一种在蚕桑生产上广谱杀菌抗病毒多效药物及其应用

技术领域

本发明属于桑蚕生产技术领域，具体涉及一种在桑蚕生产上广谱杀菌抗病毒多效药物及其应用。 

背景技术

目前，蚕桑生产中使用的消毒药物，均存在杀菌谱不够，以及无法杀灭病毒病、真菌等不同病原的问题。比如现在广泛使用的漂白粉，其有效成分为有效氯，存放一段时间后有效成分容易挥发，且杀菌谱比较有限，对病毒病及其他病原物大幅度下降；而且消毒时对棉织品、铁器等有强烈腐蚀作用。在蚕桑生产上，一般消毒药物不能达到彻底消毒的效果，因而难以贯彻执行“预防为主，综合防治”的八字方针。家蚕主要病原多角体病毒、卒倒菌芽孢、黑胸败血菌芽孢、白僵、绿僵、曲霉孢子等都有强烈的杀灭作用 

纳米银（Nanoparticle Silver）就是将粒径做到纳米级的金属银单质。纳米银粒径大多在25纳米左右，对大肠杆菌、淋球菌、沙眼衣原体等数十种致病微生物都有强烈的抑制和杀灭作用，而且不会产生耐药性。但是，纳米银对于家蚕主要病原如多角体病毒、卒倒菌芽孢、黑胸败血菌芽孢、白僵、绿僵、曲霉孢子及微粒子原虫等是否具有杀灭作用，至今未有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服蚕桑生产上现有消毒药物的不足，提供一种在桑蚕生产上广谱杀菌抗病毒多效药物，该药物杀菌谱广、对家蚕病毒病、真菌均有强烈杀灭作用。 

本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 

    一种在蚕桑生产上广谱杀菌抗病毒多效药物，所述药物为20～100ppm的纳米银溶液。

所述20～100ppm的纳米银溶液的制备方法为：用粒径小于5nm、有效浓度为1000ppm市售纳米银产品做为母液，按水：母液为9～49：1的比例向母液中加入水，进行稀释后得20～100ppm的纳米银溶液。 

    本发明通过实验室平皿试验发现，用20～100ppm的纳米银溶液处理家蚕主要病原8小时，纳米银溶液对蚕桑生产的各种病原物具有强烈杀灭作用。因此，本发明提供一种纳米银溶液，可广泛应用于杀灭家蚕主要病原物药物。所述家蚕病原物为黑胸败血菌、卒倒杆菌、金色葡萄球菌、桑树赤锈病菌、家蚕血液型脓病（NPV）或/和家蚕细胞质型多角体病毒（CPV）。 

本发明的有益效果是： 

本发明首次发现，使用20～100ppm的纳米银溶液对蚕桑生产的各种病原物具有强烈杀灭作用，能一次性对蚕房、用具、养蚕周围环境进行彻底消毒，使用方法简单快捷，容易为广大蚕农接受，从而达到消毒防病，提高蚕桑生产经济效益的目的。

说明书附图

图1.不同浓度的纳米银溶液对各种家蚕细菌性病原物的杀菌谱平皿法测定纳米银的杀菌谱；Ⅰ为不同浓度纳米银对黑胸败血病的杀菌作用，Ⅱ为不同浓度纳米银对卒倒杆菌的杀菌作用；Ⅲ为不同浓度纳米银对金色葡萄球菌的杀菌作用；Ⅳ为不同浓度纳米银对桑树赤锈病菌的杀菌作用。

图2.纳米银溶液对黑胸败血病的杀菌效果；Ⅰ为纳米银处理的黑胸败血病菌照片，在图Ⅰ中，A菌体内含有大量纳米银颗粒（显示为白色），B为纳米银杀死菌体后的菌残骸；Ⅱ为磷酸缓冲液处理的对照。 

图3.纳米银溶液对家蚕血液型脓病（NPV）的作用效果；Ⅰ为纳米银处理的NPV照片；Ⅱ为磷酸缓冲液处理的对照。 

图4.纳米银溶液对家蚕细胞质型多角体病毒（CPV）的作用效果；Ⅰ为纳米银处理的CPV照片；Ⅱ为磷酸缓冲液处理的对照。 

图5.NPV添食家蚕实验室饲养情况。 

图6.纳米银溶液处理血液型脓病添食家蚕的生物学效应检测；其中图A证实了经纳米银溶液处理后的NPV致病力大大下降，而图B对照组证明不经纳米银溶液处理的NPV致病力极高；图C、D为空白对照，包括Sumerian Silver和蒸馏水对照。 

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。 

 本发明所用纳米银为乌克兰市售纳米银产品Sumerian Silver，该产品纳米银粒径小于5nm；母液有效浓度为1000ppm。 

实施例1 

    1.配置不同浓度的纳米银溶液：纳米银溶液的浓度主要为2.5ppm、5ppm、10ppm、20ppm、100ppm。

 配置方法为：用乌克兰市售纳米银产品Sumerian Silver做为母液（该产品粒径小于5nm，母液有效浓度为1000ppm的无色透明溶液），分别按母液：水=1：399、1：199、1：99、1：49、1：9的比例，向母液中加入农村井水或自来水，直接稀释后得2.5ppm、5ppm、10ppm、20ppm、100ppm的纳米银溶液。 

 2.测定上述纳米银溶液对家蚕主要病原的抗菌谱：以家蚕主要病原如黑胸败血菌、卒倒杆菌（Bacillus thuringinsis）、金色葡萄球菌（Streptococcus aureus）、桑树赤锈病菌（Aecidium mori Barclay）、家蚕血液型脓病（NPV）、家蚕细胞质型多角体病毒（CPV）作为测定对象，具体测定方法为： 

 细菌和真菌样品：将各种病原菌分别接种到LB液体培养基，在28～37℃培养8～12小时（真菌样品置28℃）。计数。以1х10⁸菌/mL作为标准菌液。在超净台上向标准培养皿（直径12mm）内加入5mL溶化的固体培养基，待其温度降到40℃时加入200μL标准菌液，未凝固前快速混匀。凝固后用打孔器打孔。然后，向孔中分别加入不同浓度的纳米银溶液，密封倒置于4℃冰箱，扩散1小时。之后全部置于28～37℃培养箱培养4～8小时，观察，拍照。

病毒NPV和CPV样品：病毒多角体浓度均为2х10⁸CFU/mL，取1mL样品用100ppm纳米银室温处理8小时，按照电镜样品制备方法制备电镜观察样品。 

3.测定结果：将20～100ppm纳米银作用于家蚕细菌病8小时，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较强的杀菌效果，结果见图1、2、3、4。在图1中，其中Ⅰ为不同浓度纳米银对黑胸败血病的杀菌作用，2.5ppm的纳米银溶液显示出较好的杀菌效果；Ⅱ为不同浓度纳米银对卒倒杆菌（Bacillus thuringinsis）的杀菌作用，有效浓度在2.5～5ppm之间；Ⅲ为不同浓度纳米银对金色葡萄球菌（Streptococcus aureus）的杀菌作用，有效浓度在5～10ppm之间；Ⅳ为不同浓度纳米银对桑树赤锈病菌（Aecidium mori Barclay）的杀菌作用，有效浓度在20～100ppm之间。从图3中，其中Ⅰ为纳米银处理的NPV照片；Ⅱ为磷酸缓冲液处理的对照，图3中的图Ⅰ的NPV病毒包涵体内杆状病毒颗粒与对照比较更为散乱，靠近包涵体四周边缘，而对照的杆状病毒颗粒集中在包涵体中央区域。从上述结果可以看出：例如对黑胸败血病（Bacillus spp.），使用浓度在2.5ppm就能达到实用杀菌效果；100ppm的纳米银溶液作用于家蚕病毒病8小时，病毒（NPV和CPV）的多角体蛋白发生一定程度的变化，特别是对CPV，外形变化显著；使用浓度在20～100ppm可以杀灭桑树赤锈病（Aecidium mori Barclay），这是一种真菌性病害。 

使用20～100ppm的纳米银溶液对蚕桑生产的各种病原物具有强烈杀灭作用，能一次性对蚕房、用具、养蚕周围环境进行彻底消毒，使用方法简单快捷，容易为广大蚕农接受，从而达到消毒防病，提高蚕桑生产经济效益的目的。 

实施例2 

实施例1所述的纳米银溶液在实验室小规模饲养试验，研究纳米银溶液处理血液型脓病（NPV）和质型多角体病毒（CPV）后，添食饲养对家蚕发病的影响。

实施时间：2013年3月23日至4月22日。 

实施地点：华南农业大学校内，亚太地区蚕桑培训中心北楼昆虫生理生化实验室。

实施办法： 

家蚕品种：原种7532；桑叶：采自华南农业大学桑园，品种为广东荆桑。

添食方法：分别用纳米银处理CPV和NPV，连同CPV、NPV进行实验，并分别设立空白对照。其中，纳米银使用浓度为2ppm。CPV的原始贮存液浓度为1×10⁸ CFU/mL，NPV的原始贮存液浓度为2×10⁸ CFU/mL，稀释100倍作为使用浓度。处理组：按照纳米银使用浓度加入到NPV和CPV各100mL使用浓度液中，室温处理8～12h。对照组：NPV和CPV各100mL使用浓度，同处理组室温8～12hr。空白对照组：使用等量无菌水。 

配制好各种处理液后，用喷雾瓶均匀喷到桑叶表面，晾干后用于4龄蚕第三天添食。 

分区设计：在4龄蚕时进行分区，对NPV和CPV分别进行实验，实验组分别为NPV、CPV、纳米银处理NPV、纳米银处理CPV，每个实验设三个重复，每个重复设立空白对照（添食等量无菌水）。 

实施结果1：到5龄后期，NPV添食的三个实验组发现有大量家蚕发病死亡，而经过纳米银处理的NPV实验组发病率大致与空白对照组相当 （表1、图6）。 

 表1 纳米银处理NPV实验统计表

    实施结果2：经过纳米银处理的CPV毒力大幅度下降，其抗病力甚至超过空白对照组（表2）。熟蚕上蔟期间，未处理CPV落地蚕、游走蚕、病蚕数量较多；经纳米银处理后，CPV毒力明显下降。

表2 纳米银处理CPV实验统计表 

    备注：实施期间雨水较多，饲养环境属于常温多湿。蚕病发生的种类主要是NPV、CPV病毒病与细菌病共感染。对照区发病主要是细菌病和僵病。

    数据统计t检验： 

    （1）当df=4时查临界t值，得t_0.005(4)=5.598，|t|>t_0.005(4)，否定H₀:₁=₂，p<0.005，表明用纳米银处理过的NPV和未用纳米银处理的NPV对家蚕的致病效果差异十分显著。

    （2）当df=4时查临界t值，得t_0.005(4)=5.598，|t|>t_0.005(4)，否定H₀:₁=₂，p<0.005，表明用纳米银处理过的CPV和未用纳米银处理的CPV对家蚕的致病效果差异十分显著。 

实施例3 

实施例1所述的纳米银溶液具体应用在桑蚕生产上。

实施时间、地点：2013年分别在春、夏、秋三个养蚕季节，在化州市那务镇、合江镇随机选取6个蚕农进行消毒试验，全年共18户参与试用。其中，每个季节3人用纳米银消毒液，3人用漂白粉消毒液对照。家蚕品种为9芙X7湘。 

消毒方法：配制100ppm纳米银溶液，用农户家井水按水：母液=9：1（v/v）的比例稀释，充分搅拌混合均匀。以消毒用喷枪对大蚕地面育蚕室消毒，要求喷布均匀，湿润墙面、地面为止。其他养蚕设施如储桑室、走廊、蚕室垫砖等消毒方法同上。漂白粉的消毒按常规方法配制，施用方法同上。 

    实施结果：农村蚕茧生产试用纳米银消毒液的效果（如表3～6，日期为售茧日）： 

          表3、 化州市农村养蚕试用纳米银的消毒效果               2013-6-13

 表4、 化州市农村养蚕试用纳米银的消毒效果               2013-9-9

 表5、 化州市农村养蚕试用纳米银的消毒效果               2013-10-30

表6  2013年纳米银农村试用数据统计分析

     从表中数据不难看出，试用纳米银作为消毒药物与传统的消毒药物漂白粉比较，其单张产茧和单张产值比漂白粉略低。消毒药物更加重要的是需要从茧质方面判断，因为5龄末期发病多半会产生死笼茧，直接影响茧质。其平均茧价与漂白粉的相比，t检验结果差异不显著。

    纳米银消毒液与漂白粉消毒液比较：在平均茧价相当的情况下，纳米银的使用优势在于无毒、无臭、无腐蚀性，特别是在农村家具中多铁质物品时，长时间使用完全不会腐蚀。但目前的价格比漂白粉稍贵。漂白粉的优势在于久为农户使用，价格低廉，但气味刺鼻、腐蚀性极强，蚕具、蚕房多为漂白粉腐蚀，且长久使用使得蚕房、门框等斑驳陆离，影响新农村美观。