所得沉淀不溶于醋酸，但溶于稀盐酸。

含量测定

盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量测定

现行标准无含量测定项目。本药处方中有麻黄、甘草、杏仁、石膏四味药材。麻黄作为处方中的君药既有粉碎又有提取，参考《中国药典》2010年版一部麻黄的含量测定方法，采用高效液相色谱法，以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱为定量指标，通过反复的实验摸索制定了处方中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定方法：

2.1仪器与试药

仪器：日本SHIMADZU LC-2010AHT高效液相色谱仪，UV-VIS检测器，Class-VP工作站。

色谱柱：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂固定相的色谱柱，Ultimate Phenyl Ether，5μ，250×4.6mm

试剂：甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司），

乙腈（色谱纯，Merck），

磷酸（分析纯，天津市化学试剂六厂），

盐酸（优质纯，天津市试剂五厂），

三乙胺（分析纯，天津市申泰化学试剂有限公司），

二正丁胺（分析纯，天津市申泰化学试剂有限公司），

水为去离子水。

对照品：盐酸麻黄碱对照品（批号171241-201007中国药品生物制品检验所购置，供含量测定用），盐酸伪麻黄碱对照品（批号171237-200807中国药品生物制品检验所购置，供含量测定用）。

样品：天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂生产（批号091001—100508）

2.2色谱条件

2.2.1检测波长的选择：参考《中国药典》2010年版一部麻黄含量测定项，规定其检测波长为210nm。

2.2.2流动相的选择：参考《中国药典》2010年版一部麻黄药材项下的流动相，并根据供试品色谱情况进行流动相的筛选，结果见表1。

表1流动相的选择

 结果显示：考虑目标峰分离，最终选择流动相7为最佳比例。

2.2.3色谱条件：根据以上试验并参照《中国药典》2010年版一部麻黄含量测定方法制定本方法色谱条件。

以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂固定相；以乙腈-0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）（2：100）为流动相；检测波长为210nm；柱温：25℃；流速：0.5ml/min。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000。参考中国药典2010年版中麻黄的含量测定方法，结合麻黄所含成分的特性，进行以下试验。

2.3供试品的制备

2.3.1提取溶剂的选择：

参考中国药典2010年版一部麻黄药材项下含量测定方法中的供试品溶液提取溶剂，选取1.44%磷酸溶液为溶剂。

2.3.2提取溶剂用量及取样量的选择：

取同一批号（批号：091002）样品，研细，分别取样。

方法1：取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法2：取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法3：取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法4：取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。上述几种方法提取得样品分别精密吸取5μl，注入高效液相色谱仪中，按“2.2.3”色谱条件分析。

测定上述四样品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量，结果见表2。

表2取样量的筛选

结果显示采用方法4制备样品，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量较高，提取充分，且色谱峰分离较好，且理论塔板数符合要求，因此确定方法4为样品取样量及溶剂容量。

2.3.3提取方法的选择：

取同一批号（批号：091002）样品，研细，分别称取两份样品各0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50ml，称定重量，分别选择回流提取30分钟和超声处理30分钟提取样品，放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

分别精密吸取5μl，注入高效液相色谱仪中，按“2.2.3”色谱条件分析。测定上述两种方法样品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量，结果见表3。

表3提取方法的选择

结果显示采用超声30min（功率600W，频率50kHz）制备样品，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量较高，提取充分。

2.3.4提取时间的选择：

取同一批号（批号：091002）样品，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液25ml，称定重量，分别超声处理不同时间，放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。上述处理样品分别精密吸取5μl，注入高效液相色谱仪中，按“2.2.3”色谱条件分析。

测定上述各样品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量，结果见表4。

表4提取时间的选择

结果显示采用方法2制备，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的总量较高，提取充分。

2.3.5确定供试品的制备方法：

取本品，除去薄膜衣，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟（功率600W，频率50kHz），放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4溶液的制备

2.4.1对照品溶液的制备：

取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml各含50μg、15μg的混合溶液，即得。

2.4.2供试品溶液的制备：

取本品，除去薄膜衣，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.3空白对照品溶液制备：

按处方、工艺，除去麻黄制备空白对照品，再将空白对照品粉碎成细粉，按“2.4.2”项方法制备空白对照品溶液。

2.4.4测定：将“2.4.1～2.4.3”项下的各种溶液，分别精密吸取5μl，注入高效液相色谱仪中，按“2.2.3”色谱条件分析。得到的色谱图如下，对照品溶液色谱图见图（1），供试品溶液色谱图见图（2），空白对照品溶液色谱图见图（3）。如图可见，空白对照品在与盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱色谱峰相应的保留时间处无色谱峰。

2.5标准曲线的制备

2.5.1盐酸麻黄碱标准曲线：

取盐酸麻黄碱对照品溶液（浓度：0.05136mg/ml）分别进样1μl，2μl，4μl，6μl，8μl，10μl，12μl注入高效液相色谱仪，以进样体积为横坐标，以峰面积为纵坐标做线性回归。结果见表5，线性曲线如图4所示。

表5线性考察结果

由数据得回归方程为：Y=A+BX=2.2641×10⁷X-2222.344，R=0.9999

结果表明盐酸麻黄碱在0.01027～0.12326μg范围内线性关系良好。

2.5.2盐酸伪麻黄碱标准曲线：

取盐酸伪麻黄碱对照品溶液（浓度：0.01487mg/ml）分别进样1μl，2μl，4μl，6μl，8μl，10μl注入高效液相色谱仪，以进样体积为横坐标，以峰面积为纵坐标做线性回归。结果见表6，线性曲线如图5所示。

表6线性考察结果

由数据得回归方程为：Y=A+BX=2.1546×10⁷X+336.3244，R=0.9999

结果表明盐酸伪黄碱在0.002974～0.035688μg范围内线性关系良好。

2.6方法学验证

2.6.1进样重复性（精密度）试验

取同一批号（批号：091002）样品，研细，取约0.5g，精密称定，按照“2.4.2”供试品溶液制备操作，按“2.2.3”色谱条件分析，连续进样6次，测定样品中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的峰面积，测得盐酸麻黄碱峰面积平均值：1078634，峰面积的RSD为0.28%；测得盐酸伪麻黄碱峰面积平均值：360680，峰面积的RSD为1.4%，表明精密度良好，结果见表7、8。

表7盐酸麻黄碱进样重复性试验

表8盐酸伪麻黄碱进样重复性试验

2.6.2重现性试验

取同一批号（批号：091002）样品，共6份，研细，取约0.5g，精密称定，按照“2.4.2”供试品溶液制备操作，按“2.2.3”色谱条件分析，测定每份样品中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量。测得盐酸麻黄碱含量平均值为2.4680mg/g，含量的RSD为0.4%；测得盐酸伪麻黄碱含量平均值为0.8487mg/g，含量的RSD为1.1%。符合要求，结果见表9、表10。

表9盐酸麻黄碱进样重现性试验

表10盐酸伪麻黄碱进样重现性试验

2.6.3稳定性试验

取同一批号（批号：091002）样品，研细，取约0.5g，精密称定，按照“2.4.2”供试品溶液制备操作，按“2.2.3”色谱条件分析，分别在0、2、4、6、8、10小时，测定样品中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的峰面积，测得盐酸麻黄碱峰平均峰面积值的RSD为0.4%；测得盐酸伪麻黄碱平均峰面积值的RSD为1.3%；结果表明，供试品溶液在10小时内稳定，结果见表11、表12。

表11盐酸麻黄碱稳定性试验

表12盐酸伪麻黄碱稳定性试验

2.6.4回收率试验

取同一批号（批号：091002）样品，研细，取约0.25g，共6份，精密称定，分别精密加入盐酸麻黄碱对照品及盐酸伪麻黄碱对照品的1.44%磷酸溶液（0.02549mg/ml）及盐酸伪麻黄碱对照品1.44%磷酸溶液（0.010756mg/ml）25ml，再按照“2.4.2”供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“2.2.3”色谱条件分析，计算回收率，结果盐酸麻黄碱平均回收率为95.2%，RSD为1.5%；盐酸伪麻黄碱平均回收率为101.0%，RSD为1.6%。符合规定，结果见表13、表14。

表13盐酸麻黄碱回收率试验

表14盐酸伪麻黄碱回收率试验

2.7样品测定

取该品8个批号的样品，按照“2.4.2”供试品溶液制备操作，按“2.2.3”色谱条件测定样品中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量。结果见表15。

表15八批样品含量测定结果

3.07mg/g×70%=2.1mg/g

    根据以上八批的检测结果，确定止嗽定喘丸中每1g含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的总量不得少于2.1mg。

本发明公开的止嗽定喘丸含量测定方法与现标准相比，所具有的积极效果在于：

（1）本发明增加了钙盐的理化鉴别，增加了君药麻黄的含量测定方法，采用HPLC测定了止嗽定喘丸中的盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的含量。本发明所要解决的问题是提供一种止嗽定喘丸的含量检测方法，通过此含量测定方法，可控制该止嗽定喘丸的质量。

（2）本发明所述的质量控制方法，可检测提取方法相同或相近含有盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱组成的任何一种剂型。包括水蜜丸、大蜜丸、浓缩丸、颗粒或胶囊。优选止嗽定喘丸的质量控制方法。

（3）本发明增加了止嗽定喘丸中盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的含量测定方法，提高了止嗽定喘丸的质量控制标准，从而有效确保了止嗽定喘丸的安全、均一、稳定、有效、可控，保证了工艺的规范化和质量的稳定一致。

附图说明：

图1为盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品的HPLC图谱；

图2为供试品的HPLC图谱；

图3为空白对照品的HPLC图谱；

图4为盐酸麻黄碱线性曲线图；

图5为盐酸伪麻黄碱线性曲线图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例1

止嗽定喘丸的制备（批号091001—100508）

【处方】    麻黄     200g       甘草      200g

        苦杏仁   200g       石膏      200g

以上四味共重800g

【制法】以上四味，取出麻黄80g与石膏粉碎成细粉，备用；其余麻黄与苦杏仁、甘草二味加水，煎煮二次，合并煎液，滤过，浓缩成膏。将麻黄与石膏粉末加入膏内，搅匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，用水泛丸，干燥，包薄膜衣，即得。

【性状】本品为包薄膜衣的浓缩丸，除去薄膜衣显棕褐色；味甘、苦。

实施例2

止嗽定喘丸的含量测定方法：

（1）对照品溶液的制备：

取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱50μg和盐酸伪麻黄碱15μg的混合溶液备用；

（2）供试品溶液的制备：

取本品，除去薄膜衣，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟（功率600W，频率50kHz），放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液备用；

（3）测定：

将步骤（1）、步骤（2）提取得到的对照品溶液、供试品溶液，分别精密吸取5μl，注入高效液相色谱仪中进行测定，色谱条件：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂固定相；以乙腈：0.092%磷酸溶液体积比为2：100为流动相；检测波长为210nm；柱温：25℃；流速：0.5ml/min，理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000，止嗽定喘丸中每1g含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的总量为2.672mg。其中0.092%磷酸混合溶液指的是：该混合溶液中含有0.092%的磷酸、0.04%的三乙胺和0.02%的二正丁胺。

实施例3

止嗽定喘片中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定。

（1）对照品溶液的制备：

取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱50μg和盐酸伪麻黄碱15μg的混合溶液备用；

（2）供试品溶液的制备：

取止嗽定喘片，除去薄膜衣，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟（功率600W，频率50kHz），放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液备用；

（3）测定：

将步骤（1）、步骤（2）提取得到的对照品溶液、供试品溶液，分别精密吸取5μl，注入高效液相色谱仪中进行测定，色谱条件：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂固定相；以乙腈：0.092%磷酸溶液体积比为2：100为流动相；检测波长为210nm；柱温：25℃；流速：0.5ml/min，理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000，止嗽定喘丸中每1g含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的总量为2.732mg。其中0.092%磷酸混合溶液指的是：该混合溶液中含有0.092%的磷酸、0.04%的三乙胺和0.02%的二正丁胺。

实施例4

对比试验：

止嗽定喘丸由于受当时科研水平的限制，其质量标准中没有理化鉴别及含量测定两项检测标准。因此不能有效地控制产品质量，导致止嗽定喘丸中盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱含量不稳定、质量很难控制。

现在止嗽定喘丸的含量测定方法

（1）对照品溶液的制备：

取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含盐酸麻黄碱50μg和盐酸伪麻黄碱15μg的混合溶液备用；

（2）供试品溶液的制备：

取本品，除去薄膜衣，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称定重量，用1.44%磷酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液备用；

（3）测定：

将步骤（1）、步骤（2）提取得到的对照品溶液、供试品溶液，分别精密吸取5μl，注入高效液相色谱仪中进行测定，色谱条件：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂固定相；以乙腈：0.092%磷酸溶液体积比为2：100为流动相；检测波长为210nm；柱温：25℃；流速：0.5ml/min，理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于3000，止嗽定喘丸中每1g含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的总量为3.689mg。其中0.092%磷酸混合溶液指的是：该混合溶液中含有0.092%的磷酸、0.04%的三乙胺和0.02%的二正丁胺。

结论：

本发明采用HPLC测定了止嗽定喘丸中的盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的含量，提高了止嗽定喘丸的质量控制标准，从而有效确保了止嗽定喘丸的安全、均一、稳定、有效、可控，保证了工艺的规范化和质量的稳定一致。