一种咖啡浆果炭疽病菌快速分子检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的快速检测的特异引物 组、环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)试剂盒及其应 用。

背景技术

刺盘孢属(Colletotrichum)真菌是具有重要经济意义和学术价值的类群，其中很 多种类能够引起一些经济作物和花卉植物的植物病害，即炭疽病。咖啡浆果炭疽病菌 (C.kahawae)能够引起咖啡浆果的严重病变，是刺盘孢属中唯一一种我国植物病原 真菌检疫对象(中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录，2007)，它曾被作为胶 孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的复合种(species complex)处理，直到1993年才被 重新作为一个新种确认(Waller，J.M.，Bridge，P.D.，et.al.1993.Characterization of the  coffee berry disease pathogen，Colletotrichum kahawae sp.nov.Mycol Res 97，989-994.)。 但到目前为止，还没有建立起一个快速、简单和准确的特定识别咖啡浆果炭疽病菌(C. kahawae)的分子诊断(molecular diagnosis)的方法和技术平台。

此前，其它病原刺盘孢属真菌的鉴定检测都以ITS区(internal transcribed spacer of  rRNA)为靶序列(Sreenivasprasad，S.，Sharand，K.，et al.1996.PCR-based detection of  Colletotrichum acutatum on strawberry.Plant Pathology 45，650-655；Natalia，A.R.P.，Eiko， E.K.，et al.2002.Identification and characterization of Colletotrichum spp.affecting fruit  after harvest in Brazil.Phytopathology 150，128-134；唐建辉，王伟，王源超，2006.西瓜 炭疽病菌Colletotrichum orbiculare的分子检测.中国农业科学39(10)：2028-2035)，方 法也很复杂和费时，而且这些方法都是建立在刺盘孢属中许多复合种的基础上，无法 对这些复合种中被重新确定的新种或隐含种(cryptic species)特异准确地区分和鉴定， 因此，在刺盘孢属真菌的分类系统发生重大变化后，建立这些严重病原真菌的快速和 准确的物种识别技术体系，需要重新选择合适的靶基因并利用最新的简单快速的技术 方法。近些年来，ACT、TUB2、Apn2/Mat和GPDH等基因已经被用于刺盘孢属真 菌的分子系统学研究中，而且已经证明Apn2/Mat是一个很好的分子标记(Silva，D.N.， Talhinhas，P.，Várzea，V.，Cai，L.，Paulo，O.S.，Batista，D.2011.Application of the Apn2/MAT locus to improve the systematics of the Colletotrichum gloeosporioides  complex：an example from coffee(Coffea spp.)hosts.Mycologia(DOI 10.3852/11-145))。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种非 常出色的快速特异性检测的方法(Notomi，T.H.，Okavama，H.，Masubuchi，T.，et al.，2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res 28(12)：e63； Nagamine，K.，Hase，T.，Notomi，T.，2002.Accelerated reaction by loop-mediated  isothermalcation using loop primers.Molecular and Cellular Probes 16，223-229； Parida，M.，Sannarangaiah，S.，Dash，P.K.，Rao，P.V.L.，Morita，K.2008.Loop mediated  isothermal amplification(LAMP)：a new generation of innovative gene amplification  technique；perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases.Rev.Med.Virol.18：407 -421)，整个反应过程在恒温条件下进行，反应速度特别快，只要30分钟到90分钟就 可以完成，结果可用凝胶成像观察，也可以用比浊仪，甚至肉眼可以观察，具有操作 简单、快速高效、特异性强、灵敏度高、鉴定简便等特点。近年来，在真菌的快速检 测中也发挥了很好的作用。但是，基于关键技术的限制，特别是引物的设计以及与引 物相关的检测试剂技术问题，目前尚未有应用LAMP检测病原刺盘孢属真菌的相关技 术报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的环 介导等温扩增引物组。

本发明所提供的引物组以Apn2/Mat基因为靶基因，由引物1、引物2、引物3和 引物4组成，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为 序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

所述引物组中所述引物1(F3)、所述引物2(B3)、所述引物3(FIP)和所述引 物4(BIP)在环介导等温扩增反应体系中的使用配比(摩尔比)为1∶1∶8∶8。

所述引物组中，引物1(F3)和引物2(B3)组成外侧引物对；引物3(FIP)和 引物4(BIP)组成内侧引物对。序列1由20个核苷酸组成，序列2由25个核苷酸组 成，序列3由45个核苷酸组成，序列4由41个核苷酸组成。

本发明的又一个目的是提供检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的 环介导等温扩增试剂。

本发明所提供的试剂包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱(Betaine)、dNTPs、Mg²⁺、 以及上述引物组。

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所 述链置换型DNA聚合酶、和所述甜菜碱在环介导等温扩增试剂中的配比为0.2μM∶ 0.2μM∶1.6μM∶1.6μM∶1.4mM∶8mM∶8U∶0.8M。

在本发明的实施例中，所述链置换型DNA聚合酶具体为Bst DNA聚合酶或所述 Bst DNA聚合酶的大片段。

本发明所提供的试剂还包括荧光显色剂。在本发明的实施例中，所述荧光显色剂 具体为钙黄绿素(Calcein)。

在本发明的实施例中，所述试剂具体由Bst DNA聚合酶(或Bst DNA聚合酶大片 段)、甜菜碱、dNTPs、Tris-HCl、KCl、(NH4)₂SO₄、MgSO₄、吐温20、钙黄绿素和本 发明所提供的引物组组成。

在实际使用过程中，上述试剂的各组分在环介导等温扩增反应体系中的终浓度为： 内引物FIP(序列3)和BIP(序列4)各1.6μmol/L，外引物F3(序列1)和B3(序 列2)各0.2μmol/L，dNTPs 1.4mmol/L，甜菜碱(Betaine)0.8mol/L，Tris-HCl(pH 8.8) 20mmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)₂SO₄ 10mmol/L，MgSO₄ 8mmol/L，吐温200.1％ (体积百分含量)，Bst DNA聚合酶8U，钙黄绿素(Calcein)0.16mmol/L。

本发明的另一个目的是提供检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的 环介导等温扩增试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包含本发明所提供的引物组，或本发明所提供的试剂。

所述检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的环介导等温扩增引物组在制备检测 或辅助检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的 保护范围。

所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有 咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)中的应用也属于本发明的保护范围。

应用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒检测或辅助检测待测样品中是否含 有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的方法，包括如下步骤：用所述引物组，或所述 试剂，或所述试剂盒在63℃-65℃，如65℃条件下对所述待测样品进行时长1h的环介 导等温扩增反应，反应结束后，具体按照如下1)-3)中至少一种方法确定所述待测 样品中是否含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)：

1)通过肉眼直接观察，如果所述待测样品反应液出现大量白色沉淀物，则说明所 述待测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选含有咖啡浆果炭疽病菌(C. kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者 候选不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；

2)在环介导等温扩增反应体系中加入终浓度为0.16mmol/L的钙黄绿素(Calcein) 作为荧光显色剂，在紫外灯下观察所述待测样品反应液颜色，如果为绿色荧光，则说 明所述待测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选含有咖啡浆果炭疽病 菌(C.kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae) 或者候选不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；

3)将所述待测样品的环介导等温扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成 像仪下观察结果，如果观察到典型的连续梯状条带，则说明所述待测样品含有咖啡浆 果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；反之，则 说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)或者候选不含有咖啡浆果 炭疽病菌(C.kahawae)。

所述待测样品为微生物样品或是植物样品，可以为DNA。

在本发明的实施例中，所述咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)具体为咖啡浆果炭 疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578。

本发明提供了以Apn2/Mat基因为靶基因的用于检测咖啡浆果炭疽病菌(C. kahawae)的特异性引物组、试剂及试剂盒，其检测灵敏度达到0.08pg/μL的模板基因 组DNA，具有特异性强、灵敏度高特点；整个检测反应处于恒温条件下进行，不需要 PCR仪等特殊设备，只要水浴锅等在恒温条件下就能完成，反应时间只要60分钟， 因此具有操作简单、快速高效的特点；检测结果用比浊仪，甚至肉眼就可以观察，更 实用和方便。

附图说明

图1为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C. kahawae)IMI363578的LAMP检测结果。其中，A为紫外线下钙黄绿素(Calcein) 荧光反应结果；B为GelRed染色的凝胶电泳结果。A和B中，1均为咖啡浆果炭疽病 菌(C.kahawae)IMI319418；2均为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578。

图2为LAMP反应温度条件的优化结果。其中A为浊度仪实时显示反应结果图； B为紫外线下钙黄绿素(Calcein)荧光反应结果。A和B中，1均表示咖啡浆果炭疽 病菌(C.kahawae)IMI319418；2均表示近源种C.fructicola MFLU 090228；3均表示 阳性对照。

图3为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的LAMP反应特异性检测结果。其中， A为紫外线下钙黄绿素(Calcein)荧光反应结果；B为GelRed染色的凝胶电泳结果。 A和B中，1-13均依次表示C.kahawae IMI319418、C.kahawae IMI363578、C.horii、 C.fructicola、C.siamense、C.asianum、C.gloeosporioides、C.musae、C.jasmini-sambac、 C.fragariae、C.simmondsii、CK1、CK2。B中的泳道M为Marker(自上而下条带大 小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图4为咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的LAMP反应灵敏性检测结果。其中， A为紫外线下钙黄绿素(Calcein)荧光反应结果；B为GelRed染色的凝胶电泳结果。 A和B中，1-11均依次表示咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418纯化后基因 组DNA在25μL的LAMP反应体系中的质量顺次为4ng、2ng、1.0ng、0.2ng、0.1 ng、0.02ng、0.01ng、0.002ng、0.001ng、0.0002ng和0ng。B中的泳道M为Marker (自上而下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)IMI319418：参考文献Phoulivong S， Cai L，Chen H，McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010. Colletotrichum gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers 44：33-43.

咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)IMI363578：参考文献Phoulivong S， Cai L，Chen H，McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010. Colletotrichum gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers 44：33-43.

Colletotrichum asianum MFLU 090233：参考文献Phoulivong S，Cai L，Chen H， McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010.Colletotrichum  gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers 44：33-43.

Colletotrichum fragariae ICMP 17927：参考文献Silva，D.N.，Talhinhas，P.，Várzea，V.， Cai，L.，Paulo，O.S.，Batista，D.2011.Application of the Apn2/MAT locus to improve the  systematics of the Colletotrichum gloeosporioides complex：an example from coffee (Coffea spp.)hosts.Mycologia(DOI 10.3852/11-145).

Colletotrichum fructicola MFLU 090228：参考文献Prihastuti H，Cai L，Chen H， McKenzie EHC，Hyde KD.2009.Characterization of Colletotrichum species associated  with coffee berries in northern Thailand.Fungal Divers 39：89-109

Colletotrichum gloeosporioides CBS953.97：参考文献Phoulivong S，Cai L，Chen H， McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010.Colletotrichum  gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers 44：33-43.

Colletotrichum horii ICMP 12942：参考文献Wikee S，Cai L，Pairin N，McKenzie EHC， Su YY，Chukeatirote E，Thi HN，Bahkali AH，Moslem MA，Abdelsalam K.2011. Colletotrichum species from jasmine(Jasminum sambac).Fungal Divers 46：171-182.

Colletotrichum jasmini-sambac CLTA-01：参考文献Wikee S，Cai L，Pairin N， McKenzie EHC，Su YY，Chukeatirote E，Thi HN，Bahkali AH，Moslem MA，Abdelsalam K. 2011.Colletotrichum species from jasmine(Jasminum sambac).Fungal Divers 46：171-182.

Colletotrichum musae CBS 116870：参考文献Abd-Elsalam K.A.，Roshdy S.，Amin O.E.，Rabani M.2010.First morphogenetic identification of the fungal pathogen  Colletotrichum musae(Phyllachoraceae)from imported bananas in Saudi Arabia.Genetics  and Molecular Research 9(4)：2335-2342.

Colletotrichum siamense MFLU 090230：参考文献Wikee S，Cai L，Pairin N， McKenzie EHC，Su YY，Chukeatirote E，Thi HN，Bahkali AH，Moslem MA，Abdelsalam K. 2011.Colletotrichum species fromjasmine(Jasminum sambac).Fungal Divers 46：171-182.

Colletotrichum simmondsii BRIP28519：参考文献Phoulivong S，Cai L，Chen H， McKenzie EHC，Abd-Elsalam K，Chukeatirote E，Hyde KD.2010.Colletotrichum  gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits.Fungal Divers 44：33-43.

实施例1、LAMP反应栓测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)

一、检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的环介导等温扩增引物组的制备

本实施例检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的环介导等温扩增引物组由引物1、 引物2、引物3和引物4组成。这四个引物按照如下方法制备：根据本实验室已经克 隆的咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)及该属最新发表的8个近源种和1个较远源种 (表1)的Apn2/Mat基因序列，应用ClustalX 1.81和BioEdit 7.0软件对这些基因序 列进行比对分析，找到多态性丰富的区域，使用在线软件Primers-Primer Explore (Fujitsu Ltd.，Tokyo，Japan)(http://primer explorer.jp/e/)，结合一般引物设计的基本原 则，设计并人工合成出一组特异性LAMP检测引物，包括F3、B3、FIP和BIP，所述 引物核苷酸序列(5′-3′)分别描述如下：

F3(序列1，引物1)：CAAGACTTACCTTGCGCCAG

B3(序列2，引物2)：GGCTTGCAGCTTATAATTACAGTTC

FIP(序列3，引物3)：

GGTTCGTCAGATCCAGTCATCTCC TT CCACAAACCTTT GTGCGGT

BIP(序列4，引物4)：

CGTCTGCTTCGATGGCAAC T GCGAATACATGGGTTGTGAAT

二、利用咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)模式菌株验证步骤一的引物组

本实施例用于检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的环介导等温扩增试剂具体 由Bst DNA聚合酶大片段、甜菜碱、dNTPs、Tris-HCl、KCl、(NH4)₂SO₄、MgSO₄、 吐温20、钙黄绿素和步骤一的引物组组成。其中，引物1、引物2、引物3、引物4、 dNTPs、Mg²⁺、Bst DNA聚合酶大片段、和甜菜碱在环介导等温扩增试剂中的配比为 0.2μM∶0.2μM∶1.6μM∶1.6μM∶1.4mM∶8mM∶8U∶0.8M。

以下将以咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的模式菌株验证利用步骤一制备所得 引物组进行LAMP反应检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的准确度，具体方法如 下所述：

1、采用CTAB法(Yang and Liu.2005.Dactylella coccinella sp.nov.，an anamorphic  species.Mycotaxon，91：127-132.)提取咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和 咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578的基因组DNA，作为LAMP反应的模板， 具体操作如下：用无菌手术刀刮下无培养基的真菌培养物约100mg于无菌研钵中，倒 入液氮，用研钵将菌丝充分研磨，以无菌药勺将研磨出的菌丝粉末转入1.5ml的离心 管中(此步也可用石英砂研磨来代替)；在离心管中加入600μl的2％CTAB缓冲液(配 方：CTAB的终浓度为2％(w/v)、Tris-HCl的终浓度为100mmol/L、NaCl的终浓度为 1.4mol/L、EDTA的终浓度为20m mol/L、PVP的终浓度为1％(w/v)，pH 8.0)，65℃温 浴1h，中间轻摇动离心管3次使溶液混匀；加入300μl Tris饱和酚，盖上离心管帽， 颠倒离心管，充分混匀。再加入300μl氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，充分混匀， 轻摇动离心管10min，12000r/min离心10min并移上清至另一无菌离心管中；加入 600μl氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，充分混匀，轻摇动离心管10min，12000r/min 离心10min并移上清至另一无菌离心管中；重复上述步骤1-2次至液面分界处无明显 沉淀出现。12000r/min离心10min，移上清至另一只无菌离心管中；加入0.8-1倍体 积的预冷的异丙醇，混匀后-20℃放置30min以上，12000r/min离心10min，后弃 上清；加入200μl浓度为70％的乙醇轻弹离心管充分浸洗，使沉淀重悬，重复2-3次， 必要时12000r/min离心10min，去上清，室温下在净化工作台干燥至无液滴挂壁； 用50-100μl TE缓冲液(配方：终浓度为10mM的Tris-HCl、终浓度为1mM的EDTA， pH 8.0)溶解DNA沉淀，得到，-20℃冰箱保存备用。

2、以Apn2/Mat基因为靶基因，采用步骤一制备所得的引物组，对步骤1制备所 得的咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae) IMI363578基因组DNA分别作为模板进行LAMP反应。其中，LAMP反应体系：内 引物FIP(序列3)和BIP(序列4)的终浓度各为1.6μmol/L，外引物F3(序列1) 和B3(序列2)的终浓度各为0.2μmol/L，dNTPs终浓度为1.4mmol/L，甜菜碱(Betaine) 终浓度为0.8mol/L，Tris-HCl(pH 8.8)终浓度为20mmol/L，KCl终浓度为10mmol/L， (NH4)₂SO₄终浓度为10mmol/L，MgSO₄终浓度为8mmol/L，吐温20终浓度为0.1％， Bst DNA聚合酶大片段8U，模板(上述步骤1制备的表1中各菌株的基因组DNA) 2μL，钙黄绿素(Calcein)1μL(浓度为4mM高效液相色谱(HPLC)纯化的钙黄 绿素的二甲基亚砜(DMSO)溶液)，双蒸水定容至25μL。LAMP反应条件为：将上 述25μL LAMP反应体系迅速置于65℃水浴锅，反应1h后，置于80℃5min，终止 反应。

3、LAMP反应结果的判断有3种方法：1)通过肉眼直接观察，如果所述待测样 品反应液出现大量白色沉淀物，则说明所述待测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C. kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；2) 在紫外灯下观察所述待测样品反应液颜色，如果为绿色荧光，则说明所述待测样品含 有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡浆果炭疽 病菌(C.kahawae)；3)将所述待测样品的环介导等温扩增反应产物进行琼脂糖电泳 检测，并在凝胶成像仪下观察结果，如果观察到典型的连续梯状条带，则说明所述待 测样品含有咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)；反之，则说明所述待测样品不含有咖啡 浆果炭疽病菌(C.kahawae)。

检测结果如图1所示：紫外灯下，两个待测样品的反应液显示绿色荧光；同时琼 脂糖凝胶电泳结果也同样显示为连续的梯状条带，显示咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株 咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae) IMI363578的检测结果均为阳性。与实际情况相符。这表明利用步骤一制备所得引物 组进行LAMP反应检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)的检测结果确实可信。

实施例2、LAMP检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)反应温度条 件的优化

本实施例利用步骤一制备所得引物组，以咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae) IMI319418、近源种C.fructicola MFLU 090228，以及阳性对照(λ噬菌体Hind III片段 (6,557bp)插入的质粒DNA，Eiken Chemical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan，Lot No.18001) 为实验材料，在不同温度(61℃、63℃、65℃)下进行LAMP反应，从而优化影响 LAMP反应的重要参数-温度。具体操作如下：

1、采用CTAB法(Yang and Liu.2005.Dactylella coccinella sp.nov.，an anamorphic  species.Mycotaxon，91：127-132.)提取基因组DNA模板，具体操作同实施例1中步骤 二1。

2、以Apn2/Mat基因为靶基因，采用实施例1中步骤一制备所得的引物组，对步 骤1制备所得的待测样品基因组DNA模板进行LAMP反应。LAMP反应体系同实施 例1中步骤二2，反应条件中将温度设置为61℃、63℃和65℃三种，其余与实施例1 中步骤二2相同。

3、LAMP反应结果的判断：具体的判断方法同实施例1中步骤二3。

结果如图2所示，在选择的3个实验材料中，在61℃、63℃和65℃三个温度下 进行120分钟反应，只有在61℃反应温度下近源种C.fructicola MFLU 090228出现阳 性反应(浊度仪和荧光反应)，63℃和65℃则为阴性，同时咖啡浆果炭疽病菌(C. kahawae)IMI319418和阳性对照都出现阳性反应，说明61℃反应温度下会出现假阳 性。相比63℃而言，65℃的效果更优。这表明65℃为利用本发明所提供的引物组进行 LAMP反应的优化温度。

实施例3、LAMP检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的特异性分 析

本实施例利用步骤一制备所得引物组，以咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae) IMI319418、咖啡浆果炭疽病菌菌(C.kahawae)IMI363578、8个近源种，以及1个 较远源种(表1)为实验材料进行LAMP反应，分析本发明所提供的引物组的特异性。 具体操作如下：

1、采用CTAB法(Yang and Liu.2005.Dactylella coccinella sp.nov.，an anamorphic  species.Mycotaxon，91：127-132.)提取基因组DNA模板，具体操作同实施例1中步骤 二1。通过Biospec-NANO(UV-VIS Spectrophotometers，Shimadzu，Japan)仪器精确定 量为20-30ng/uL。

2、以Apn2/Mat基因为靶基因，采用实施例1中步骤一制备所得的引物组，对步 骤1制备所得的待测样品基因组DNA模板进行LAMP反应。LAMP反应体系及反应 条件同实施例1中步骤二2。同时设置CK1和CK2两个空白对照(CK1和CK2均为 用灭菌的超纯水替代模板DNA)。

3、LAMP反应结果的判断：具体的判断方法同实施例1中步骤二3。

检测结果如图3所示：紫外灯下，咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株咖啡浆果炭疽病 菌(C.kahawae)IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578这两个待 测样品的反应液显示绿色荧光，同时琼脂糖凝胶电泳结果也同样显示为连续的梯状条 带；而其他9个样品在紫外灯下均没有绿色荧光产生，琼脂糖凝胶电泳结果也没有连 续的梯状条带。即咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae) IMI319418和咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)IMI363578的检测结果均为阳性；8个 近源种的模式菌株，以及1个远源菌株的模式菌株的检测结果均为阴性(表1)。这表 明本发明所提供的引物组在LAMP反应检测咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae)时表现 出较高的特异性。

表1LAMP分析Colletotrichum属实验菌株及Apn2/MAT基因的检测结果

注：其中●表示阳性结果；○表示阴性结果。

实施例4、LAMP检测咖啡浆果炭疽病菌(Colletotrichum kahawae)的灵敏度分 析

本实施例利用步骤一制备所得引物组，以咖啡浆果炭疽病菌(C.kahawae) IMI319418为实验材料进行LAMP反应，选择一系列纯化基因组DNA的浓度梯度(4 ng-0.2pg/25uL)，分析本发明所提供的引物组的灵敏度。具体操作如下：

1、采用CTAB法(Yang and Liu.2005.Dactylella coccinella sp.nov.，an anamorphic  species.Mycotaxon，91：127-132.)提取基因组DNA模板，具体操作同实施例1中步骤 二1。

2、以Apn2/Mat基因为靶基因，采用实施例1中步骤一制备所得的引物组，对步 骤1制备所得的基因组DNA模板进行LAMP反应。LAMP反应体系及反应条件同实 施例1中步骤二2。共11组反应液，在25μl的反应体系中添加咖啡浆果炭疽病菌(C. kahawae)IMI319418基因组DNA模板用量依次为4.0ng、2.0ng、1.0ng、0.2ng、0.1 ng、0.02ng、0.01ng、0.002ng、0.001ng、0.0002ng和0ng。

3、LAMP反应结果的判断：具体的判断方法同实施例1中步骤二3。

检测结果如图4所示：紫外灯下，咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株咖啡浆果炭疽病 菌(C.kahawae)IMI319418基因组DNA模板用量为4.0ng、2.0ng、1.0ng、0.2ng、 0.1ng、0.02ng、0.01ng和0.002ng的8组反应液显示绿色荧光，同时琼脂糖凝胶电泳 结果也同样显示为连续的梯状条带；而咖啡浆果炭疽病菌的模式菌株咖啡浆果炭疽病 菌(C.kahawae)IMI319418基因组DNA模板用量为0.002ng、0.001ng、0.0002ng和 0ng的4个样品在紫外灯下均没有绿色荧光产生，琼脂糖凝胶电泳结果也没有连续的 梯状条带。这表明本发明所提供的引物组在LAMP反应检测咖啡浆果炭疽病菌(C. kahawae)时表现出较高的灵敏度，具体可达0.08pg/μL的模板基因组DNA的浓度。