用于免疫耐受性诱导和免疫诊断的FVIII肽

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年10月27日提交的美国临时专利申请序号 61/407,402、2011年3月25日提交的美国临时专利申请序号 61/467,894以及2011年6月29日提交的美国临时专利申请序号 61/502,476号的优先权，所述临时专利申请的公开内容是以全文引用 的方式并入本文中以用于所有目的。

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不适用

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不适用

发明背景

因子VIII(FVIII)为一种在血浆中发现的在引起血液凝固的级联 反应中充当辅因子的蛋白质。甲型血友病由功能性FVIII蛋白的减少 或缺乏造成并且为影响每5000至10000个男性中约1人的最常见的 出血病症之一。血友病的临床症状为频繁的肌肉和关节出血，且外伤 甚至会引起危及生命的状况。目前，血友病的有效治疗包括使用重组 或由血浆得到的FVIII产品的静脉内施加替补缺少的FVIII蛋白。所 述制剂一般响应于出血事件施用(按需疗法(on-demand therapy))或按 频繁、定期的时间间隔施用以防止不受控制的出血(预防)。不幸的是， 中和抗FVIII抗体(FVIII抑制剂)的出现为在使用FVIII产品的替补疗 法期间的主要并发症。约25%接受治疗的患者对FVIII蛋白发展此免 疫性，由此使得进一步控制出血极其困难。

尚未完全阐明针对FVIII蛋白的这种免疫反应的原因，但患者免 疫系统的特异性会影响其对于疗法的反应。通常，免疫系统对某些抗 原(例如“自体”抗原)发展耐受性。此特征至关重要，因为否则的话， 如果自体抗原被识别为外来抗原，那么导致自体免疫疾病。具体来说， 甲型血友病患者在其FVIII基因中具有遗传缺陷，这导致免疫系统不 将所施用的FVIII蛋白识别为“自体”抗原。因此，当在凝血因子替 补疗法期间施用FVIII蛋白时，患者的免疫系统将FVIII蛋白识别为 外来抗原或改变的自体蛋白并且因此发展抗FVIII抗体。

FVIII抑制剂(即抗FVIII抗体)由来源于FVIII特异性B细胞的浆细 胞产生。B细胞需要活化CD4⁺T细胞的帮助以增殖并分化成产生抗 FVIII抗体的浆细胞。例如，FVIII蛋白由B淋巴细胞和T淋巴细胞以不 同方式识别。抗FVIII抗体的诱导为T辅助细胞依赖型。B细胞经由其 特异性B细胞受体识别整个蛋白表位。另一方面，T细胞识别呈与抗 原呈现细胞表面上所呈现的MHC II类分子复合的加工的肽形式的蛋 白质。各CD4⁺T细胞克隆仅识别一种特异性肽-MHC复合物。为将肽 呈现给T细胞，MHC II类分子具有开放的结合槽(binding groove)，其 允许各种长度的肽适配装入并呈现在细胞表面上。此外，MHC II类 蛋白含有四个结合袋(binding pocket)，不同单倍体的结合袋不同 (Jones等,Nature Rev.Immunol.6:271-282(2006))。仅特异性氨基酸被 适配装入这些结合袋中，并且结合肽的最小尺寸为九个氨基酸。值得 注意的是，不同MHC II类单倍体可以呈现不同肽。因此，患者的MHC II类单倍体可能影响发展抗FVIII抗体的危险性。实际上，数项研究已 经显示人类MHC II类单倍体HLA-DRB1*1501与抗FVIII抗体发展的 危险性增大存在相关性(Pavlova等,J.Thromb.Haemost.7:2006-2015 (2009)；Oldenburg等,Thromb.Haemost.77:238-242(1997)；Hay等, Thromb.Haemost.77:234-237(1997))。

已经探索某些方法来解决与通过施用FVIII蛋白来治疗血友病有 关的挑战。例如，WO 03/087161公开了修饰的FVIII蛋白，其中所述 FVIII蛋白的免疫特征通过减少或移除所述蛋白质上存在的潜在T细 胞表位的数目来改变。鉴定沿着FVIII蛋白的包括T细胞表位的许多区 域，包括例如FVIII^2030-2044。根据本公开，移除所述区域可用以提供不 诱导抗FVIII抗体产生的功能性FVIII蛋白。WO 09/071886还公开了预 计会产生患者免疫反应中所涉及的HLA-DR2结合肽的FVIII蛋白特 定区域，如FVIII^475-495、FVIII^542-562、FVIII^1785-1805以及FVIII^2158-2178。鉴 定可能用以在患者中诱导免疫耐受性的肽。

虽然在鉴定免疫反应中所涉及的FVIII蛋白的区域方面已有进 展，但仍需要鉴定FVIII蛋白的可用于发展其它治疗性肽和方法的其 它区域，所述方法可以例如用以治疗甲型血友病患者。

发明概述

本发明是基于鉴定FVIII蛋白的与针对FVIII分子的免疫反应相 关的区域。更确切地讲，包含FVIII蛋白的所述区域的FVIII肽可用 于在患有例如甲型血友病的患者中诱导对人类FVIII的耐受性。此外， 所述FVIII肽可用于免疫诊断目的，以便在替补疗法期间并且在免疫 耐受性诱导疗法期间监测患有甲型血友病的患者。

在一方面中，本发明提供一种在有需要的受试者中诱导对FVIII 的免疫耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：向所述受试者施用治 疗有效量的具有由(R¹)_x-P-(R²)_y组成的氨基酸序列的肽，其中：P为与 选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:344以及SEQ ID  NO:740的序列的至少九个连续氨基酸具有至少85%同一性的氨基酸 序列；R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R²为由1至80个 氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:10的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:10的 至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的 至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的 至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的 至少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供方法的一个实施方案中，x和y都为0。

在上文所提供方法的一个实施方案中，x为1且y为0。

在上文所提供方法的一个实施方案中，x为0且y为1。

在上文所提供方法的一个实施方案中，x和y都为0。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述肽由9至100个氨基 酸组成。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述肽由9至50个氨基 酸组成。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述肽由9至25个氨基 酸组成。

在上文所提供方法的一个实施方案中，施用药物组合物可防止在 受试者中发展抗FVIII抗体。

在上文所提供方法的一个实施方案中，施用药物组合物可减少在 受试者中存在的抗FVIII抗体的量。

在一方面中，本发明提供一种由氨基酸序列(R¹)_x-P-(R²)_y组成的 肽，其中：P为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、 SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、 SEQ ID NO:659以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的 序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R¹为由1至80个氨基酸组 成的氨基酸序列；R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x 和y各独立地为0或1。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:10的至 少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:10的至 少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的至 少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的至 少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:68的至 少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至 少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至 少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至 少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:344的至 少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至 少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至 少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至 少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，P为与SEQ ID NO:740的至 少九个连续氨基酸的序列一致的氨基酸序列。

在上文所提供肽的一个实施方案中，x和y都为0。

在上文所提供肽的一个实施方案中，x为1且y为0。

在上文所提供肽的一个实施方案中，x为0且y为1。

在上文所提供肽的一个实施方案中，x和y都为0。

在上文所提供肽的一个实施方案中，所述肽由9至100个氨基酸 组成。

在上文所提供肽的一个实施方案中，所述肽由9至50个氨基酸 组成。

在上文所提供肽的一个实施方案中，所述肽由9至25个氨基酸 组成。

在一方面中，本发明提供一种包含如本文所述的肽的组合物。

在上文所提供的组合物的一个实施方案中，所述组合物被配制成 用于药物施用。

在上文所提供的组合物的一个实施方案中，所述组合物进一步包 含第二多肽，所述第二多肽由氨基酸序列(R¹)_x-P-(R²)_y组成，其中：P 为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQ ID  NO:250、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQ  ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性 的氨基酸序列；R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R²为由 1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。

在一方面中，本发明提供一种制造FVIII肽的方法，所述方法包 括以下步骤：a)提供包含编码根据权利要求24至41中任一项所述的 FVIII肽的多核苷酸的细胞培养物；和b)在所述细胞培养物中表达所 述肽。

在一方面中，本发明提供一种鉴定FVIII肽特异性T细胞的方法， 所述方法包括：a)使多种CD4+T细胞与同MHC II类多聚体复合的 肽进行组合，其中所述肽为根据权利要求24至41中任一项所述的 FVIII肽；和b)鉴定对与MHC II类多聚体复合的肽具有特异性的所 述多种CD4+T细胞中的至少一员。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述MHC II类多聚体为 MHC II类四聚体。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述肽或MHC II类多聚 体进一步包含可检测部分。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括分离 对所述肽具有特异性的至少一种CD4+T细胞。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述CD4+T细胞是使用 流动式细胞测量术进行分离。

在一方面中，本发明提供一种融合蛋白，其包含如本文中所提供 的FVIII肽和第二肽。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述第二肽为报导体肽。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述融合蛋白由核酸编 码。

在上文所提供方法的一个实施方案中，所述FVIII肽被化学连接 至所述第二肽。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用以诱导针对人类FVIII 的免疫耐受性以便防止FVIII抑制剂发展。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用以诱导针对人类FVIII 的免疫耐受性以便治疗具有确定的FVIII抑制剂的患者。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用以产生适于在替补疗法 期间或在免疫耐受性诱导疗法期间在免疫监测患者时使FVIII特异性 T细胞直接染色的试剂(例如MHC II类多聚体或MHC II类四聚体)。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用以鉴定抗原特异性T细 胞。在一个实施方案中，这些试剂可用于在体外和离体环境中追踪 FVIII特异性T细胞。在另一实施方案中，这些试剂可用于分离和进 一步表征FVIII特异性T细胞。在一个实施方案中，荧光活化细胞分 选(fluorescent activated cell sorting；FACS)或单细胞PCR可用于这些 目的。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用于在免疫耐受性诱导疗 法期间免疫监测FVIII特异性T细胞。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用于在FVIII治疗期间免 疫监测FVIII特异性T细胞。

在一方面中，本文中所提供的FVIII肽用于在临床开发用于防止 FVIII抑制剂产生的新型免疫调节剂期间免疫诊断FVIII特异性T细 胞。

附图简述

不适用。

发明详述

I.引言

本发明涉及因子VIII(FVIII)肽，其可用于在例如患有甲型血友 病的患者中诱导对FVIII蛋白的耐受性。此外，所述肽可用于免疫诊 断目的，以便在替补疗法期间并且在免疫耐受性诱导疗法期间在患有 甲型血友病的患者中监测FVIII特异性T细胞。

本发明部分基于以下发现：FVIII的数个区域(确切地讲有 FVIII^102-122、FVIII^246-266以及FVIII^1401-1424)涉及在因子VIII替补疗法期间 针对FVIII蛋白产生的免疫反应中或与后天性血友病相关联。所鉴定 的区域的氨基酸序列分别为TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ  ID NO:740)、AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)以及 QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)。相信本发明提供 这些FVIII蛋白区和它们与对FVIII蛋白的免疫反应的关系的第一次鉴 定。

本发明的肽包括具有区域FVIII^102-122、FVIII^246-266以及FVIII^1401-1424的至少一部分的肽，所述肽与MHC II类分子复合而产生能够由患者 免疫反应中所涉及的T细胞识别的T细胞表位。在一些实施方案中， 所述肽包括至少九个邻接氨基酸，所述至少九个邻接氨基酸与 FVIII^102-122、FVIII^246-266或FVIII^1401-1424中的九个邻接氨基酸相对应。如 下文进一步描述，本文中所提供的肽还包括长度上长于九个氨基酸的 肽和FVIII^102-122、FVIII^246-266以及FVIII^1401-1424序列的变异体。本发明肽 的这种鉴定可牵涉在改进和推进被设计以治疗与血液凝固相关的疾 病(如甲型血友病)的治疗性策略方面。

II.定义

术语“因子VIII蛋白”或“FVIII蛋白”是指具有完整B域的至 少一部分并且展现出与天然人类FVIII蛋白有关的生物活性的任何 FVIII分子。FVIII分子可以为全长FVIII。FVIII分子还可以为天然 FVIII的经过保守修饰的变异体。FVIII蛋白可来源于人类血浆或通过 重组工程改造技术产生。FVIII蛋白的其它表征可例如见于US 2010/0168018的段落[0042]-[0055]，所述文献是以引用的方式并入本 文中。

术语“因子VIII肽”或“FVIII肽”是指本文所述的肽，其包含 对应于被发现在针对FVIII的免疫反应中至关重要的FVIII蛋白的区 域的氨基酸序列。FVIII肽包含至少九个氨基酸，所述至少九个氨基 酸与MHC II类蛋白复合以便呈现给免疫反应中所涉及的T细胞。其 它氨基酸可以存在于所述肽的至少九个氨基酸核心的任一端。在一些 实施方案中，FVIII肽可以包含与天然人类FVIII蛋白的特定区域一 致的序列。在其它实施方案中，FVIII肽可以为FVIII蛋白的区域的 经过保守修饰的变异体。如本文中进一步描述，FVIII肽的特征可以 为相对于天然人类FVIII蛋白的区域的序列的某种同一性百分比(例 如85%一致)。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然氨基酸，包括以 类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模 拟物。天然存在的氨基酸包括由遗传密码编码的氨基酸以及后来修饰 的氨基酸，例如羟基脯氨酸、y-羧基谷氨酸以及O-磷酸丝氨酸。天然 存在的氨基酸可以包括例如D-氨基酸和L-氨基酸。本文中所用的氨 基酸还可以包括非天然氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的 氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基以及R基键接的任 何碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜或甲硫氨 酸甲基锍。所述类似物具有经过修饰的R基(例如正亮氨酸)或经过修 饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基 酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但以类似于 天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以用其 通常已知的三字母符号或用由IUPAC-IUB生化命名委员会 (IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的一字母符 号提及。同样，核苷酸可以用其通常认可的单字母代码提及。

“经过保守修饰的变异体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于 特定核酸序列，经过保守修饰的变异体是指编码一致或基本上一致的 氨基酸序列的核酸，或当核酸并不编码氨基酸序列时，是指基本上一 致的序列。由于遗传密码的简并，大量功能上相同的核酸编码任何给 定的肽。例如，密码子GCA、GCC、GCG以及GCU皆编码氨基酸 丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置上，密码子可以变 成所描述的相应密码子中的任一个，而不改变所编码的多肽。所述核 酸变异为“沉默变异”，其为一种经过保守修饰的变异。本文中编码 多肽的每个核酸序列还说明每种可能的核酸沉默变异。本领域的普通 技术人员将认识到核酸中的各密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密 码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG以外)可被修饰以 获得功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变异在相对 于表达产物而非相对于实际探测序列所述的各序列中为隐含的。

关于氨基酸序列，本领域的普通技术人员将认识到改变、添加或 删除编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对于核酸或肽 序列的个别取代、删除或添加为“经过保守修饰的变异”，其中变化 使得氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的 保守性取代表格在本领域中是熟知的。所述经过保守修饰的变异体为 除了本发明的多态变异体、种间同系物以及等位基因以外的变异体并 且并不排除本发明的多态变异体、种间同系物以及等位基因。

以下八组各含有可以为彼此的保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、 甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)； 4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、 缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、 苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。参见例如Creighton, Proteins(1984)。

在两个或两个以上核酸或肽序列的背景中，术语“一致”或“同 一性”百分比是指如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法与如下 所述的预设参数或通过人工比对和目视检查所测量，两个或两个以上 序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸 (即，当比较和比对与比较窗或指定区相比的最大对应性时，相比于 指定区有约60%同一性，优选为65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一 性)。

“治疗有效量或剂量”或“足够量或剂量”在本文中意指在施用 时产生效应的剂量。精确剂量将取决于治疗目的并且可以由本领域技 术人员使用已知技术来确定(参见例如Augsburger & Hoag, Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,第3版,2008)；Lloyd,The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(第3版, 2008)；Pickar,Dosage Calculations(第8版,2007)；以及Remington:The  Science and Practice of Pharmacy,第21版,2005,Gennaro编, Lippincott,Williams & Wilkins)。

III.FVIII肽

本发明涉及与FVIII蛋白的在针对FVIII的免疫反应中涉及的区 域对应的FVIII肽。在一方面中，本发明提供一种FVIII肽，其由九 个氨基酸的连续序列组成，所述序列与以下氨基酸序列之一中的九个 连续氨基酸至少85%一致：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID  NO:68)；QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)；或 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)，其中所述肽由9 至180个氨基酸组成。

在一个特定实施方案中，所述FVIII肽具有以下序列： (R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:344以及 SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85% 同一性的氨基酸序列；R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列； R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0 或1。在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序 列，且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

一般来说，本发明的FVIII肽可以包括FVIII^102-122、FVIII^246-266或 FVIII^1401-1424、或经过修饰的变异体的鉴定区中所存在的任何氨基酸序 列，所述变异体可以例如具有与FVIII^102-122、FVIII^246-266或FVIII^1401-1424相似或相同的保留功能。具体来说，本发明的FVIII肽包含含有T细胞 表位的氨基酸序列。所述FVIII肽包括相对于氨基酸序列 AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)、 QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)、或 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)的氨基酸序列，同 一性百分比可在一定范围内变化的至少九个氨基酸的序列。例如， FVIII肽可以具有与FVIII^102-122、FVIII^246-266或FVIII^1401-1424中任意九个 连续氨基酸一致或至少50%、60%、70%、80%或85%(百分比)一致 的九个氨基酸。

在另一组实施方案中，FVIII肽可以具有多于九个氨基酸的氨基 酸序列，其中所述氨基酸序列包括可以与FVIII^102-122、FVIII^246-266或 FVIII^1401-1424中的连续氨基酸序列一致或至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%(百分比)一致的区域。本领域的普通技术人员应了 解已知诱变技术(如丙氨酸取代)可以用以鉴定保留FVIII^102-122、 FVIII^246-266或FVIII^1401-1424区的功能的经过修饰的变异体。

另外，FVIII肽可以在上文所论述的FVIII肽核心序列的任一端进 一步包括其它氨基酸序列。其它序列指示为(R¹)_x和(R²)_y。在某些实施 方案中，R¹和R²的长度范围可介于1至约80个氨基酸。或者，R¹和 R²的长度范围可介于1至约40个氨基酸。在某些实施方案中，下标x 和y各独立地为0或1。在一些实施方案中，x与y可以均为0。在其它 实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可 为1。在另一实施方案中，x与y均为1。由于以下各种原因可以在任 一端添加其它氨基酸，所述原因包括增加肽稳定性、改善与MHC II 类分子和/或T细胞的结合以及本领域的普通技术人员所将了解的其 它方面。

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与表1中所鉴定的因子VIII区的至少九个连续氨基酸的 序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组 成的氨基酸序列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其 中x和y各独立地为0或1。或者，R¹和R²的长度范围可介于1至约40 个氨基酸。在一个实施方案中，P为与表1中所鉴定的因子VIII区的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在另 一实施方案中，P为与表1中所鉴定的因子VIII区的至少九个连续氨 基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中， x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施 方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。在 一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一实施方 案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII 肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至25 个氨基酸组成。

表1.FVIII的包括T细胞表位的区域

如上所述，本发明的FVIII肽可以包括FVIII^1401-1424、或经修饰的 变异体的鉴定区中所存在的任何氨基酸序列，所述变异体可以例如具 有与FVIII^1401-1424相似或一致的保留功能。在某些实施方案中，所述肽 可涵盖人类FVIII蛋白的整个B域。本发明还可以包括其它FVIII肽， 所述肽包括具有至少九个氨基酸的序列的肽，所述序列相对于以下氨 基酸序列中的任一个的同一性百分比可在一定范围内变化： GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(FVIII^474-494；SEQ ID NO:159)、 PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(FVIII^540-560；SEQ ID NO:250)、 EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(FVIII^1785-1805；SEQ ID NO:477)、 LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(FVIII^2025-2045；SEQ ID NO:568)、 NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(FVIII^2160-2180；SEQ ID NO:659)、 TVVITLKNMASHPVSLHA(FVIII^102-119；SEQ ID NO:10)、 AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(FVIII^246-266；SEQ ID NO:68)以及 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(FVIII^102-122；SEQ ID NO:740)。

例如，FVIII肽具有与FVIII^474-494、FVIII^540-560、FVIII^1785-1805、 FVIII^2025-2045、FVIII^2160-2180、FVIII^102-119、FVIII^246-266或FVIII^102-122中任 意九个连续氨基酸一致或至少50%、60%、70%、80%或85%(百分 比)一致的九个氨基酸。在另一组实施方案中，FVIII肽可以具有多于 九个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可以与FVIII^474-494、 FVIII^540-560、FVIII^1785-1805、FVIII^2025-2045、FVIII^2160-2180、FVIII^102-119、 FVIII^246-266或FVIII^102-122中任意九个连续氨基酸一致或至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%(百分比)一致。本领域的普通技术人员 应了解，已知诱变技术(如丙氨酸取代)可以用以鉴定保留FVIII^474-494、 FVIII^540-560、FVIII^1785-1805、FVIII^2025-2045、FVIII^2160-2180、FVIII^102-119、 FVIII^246-266或FVIII^102-122区域的功能的经过修饰的变异体。此处所公开 的FVIII肽可以使用以上关于与FVIII^1401-1424有关的FVIII肽所述的方法 制得。

A.因子VIII^102-119肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO:10) 的因子VIII^102-119肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一 性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，并且 R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立地为0 或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHA (SEQ ID NO:10)的因子VIII^102-119肽的至少九个连续氨基酸的序列具 有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ  ID NO:1至SEQ ID NO:55(SEQ ID NO:10)的序列具有至少85%同一 性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:1至SEQ  ID NO:55的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方 案中，P为选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些 实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为0。 在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与y可 均为1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在某些实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列， 且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。在一个实施方案中， FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至100个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至50个氨基 酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至25个氨基酸组成。在其 它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、 135、140、145、150、155、160、165、170、175或180个氨基酸组 成。

表2.示例性FVIII^102-119肽

B.因子VIII^246-266肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID  NO:68)的因子VIII^246-266肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立 地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列： AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)的因子VIII^246-266肽 的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在 一个实施方案中，P为与具有序列：AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG (SEQ ID NO:68)的因子VIII^246-266肽的至少九个连续氨基酸的序列具 有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ  ID NO:56至SEQ ID NO:146的序列具有至少85%同一性的氨基酸序 列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:146 的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为 与选自SEQ ID NO:56至SEQ ID NO:146的序列具有至少95%同一性 的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:56至SEQ ID  NO:146的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它 实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可 为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

表3.示例性FVIII^246-266肽

C.因子VIII^474-494肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID  NO:159)的因子VIII^474-494肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立 地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列： GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO:159)的因子VIII^474-494肽的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一 个实施方案中，P为与具有序列：GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ  ID NO:159)的因子VIII^474-494肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至 少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID  NO:147至SEQ ID NO:237的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。 在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:147至SEQ ID NO:237的 序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与 选自SEQ ID NO:147至SEQ ID NO:237的序列具有至少95%同一性的 氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:147至SEQ ID  NO:237的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它 实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可 为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

在某些实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列， 且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。在一个实施方案中， FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至100个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至50个氨基 酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至25个氨基酸组成。在其 它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、 135、140、145、150、155、160、165、170、175或180个氨基酸组 成。

表4.示例性FVIII^474-494肽

D.因子VIII^540-560肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID  NO:250)的因子VIII^540-560肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立 地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列： PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO:250)的因子VIII^540-560肽 的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在 一个实施方案中，P为与具有序列：PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER (SEQ ID NO:250)的因子VIII^540-560肽的至少九个连续氨基酸的序列具 有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ  ID NO:238至SEQ ID NO:328的序列具有至少85%同一性的氨基酸序 列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:238至SEQ ID NO:328 的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为 与选自SEQ ID NO:238至SEQ ID NO:328的序列具有至少95%同一性 的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:238至SEQ ID  NO:328的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它 实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可 为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

表5.示例性FVIII^540-560肽

E.因子VIII^1401-1424肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID  NO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立 地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列： QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。 在一个实施方案中，P为与具有序列： QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。 在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:329至SEQ ID NO:464的 序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与 选自SEQ ID NO:329至SEQ ID NO:464的序列具有至少90%同一性的 氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:329至SEQ ID  NO:464的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案 中，P为选自SEQ ID NO:329至SEQ ID NO:464的氨基酸序列。在一 些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为 0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与 y可均为1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

表6.示例性FVIII^1401-1424肽

F.因子VIII^1785-1805肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID  NO:477)的因子VIII^1785-1805肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立 地为0或1。在一个实施方案中，P为与具有序列： EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO:477)的因子VIII^1785-1805肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，P为与具有序列： EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO:477)的因子VIII^1785-1805肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。 在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:555的 序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与 选自SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:555的序列具有至少90%同一性的 氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:465至SEQ ID  NO:555的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案 中，P为选自SEQ ID NO:465至SEQ ID NO:555的氨基酸序列。在一 些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为 0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与 y可均为1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

表7.示例性FVIII^1785-1805肽

G.因子VIII^2025-2045肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID  NO:568)的因子VIII^2025-2045肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立 地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列： LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO:568)的因子VIII^2025-2045肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。 在一个实施方案中，P为与具有序列：LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG (SEQ ID NO:568)的因子VIII^2025-2045肽的至少九个连续氨基酸的序列 具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自 SEQ ID NO:556至SEQ ID NO:646的序列具有至少85%同一性的氨基 酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:556至SEQ ID  NO:646的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案 中，P为与选自SEQ ID NO:556至SEQ ID NO:646的序列具有至少95% 同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:556 至SEQ ID NO:646的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。 在其它实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0 且y可为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

表8.示例性FVIII^2025-2045肽

H.因子VIII^2160-2180肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID  NO:659)的因子VIII^2160-2180肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立 地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列： NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO:659)的因子VIII^2160-2180肽的 至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一 个实施方案中，P为与具有序列：NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID  NO:659)的因子VIII^2160-2180肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID  NO:647至SEQ ID NO:737的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。 在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:647至SEQ ID NO:737的 序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为与 选自SEQ ID NO:647至SEQ ID NO:737的序列具有至少95%同一性的 氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:647至SEQ ID  NO:737的氨基酸序列。在一些实施方案中，x与y可均为0。在其它 实施方案中，x可为1且y可为0。在其它实施方案中，x可为0且y可 为1。在另一实施方案中，x与y可均为1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

表9.示例性FVIII^2160-2180肽

I.因子VIII^102-122肽

在一个实施方案中，本发明提供一种具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID  NO:740)的因子VIII^102-122肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独立 地为0或1。

在一个实施方案中，P为与具有序列： TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)的因子VIII^102-122肽 的至少九个连续氨基酸的序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在 一个实施方案中，P为与具有序列：TVVITLKNMASHPVSLHAVGV (SEQ ID NO:740)的因子VIII^102-122肽的至少九个连续氨基酸的序列具 有至少95%同一性的氨基酸序列。

在本发明的背景中，FVIII^102-122肽还包括FVIII^102-119肽。因此，在 一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:55以及SEQ  ID NO:738至SEQ ID NO:773的序列具有至少85%同一性的氨基酸序 列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:55以 及SEQ ID NO:738至SEQ ID NO:773的序列具有至少90%同一性的氨 基酸序列。在一个实施方案中，P为与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID  NO:55以及SEQ ID NO:738至SEQ ID NO:773的序列具有至少95%同 一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，P为选自SEQ ID NO:1至SEQ  ID NO:55以及SEQ ID NO:738至SEQ ID NO:773的氨基酸序列。在一 些实施方案中，x与y可均为0。在其它实施方案中，x可为1且y可为 0。在其它实施方案中，x可为0且y可为1。在另一实施方案中，x与 y可均为1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

表10.示例性FVIII^102-122肽

IV.制造FVIII肽的方法

在另一方面中，本发明进一步涉及制造FVIII肽的方法。在一些 实施方案中，本发明的FVIII肽可以使用本领域中通常已知的固相(例 如Fmoc或t-Boc)或液相合成技术来制造。参见例如Chan & White编, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach(Oxford  University Press,2000)；Benoiton,Chemistry of Peptide Synthesis(CRC  Press,2005)；Howl,Peptide Synthesis and Applications(Humana Press, 2010)。

在一个实施方案中，本发明包括一种制造FVIII肽的方法，所述 方法包括：a)使用固相或液相合成技术合成肽，所述FVIII肽具有以下 序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:344 以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地 为0或1。在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基 酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。在某些实 施方案中，所述肽可涵盖人类FVIII蛋白的整个B域。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述肽可以使用重组技术来制造。在一个实 施方案中，本发明包括一种制造FVIII肽的方法，所述方法包括以下 步骤：a)提供包含编码FVIII肽的载体的细胞培养物，所述FVIII肽具 有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、SEQ ID  NO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具 有至少85%同一性的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组成的氨 基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y 各独立地为0或1。在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组 成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。 在某些实施方案中，所述肽可以涵盖人类FVIII蛋白的整个B域。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种制造FVIII肽的方法，所述 方法包括以下步骤：a)提供包含编码FVIII肽的多核苷酸的细胞培养 物，所述肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID  NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:250、SEQ ID  NO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQ  ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性 的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为 由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1； 和b)在所述细胞培养物中表达所述肽。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在制造FVIII肽的方法的一个实施方案中，FVIII肽由9至150 个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组 成。在另一实施方案中，FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实 施方案中，FVIII肽由9至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII 肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、 155、160、165、170、175或180个氨基酸组成。

本发明的FVIII肽可以通过在合适的原核或真核宿主系统中表达 来产生。真核细胞的实例包括(但不限于)哺乳动物细胞，如CHO、 COS、HEK293、BHK、SK-Hep以及HepG2；昆虫细胞，例如SF9 细胞、SF21细胞、S2细胞以及High Five细胞；以及酵母细胞，例 如酵母属(Saccharomyces)细胞或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)细 胞。在一个实施方案中，FVIII肽可以在细菌细胞、酵母细胞、昆虫 细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞以及其类似细胞中表达。在一些实施 方案中，肽可在人类细胞系、仓鼠细胞系或鼠类细胞系中表达。在一 个特定实施方案中，细胞系为CHO、BHK或HEK细胞系。

广泛多种载体可以用于表达FVIII肽且可以选自真核和原核表达 载体。所述载体将包括表达至少一种本文中所公开的FVIII肽所必需 的核苷酸序列。原核表达载体的实例包括质粒，如pRSET、pET、pBAD 等，其中原核表达载体中所用的启动子包括lac、trc、trp、recA、araBAD 等。真核表达载体的实例包括：(i)对于在酵母中表达，如pAO、pPIC、 pYES、pMET的载体，使用如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等的启 动子；(ii)对于在昆虫细胞中表达，如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC 等的载体，使用如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等的启 动子，并且(iii)对于在哺乳动物细胞中表达，如pSVL、pCMV、 pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等的载体和来源于病毒系统(如牛痘病毒、 腺相关病毒、疱疹病毒、反转录病毒等)的载体，使用如CMV、SV40、 EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV以及β-肌动蛋白的启动子。

在本发明的一些实施方案中，用于产生FVIII肽的核酸序列进一 步包括适用于受控蛋白质表达的其它序列，如启动子序列、增强子、 TATA盒、转录起始位点、多接头、限制性位点、聚A序列、蛋白质 加工序列、选择标记以及其类似序列，其通常为本领域的普通技术人 员所已知。

对产生FVIII肽的细胞所用的培养基可以基于本领域中熟知的合 适基础培养基，例如DMEM、汉姆氏F12(Ham's F12)、培养基199 (Medium199)、McCoy或RPMI。基础培养基可以包括许多成分，包 括氨基酸、维生素、有机盐和无机盐、以及碳水化合物来源。各成分 可以按支持细胞培养的量存在，所述量通常为本领域技术人员已知。 培养基可以包括辅助物质，如缓冲物质(例如碳酸氢钠)、抗氧化剂、 抵消机械应力的稳定剂、或蛋白酶抑制剂。必要时，可以添加非离子 表面活性剂，如聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物和/或混合物。

在一些实施方案中，培养基不含外源添加的蛋白质。“不含蛋白 质”和相关术语是指来自由培养物中的细胞外源性或除培养物中的细 胞以外的来源的蛋白质，其中所述细胞在生长期间天然排出蛋白质。 在另一实施方案中，培养基不含多肽。在另一实施方案中，培养基不 含血清。在另一实施方案中，培养基不含动物蛋白。在另一实施方案 中，培养基不含动物组分。在另一实施方案中，培养基含有蛋白质， 例如来自血清(如胎牛血清)的动物蛋白。在另一实施方案中，培养物 具有外源添加的重组蛋白。在另一实施方案中，蛋白质来自经过证实 无病原体的动物。

制备不含动物蛋白且化学成分确定的培养基的方法为本领域中 已知，例如在US 2008/0009040和US 2007/0212770中，所述文献皆 并入本文中以用于所有目的。在一个实施方案中，本文所述的方法中 所用的培养基为不含动物蛋白或不含寡肽的培养基。在某些实施方案 中，培养基可为化学成分确定的培养基。如本文所用的术语“化学成 分确定”应意指培养基不包含任何不确定的补充物，如例如动物组分、 器官、腺体、植物或酵母的提取物。因此，化学成分确定的培养基的 各组分为精确确定的。

在某些实施方案中，本发明的方法可以包括使用例如以分批方 式、半分批方式、补料分批方式或连续方式操作的细胞培养系统。分 批培养可为大规模细胞培养，其中细胞接种物在槽或发酵罐中培养至 最大密度，且以分批形式收集和处理。补料分批培养可为供给新鲜营 养物(例如生长限制性底物)或添加剂(例如产物前体)的分批培养。连 续培养可为通过流入新鲜培养基连续供给营养物的悬浮培养，其中培 养物体积一般为恒定的。类似地，连续发酵可指通过连续添加新鲜培 养基(其通过从生物反应器移除细胞悬浮液而恰好平衡)而使细胞或 微生物在培养物中维持在指数生长期的过程。此外，搅拌槽反应器系 统可用于悬浮培养、灌流培养、恒化培养(chemostatic culture)和/或微 载体培养。通常，搅拌槽反应器系统可如同具有任何类型的搅拌器(如 Rushton型、水翼型、斜叶桨型或船用型(marine))的任何常规搅拌槽 反应器般操作。

在某些实施方案中，本发明的细胞培养法可以包括使用微载体。 在一些实施方案中，实施方案的细胞培养可以在适于提供高体积-比 培养表面积的条件下于大型生物反应器中进行以获得高细胞密度和 蛋白质表达。一种提供所述生长条件的手段为在搅拌槽生物反应器中 使用微载体进行细胞培养。细胞在微载体上生长的概念首先由van  Wezel(van Wezel,A.L.,Nature 216:64-5(1967))描述并且允许细胞附 着于悬浮于生长培养基中的小固体颗粒表面上。这些方法提供高表面 与体积比并且因此允许有效的营养物利用。此外，对于在真核细胞系 中表达分泌蛋白，表面与体积比增大允许较高程度的分泌并且因此在 培养物上清液中的蛋白质产率较高。最后，这些方法允许真核表达培 养容易地按比例扩大。

表达FVIII肽的细胞可以在细胞培养生长期间结合至球形或多孔 微载体。微载体可为选自基于葡聚糖、胶原蛋白、塑料、明胶和纤维 素以及其它的微载体的组的微载体。还可能使细胞在球形微载体上生 长至某一生物量并且当它们已达到最终发酵罐生物量时且在多孔微 载体上产生表达蛋白之前继代培养细胞，或反之亦然。合适的球形微 载体可以包括光滑表面微载体，如Cytodex^TM1、Cytodex^TM2以及 Cytodex^TM3(GE Healthcare)；和大孔微载体，如Cytopore^TM1、 Cytopore^TM2、Cytoline^TM1以及Cytoline^TM2(GE Healthcare)。

本领域的普通技术人员应了解，通过上述合成和/或重组方法产 生的FVIII肽可包括天然和/或非天然氨基酸，包括氨基酸类似物和/ 或氨基酸模拟物。

V.用于诱导免疫耐受性的因子FVIII肽组合物

在另一方面中，本文中所公开的FVIII肽可以包括于药物组合物 中。在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含如本文 所述的因子VIII^246-266肽、因子VIII^1401-1424肽或因子VIII^102-122肽。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述的因子 VIII^246-266肽。在另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文 所述的FVIII^474-494肽、FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、 FVIII^2160-2180肽、FVIII^102-119肽、FVIII^1401-1424肽、FVIII^102-122肽或第二 FVIII^246-266肽。

在另一实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述的因子 VIII^1401-1424肽。在另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本 文所述的FVIII^474-494肽、FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、 FVIII^2160-2180肽、FVIII^102-119肽、FVIII^246-266肽、FVIII^102-122肽或第二 FVIII^1401-1424肽。

在另一实施方案中，所述药物组合物包含如本文所述的因子 VIII^102-122肽。在另一实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文 所述的FVIII^474-494肽、FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、 FVIII^2160-2180肽、FVIII^102-119肽、FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或第二 FVIII^102-122肽。

在一个特定实施方案中，本发明提供一种包含肽的药物组合物， 所述肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、 SEQ ID NO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的 序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组 成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且 x和y各独立地为0或1。在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基 酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序 列。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

在一个特定实施方案中，所述药物组合物进一步包含第二多肽， 所述第二多肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID  NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:250、SEQ ID  NO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQ  ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性 的氨基酸序列，R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为 由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。 在一个实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列，并 且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，第二FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在 另一实施方案中，第二FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实 施方案中，第二FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案 中，第二FVIII肽由9至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，第 二FVIII肽由9至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、 145、150、155、160、165、170、175或180个氨基酸组成。

A.施用

为向人类或测试动物施用组合物，在一方面中，所述组合物可以 包含一种或多种药学上可接受的载体。短语“药学上”或“药理学上”可 接受是指当使用如下所述的本领域中熟知的途径施用时，稳定、抑制 蛋白质或肽降解(如聚集和裂解产物)并且另外不产生过敏性或其它 不良反应的分子实体和组合物。“药学上可接受的载体”包括任何和所 有临床上有用的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗 剂和吸收延迟剂以及其类似物。

药物组合物可以经口、局部、经皮、胃肠外、通过吸入喷雾、经 阴道、直肠或通过颅内注射施用。如本文所用的术语胃肠外包括皮下 注射、静脉内、肌肉内、脑池内注射或输注技术。还涵盖通过静脉内、 皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和或手术 植入特定部位而进行的施用。通常，组合物基本上不含热原质以及可 能对接受者有害的其它杂质。

施用的剂量和频率将取决于本领域技术人员通常所了解的各种 因素，包括例如患者血友病的严重程度和/或使用较大或较小剂量是 否更有效地诱导免疫耐受性。典型每日剂量可在约0.01mg/kg至100 mg/kg范围内。每周0.07-700mg FVIII肽范围内的剂量可能为有效且 被完全耐受的，不过甚至更高的每周剂量可能为适当且/或被完全耐 受的。在规定适当剂量中的主要决定因素为在特定情形下在治疗上有 效所必需的特定FVIII肽的量。为获得较长持续时间的免疫耐受性， 可能需要重复施用。可以使用由治疗医师所选的剂量水平和模式进行 组合物的单次或多次使用。

在一方面中，本发明的组合物可以通过团注(bolus)施用。作为另 一实例，FVIII肽可以作为一次剂量施用。本领域的普通技术人员将 容易地如由良好医疗操作和个别患者临床情况所确定使有效剂量和 施用方案最优化。给药频率取决于施用途径。最优药物组合物由本领 域技术人员根据施用途径和所需剂量而确定。参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Remington the Science and  Practice of Pharmacy),第21版.(2005,Lippincott Williams & Wilkins)， 其公开内容据此以引用的方式并入本文中。所述组合物影响所施用药 剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。取决于施用途 径，根据体重、体表面积或器官大小计算合适剂量。适当剂量可以通 过使用测定血液水平剂量的已确立的测定连同适当的剂量-反应数据 来确定。最终给药方案由主治医师考虑改变药物作用的各种因素来确 定，所述因素例如药物比活性、患者的损伤严重程度和反应性、患者 年龄、病状、体重、性别以及饮食、任何感染的严重程度、施用时间 以及其它临床因素。

在一些实施方案中，包含本文中所公开的FVIII肽的组合物在施 用之前冻干。冻干是使用本领域中常见的技术来进行且应如例如 Tang等,Pharm Res.21:191-200,(2004)和Chang等,Pharm Res. 13:243-9(1996)中所述最优化而用于所开发的组合物。制备药物组合 物的方法可以包括以下步骤中的一个或多个：在冻干之前将稳定剂添 加至混合物中；在冻干之前添加至少一种选自增积剂、渗透压 (osmolarity)调节剂以及表面活性剂的试剂至混合物中。在一方面中， 冻干制剂至少包含缓冲剂、增积剂以及稳定剂中的一种或多种。在此 方面中，在冻干步骤期间或在复原期间聚集成为问题的情况下评估并 选择表面活性剂的应用。包含适当缓冲剂以使制剂在冻干期间维持在 稳定pH带内。

冻干材料的标准复原实践是添加回一定体积的纯水或无菌注射 用水(WFI)(通常等于在冻干期间所移除的体积)，但是在用于胃肠外 施用的药物的制造中有时使用抗细菌剂的稀溶液。因此，提供制备复 原FVIII肽组合物的方法，其包括添加稀释剂至冻干FVIII肽组合物 中的步骤。

在一些实施方案中，冻干材料可以复原为水溶液。多种水性载体， 例如无菌注射用水、供多剂量使用的含防腐剂的水、或含适当量的表 面活性剂的水(例如含有与适于制造水性混悬液的赋形剂混合的活性 化合物的水性混悬液)。在各种方面中，所述赋形剂为悬浮剂，例如(但 不限于)羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、褐藻酸 钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶以及阿拉伯胶；分散或湿润剂为天然 存在的磷脂，例如(但不限于)卵磷脂；或环氧烷与脂肪酸的缩合产物， 例如(但不限于)聚氧乙烯硬脂酸酯；或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩 合产物，例如(但不限于)十七乙烯氧基十六醇 (heptadecaethyl-eneoxycetanol)；或环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇衍生 的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或环氧乙烷与从 脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物，例如(但不限于)聚乙烯脱 水山梨糖醇单油酸酯。在各种方面中，水性悬浮液还含有一种或多种 防腐剂，例如(但不限于)对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。

VI.治疗方法

本发明进一步涉及治疗患有与FVIII蛋白有关的疾病(如甲型血 友病或后天性血友病)的患者的方法。所述方法可以包括施用至少一 种本文中所公开的FVIII肽。具体来说，可以施用包含至少一种FVIII 肽的药物组合物以在患者中诱导对FVIII蛋白的免疫耐受性。

在一些实施方案中，诱导对FVIII的免疫耐受性的方法可以包括 在施用FVIII之后防止FVIII抑制剂发展。术语“防止”是指不允许大 致可检测的针对FVIII的免疫反应。例如，患者在施用FVIII蛋白之 前可能不具有任何可检测的抗FVIII抗体。然而，在FVIII蛋白的施 用疗法之后，如果未施用FVIII肽来诱导免疫耐受性，那么可检测的 抗FVIII抗体的含量会增加。施用本文中所公开的FVIII肽可以诱导 免疫耐受性，从而治疗患有血友病的患者。

在其它实施方案中，诱导对FVIII蛋白的免疫耐受性的方法可以 包括治疗已经具有确定的FVIII抑制剂的患者。在这些实施方案中， 施用FVIII肽可以减少或消除抗FVIII抗体的存在。术语“减少”意指针 对FVIII蛋白的免疫反应部分减少。在某些实施方案中，减少免疫反 应可以包括与患者在施用FVIII肽之前的免疫反应程度相比免疫反应 减少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。例如， 减少百分比可以通过使用测定FVIII抗体存在量的标准方法来测量在 施用FVIII肽之前和之后血液中所存在的抗FVIII抗体的量来分析。在 其它实施方案中，免疫反应减少可以包括测量对FVIII有特异性的 CD4⁺T细胞，或分泌FVIII抗体的FVIII特异性B细胞，或T细胞、B细 胞以及抗FVIII抗体所有三者的组合的减少程度。可以使用本领域中 通常已知的方法分离免疫细胞，如对FVIII有特异性的T细胞和B细胞。

在一方面中，本发明包括一种在受试者中诱导对FVIII的免疫耐 受性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如本 文所述的FVIII肽的药物组合物的步骤。在一个特定实施方案中，所 述FVIII肽为如本文所述的因子VIII^246-266肽、因子VIII^1401-1424肽或因子 VIII^102-122肽。

在一个实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量 的包含如本文所述的因子VIII^246-266肽的药物组合物的步骤。在另一实 施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文所述的FVIII^474-494肽、 FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、FVIII^2160-2180肽、 FVIII^102-119肽、FVIII^1401-1424肽、FVIII^102-122肽或第二FVIII^246-266肽。

在另一实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量 的包含如本文所述的因子VIII^1401-1424肽的药物组合物的步骤。在另一 实施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文所述的FVIII^474-494肽、 FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、FVIII^2160-2180肽、 FVIII^102-119肽、FVIII^246-266肽、FVIII^102-122肽或第二FVIII^1401-1424肽。

在另一实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量 的包含如本文所述的因子VIII^102-122肽的药物组合物的步骤。在另一实 施方案中，所述药物组合物进一步包含如本文所述的FVIII^474-494肽、 FVIII^540-560肽、FVIII^1785-1805肽、FVIII^2025-2045肽、FVIII^2160-2180肽、 FVIII^102-119肽、FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或第二FVIII^102-122肽。

在一个实施方案中，本发明提供一种诱导对FVIII蛋白的免疫耐 受性的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含肽的药物 组合物，所述肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID  NO:68、SEQ ID NO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续 氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R1为由1至80个 氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列；并且x和y各独立地为0或1；从而在所述受试者中诱导对FVIII 蛋白的免疫耐受性。在某些实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组 成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在另一 实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方案中， FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII肽由9 至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、 110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、 170、175或180个氨基酸组成。

诱导免疫耐受性的方法可以进一步包括组合疗法，其中可以施用 数种肽来诱导免疫耐受性。在一个实施方案中，诱导免疫耐受性的方 法进一步包括施用治疗有效量的至少具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的第二 肽，其中P为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:159、 SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:568、 SEQ ID NO:659以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的 序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R1为由1至80个氨基酸组 成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且 x和y各独立地为0或1；从而在受试者中诱导对FVIII蛋白的免疫耐受 性。在某些实施方案中，R¹为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列， 并且R²为由1至40个氨基酸组成的氨基酸序列。在一个特定实施方 案中，所述第二肽由9至80个氨基酸组成。在另一特定实施方案中， 所述第二肽中的任何其它氨基酸为天然氨基酸。在另一特定实施方案 中，所述第二肽由9至40个氨基酸长度组成。在一个特定实施方案 中，所述第二肽由9至80个氨基酸长度组成，并且所述第二肽中的 任何其它氨基酸为天然氨基酸。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，第二FVIII肽由9至150个氨基酸组成。在 另一实施方案中，FVIII肽由9至100个氨基酸组成。在另一实施方 案中，FVIII肽由9至50个氨基酸组成。在另一实施方案中，FVIII 肽由9至25个氨基酸组成。在其它实施方案中，FVIII肽由9至10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、 105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、 165、170、175或180个氨基酸组成。

在诱导免疫耐受性的方法的一个特定实施方案中，其中所施用的 药物组合物包含肽，其中P为与SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:344或SEQ  ID NO:740的至少九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基 酸序列，所述组合物进一步包含第二多肽，所述第二多肽具有以下序 列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:68、 SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:477、 SEQ ID NO:568、SEQ ID NO:659以及SEQ ID NO:740的序列的至少 九个连续氨基酸的序列具有至少85%同一性的氨基酸序列；R1为由 1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成 的氨基酸序列；并且x和y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在一方面中，本发明提供如本文所述的FVIII肽的用途，其用于 制造用以处理针对FVIII替补疗法产生的免疫反应的药物。在一个特 定实施方案中，所述FVIII肽为FVIII^1401-1424肽。在相关方面中，本发 明提供如本文所述的FVIII肽的用途，其用于制造用以防止针对FVIII 替补疗法产生的免疫反应的药物。在一个特定实施方案中，所述FVIII 肽为FVIII^1401-1424肽。

在一方面中，本发明提供一种用作药剂的FVIII肽。在一个特定 实施方案中，本发明提供一种用作药剂的具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的多 肽，其中P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID  NO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，并且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独 立地为0或1。

在一方面中，本发明提供一种用于处理针对FVIII替补疗法产生 的免疫反应的FVIII肽。在一个特定实施方案中，本发明提供一种用 于处理针对FVIII替补疗法产生的免疫反应的具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的 多肽，其中P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID  NO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，并且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独 立地为0或1。

在一方面中，本发明提供一种用于防止针对FVIII替补疗法产生 的免疫反应的FVIII肽。在一个特定实施方案中，本发明提供一种用 于防止针对FVIII替补疗法产生的免疫反应的具有序列(R¹)_x-P-(R²)_y的 多肽，其中P为与具有序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID  NO:344)的因子VIII^1401-1424肽的至少九个连续氨基酸的序列具有至少 85%同一性的氨基酸序列，R¹为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列，并且R²为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列，其中x和y各独 立地为0或1。

VII.免疫诊断

在一方面中，本发明提供一种在有需要的受试者中监测FVIII替 补疗法或FVIII免疫耐受性诱导疗法的方法，其是通过在从所述受试 者获取的生物样品中鉴定对FVIII有特异性的FVIII抑制抗体或CD4+ T细胞的存在或含量来达成。

在一个实施方案中，所述方法包括一种在有需要的受试者中监测 FVIII替补疗法的方法，所述方法包括：使所述受试者的生物样品与 如本文所述的FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或FVIII^102-122肽接触；和检 测在所述FVIII肽与所述样品中所存在的FVIII抑制抗体之间形成的复 合物。在一个实施方案中，所述方法包括测定所述样品中FVIII抑制 抗体的含量。在另一实施方案中，所述方法包括测定在不同时间从所 述受试者获取的至少两个样品中FVIII抑制抗体的含量，并且比较所 述两个样品之间FVIII抑制抗体的含量，其中抗体含量随时间增加表 明针对向所述受试者施用的FVIII的免疫反应在FVIII替补疗法过程中 形成。

在另一实施方案中，所述方法包括一种在有需要的受试者中监测 FVIII免疫耐受性诱导疗法的方法，所述方法包括：使所述受试者的 生物样品与如本文所述的FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或FVIII^102-122肽 接触；和检测在所述FVIII肽与所述样品中所存在的FVIII抑制抗体之 间形成的复合物。在一个实施方案中，所述方法包括测定所述样品中 FVIII抑制抗体的含量。在另一实施方案中，所述方法包括测定在不 同时间从所述受试者获取的至少两个样品中FVIII抑制抗体的含量， 并且比较所述两个样品之间FVIII抑制抗体的含量，其中抗体含量随 时间减少表明针对FVIII蛋白的免疫耐受性在所述受试者中形成。

在一个实施方案中，所述方法包括一种在有需要的受试者中监测 FVIII替补疗法的方法，所述方法包括：使所述受试者的生物样品与 如本文所述的FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或FVIII^102-122肽接触；和检 测在所述FVIII肽与所述样品中所存在的对FVIII有特异性的CD4+T 细胞之间形成的复合物。在一个实施方案中，所述方法包括测定所述 样品中对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量。在另一实施方案中， 所述方法包括测定在不同时间从所述受试者获取的至少两个样品中 对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量，并且比较所述两个样品之间 对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量，其中抗体含量随时间增加表 明针对向所述受试者施用的FVIII的免疫反应在FVIII替补疗法过程中 形成。在一个特定实施方案中，所述FVIII肽与MHC II类多聚体复合。

在另一实施方案中，所述方法包括一种在有需要的受试者中监测 FVIII免疫耐受性诱导疗法的方法，所述方法包括：使所述受试者的 生物样品与如本文所述的FVIII^246-266肽、FVIII^1401-1424肽或FVIII^102-122肽 接触；和检测在所述FVIII肽与所述样品中所存在的对FVIII有特异性 的CD4+T细胞之间形成的复合物。在一个实施方案中，所述方法包 括测定所述样品中对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量。在另一实 施方案中，所述方法包括测定在不同时间从所述受试者获取的至少两 个样品中对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量，并且比较所述两个 样品之间对FVIII有特异性的CD4+T细胞的含量，其中抗体含量随时 间减少表明针对FVIII蛋白的免疫耐受性在所述受试者中形成。在一 个特定实施方案中，所述FVIII肽与MHC II类多聚体复合。

如本领域的普通技术人员所了解，免疫监测可以例如用以推进患 有血友病的患者的治疗。例如，免疫监测可以用于鉴定施用本发明的 肽和/或组合物是否防止或减少针对FVIII产物的免疫反应。剂量和/ 或剂量间隔可以通过免疫监测来最优化。在一些实施方案中，施用剂 量可以特别基于防止或减少抗FVIII抗体的免疫监测结果来定制。另 外，可以确定特定患者或患者群体的给药间隔以及剂量。

A.鉴定FVIII特异性T细胞的方法

在另一方面中，本发明包括鉴定抗原特异性T细胞，更确切地讲 为对FVIII蛋白和本文所述的FVIII肽有特异性的T细胞的方法。所述 方法可以例如用于患者的免疫诊断，如免疫监测。在一个实施方案中， 本发明包括一种鉴定FVIII肽特异性T细胞的方法，所述方法包括a)使 多种CD4⁺T细胞与同MHC II类多聚体复合的FVIII肽组合，所述FVIII 肽具有以下序列：(R¹)_x-P-(R²)_y，其中P为与选自SEQ ID NO:68、SEQ  ID NO:344以及SEQ ID NO:740的序列的至少九个连续氨基酸的序列 具有至少85%同一性的氨基酸序列；R1为由1至80个氨基酸组成的 氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且x和y 各独立地为0或1；和b)鉴定对与MHC II类多聚体复合的肽有特异性 的所述多种CD4⁺T细胞中的至少一员。在一些实施方案中，R¹为由1 至40个氨基酸组成的氨基酸序列，并且R²为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本文中所公开的FVIII肽可以用于产生适于 使FVIII特异性T细胞直接染色的试剂。例如，呈现本发明的FVIII 肽的MHC II类多聚体可以包括多种形式，如MHC II类四聚体。这 些MHC II类分子可以经过进一步修饰而包含诊断剂。或者，与MHC  II类多聚体复合的FVIII肽可以包含诊断剂。本发明所用的诊断剂(即 可检测部分)可以包括免疫监测领域中通常已知的诊断剂。例如，可 以基于检测与本文所述的由MHC II类四聚体呈现的FVIII肽缔合的 诊断剂来鉴定和/或分离FVIII特异性T细胞。合适诊断剂可以包括 荧光剂、化学发光剂、放射性试剂、造影剂以及其类似试剂。合适荧 光剂包括典型用于流动式细胞测量术的荧光剂并且可以包括(但不限 于)异硫氰酸荧光素、R-藻红素、得克萨斯红(Texas Red)、Cy3、Cy5、 Cy5.5、Cy7以及其衍生物。

在某些实施方案中，FVIII肽可以用于体外再刺激CD4⁺FVIII特异 性T细胞。在这些实施方案中，再刺激T细胞可以通过检测增殖、细 胞因子或趋化因子的分泌或本领域技术人员已知的某些活化标记的 上调或下调来监测。

在一些实施方案中，诊断剂检测可以用于鉴定和/或分离对本文 中所公开的FVIII肽有特异性的T细胞。例如，上述试剂(例如肽、 MHC II类四聚体以及诊断剂)可以用于体外或离体追踪FVIII特异性 T细胞。在某些实施方案中，可使用本领域中通常已知的各种技术进 一步分离和表征T细胞，所述技术如流动式细胞测量术，例如荧光活 化细胞分选(FACS)；和/或PCR，例如单细胞PCR。

为进行免疫监测分析，结合FVIII肽-MHC II类多聚体复合物的T 细胞包括CD4⁺T细胞，并且可以使用本领域中通常已知的多种方法从 患者分离。例如，T细胞可从患者血液、器官或其它组织分离和纯化。 FVIII特异性T细胞的分离和鉴定可以用于多种免疫诊断应用。在某些 实施方案中，FVIII肽或相关试剂可以在新FVIII产品的临床开发期间 用于免疫监测FVIII特异性T细胞。在其它实施方案中，FVIII肽可以 在免疫耐受性诱导疗法期间用于免疫监测FVIII特异性T细胞。在其它 实施方案中，FVIII肽可以在FVIII治疗期间用于免疫监测FVIII特异性 T细胞。

VIII.本发明的试剂盒

本发明还提供推进和/或标准化由本发明提供的组合物的使用以 及推进本发明的方法的试剂盒。可以在试剂盒中提供用于进行这些不 同方法的材料和试剂以推行方法的执行。如本文中所用，术语“试剂 盒”用以指推进方法、测定、分析或操纵的物品组合。

试剂盒可以含有化学试剂(例如FVIII肽或编码FVIII肽的多核苷 酸)以及其它组分。另外，本发明的试剂盒还可以包括例如(但不限于) 用于样品收集和/或纯化的设备和试剂、用于产物收集和/或纯化的设 备和试剂、用于细菌细胞转化的试剂、用于真核细胞转染的试剂、预 先转化或转染的宿主细胞、样品管、固持器、塔盘、支架、器皿、平 板、试剂盒使用者的说明书、溶液、缓冲剂或其它化学试剂，适用于 标准化、正规化的样品和/或对照样品。本发明的试剂盒还可以封装 于例如具有盖子的盒子中以便方便储存和安全运送。

在一些实施方案中，例如，本发明的试剂盒可以提供本发明的 FVIII肽、编码本发明的FVIII肽的多核苷酸载体(例如质粒)、适于繁 殖载体的细菌细胞菌株以及用于纯化所表达的融合蛋白的试剂。或 者，本发明的试剂盒可以提供为进行FVIII肽诱变所需的试剂，以便 产生FVIII肽的经过保守修饰的变异体。

试剂盒可以含有一种或多种本发明的组合物，例如一种或多种 FVIII肽或一种或多种编码FVIII肽的多核苷酸。或者，试剂盒可以 含有用于进行患者的免疫监测的试剂(例如肽、MHC II类四聚体以及 诊断剂)。

本发明的试剂盒还可以含有一种或多种编码FVIII肽的重组核酸 分子，所述分子可以为相同或不同的，并且可以进一步包含(例如)操 作性连接的含有或编码限制性核酸内切酶识别位点或重组酶识别位 点、或任何所感兴趣多肽的第二多核苷酸。另外，试剂盒可以含有使 用试剂盒组分(尤其试剂盒中所含有的本发明的组合物)的说明书。

IX.特定实施方案

在一个实施方案中，本发明提供一种FVIII肽，其由与以下氨基 酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个 连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽 具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基 酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；并且下标x和 y各独立地为0或1。

在一个实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至80个氨基酸 组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1 至70个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独 或两者均为由1至60个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案 中，R¹和R²单独或两者均为由1至50个氨基酸组成的氨基酸序列。 在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至40个氨基酸组成 的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至 30个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中，R¹和R²单独或 两者均为由1至20个氨基酸组成的氨基酸序列。在另一实施方案中， R¹和R²单独或两者均为由1至10个氨基酸组成的氨基酸序列。在另 一实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至5个氨基酸组成的氨基 酸序列。在其它实施方案中，R¹和R²单独或两者均为由1至2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 个氨基酸组成的氨基酸序列。

在上述肽的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述肽的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述肽的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述肽的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在上述肽的一个特定实施方案中，九个氨基酸的连续序列与氨基 酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个 连续氨基酸一致。

在一个实施方案中，本发明提供一种包含FVIII肽的药物组合物， 所述FVIII肽由与以下氨基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO:344)中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的 连续序列组成，并且所述肽具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1 至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的 氨基酸序列；且下标x和y各独立地为0或1。

在上述组合物的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述组合物的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述组合物的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述组合物的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在上述组合物的一个特定实施方案中，所述组合物进一步包含至 少一种肽，所述肽由与独立地选自由以下组成的组的氨基酸序列中的 九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成： GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO:159)、 PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO:250)、 EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO:477)、 LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO:568)、 NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO:659)、 TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO:10)、 AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)以及 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)，其中所述至少一 种肽长度为最大80个氨基酸并且其中所述至少一种肽中的任何其它 氨基酸为天然氨基酸。

在一个实施方案中，本发明提供一种在受试者中诱导对FVIII的 免疫耐受性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包 含FVIII肽的药物组合物的步骤，所述FVIII肽由与以下氨基酸序列： QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个连续氨 基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽具有 式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；下标x和y各独立 地为0或1；并且从而在所述受试者中诱导对FVIII蛋白的免疫耐受 性。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述药物组合物进一步包含 至少一种肽，所述肽由与独立地选自由以下组成的组的氨基酸序列中 的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成： GEVGDTLLIIFKNQASRPYNI(SEQ ID NO:159)、 PTKSDPRCLTRYYSSFVNMER(SEQ ID NO:250)、 EVEDNIMVTFRNQASRPYSFY(SEQ ID NO:477)、 LHAGMSTLFLVYSNKCQTPLG(SEQ ID NO:568)、 NPPIIARYIRLHPTHYSIRST(SEQ ID NO:659)、 TVVITLKNMASHPVSLHA(SEQ ID NO:10)、 AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIG(SEQ ID NO:68)以及 TVVITLKNMASHPVSLHAVGV(SEQ ID NO:740)，其中所述至少一 种肽长度为最大80个氨基酸并且其中所述至少一种肽中的任何其它 氨基酸为天然氨基酸。

在上述方法的一个特定实施方案中，施用药物组合物防止在受试 者中发展抗FVIII抗体。

在上述方法的一个特定实施方案中，施用药物组合物减少受试者 中存在的抗FVIII抗体的量。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在一个实施方案中，本发明提供一种制造FVIII肽的方法，所述 方法包括以下步骤：a)提供包含编码FVIII肽的载体的细胞培养物， 所述FVIII肽由与以下氨基酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT (SEQ ID NO:344)中的九个连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的 连续序列组成，并且所述肽具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1 至80个氨基酸组成的氨基酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的 氨基酸序列；下标x和y各独立地为0或1；和b)在所述细胞培养物 中表达所述肽。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在一个实施方案中，本发明提供一种制造FVIII肽的方法，所述 方法包括：a)使用固相或液相合成技术合成肽，所述肽由与以下氨基 酸序列：QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个 连续氨基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽 具有式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基 酸序列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；下标x和y各 独立地为0或1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为1。

在一个实施方案中，本发明提供一种鉴定FVIII肽特异性T细胞 的方法，所述方法包括：a)使多种CD4+T细胞与同MHC II类多聚 体复合的FVIII肽组合，所述FVIII肽由与以下氨基酸序列： QANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLT(SEQ ID NO:344)中的九个连续氨 基酸至少85%一致的九个氨基酸的连续序列组成，并且所述肽具有 式：(R1)x-肽-(R2)y，其中R1为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序 列；R2为由1至80个氨基酸组成的氨基酸序列；下标x和y各独立 地为0或1；和b)鉴定对与MHC II类多聚体复合的肽有特异性的所 述多种CD4+T细胞中的至少一员。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述MHC II类多聚体为 MHC II类四聚体。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述肽或MHC II类多聚体 进一步包含诊断剂。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述诊断剂鉴定对肽有特异 性的所述多种CD4+T细胞的至少一员。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述方法进一步包括基于所 述诊断剂的检测分离对所述肽有特异性的所述多种CD4+T细胞的至 少一员。

在上述方法的一个特定实施方案中，所述多种CD4+T细胞的至 少一员是使用流动式细胞测量术分离。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为1且y为0。

在上述方法的一个特定实施方案中，x为0且y为1。

在上述方法的一个特定实施方案中，x和y都为1。

现将在以下实施例中进一步说明本发明，但本发明不受限于这些 实施例。

X.实施例

实施例1

为了更好地模拟人类MHC II类分子以鉴定FVIII肽，开发具有携 带人类HLA-DRB1*1501特异性结合位点的嵌合MHC II类分子的甲 型血友病的小鼠模型。这种小鼠与完全剔除所有鼠类MHC II类基因 的小鼠回交(Reipert等,J.Thromb.Haemost.7增刊1:92-97(2009))。在 这种新转基因小鼠模型中，所有CD4⁺T细胞反应都由人类MHC II类 分子驱动。此小鼠模型用以鉴定由HLA-DRB1*1501呈现的在这些小 鼠中驱动抗FVIII免疫反应的FVIII肽。

材料和方法

FVIII：制得重组人类FVIII(rFVIII)，其呈无白蛋白散装产品 (Baxter Neuchatel)和临床蔗糖配制的FVIII产品(Advate,Baxter, Westlake Village,CA)形式。

血友病HLA-DRB15E17小鼠：如Reipert等,J.Thromb.Haemost.7 增刊1:92-97(2009)中所述的HLA-DRB1*1501^+/-E17^-/-小鼠。小鼠全部 为雄性且在实验开始时为8至12周大。

用人类重组FVIII免疫：HLA-DRB1*1501^+/-E17^-/-小鼠以每周间隔 接受4至8次之间的0.2μg或1μg人类rFVIII的静脉内或皮下剂量。 将rFVIII稀释于原始制剂缓冲液或杜尔贝科磷酸盐缓冲生理盐水(含 有钙和镁)(DPBS，Sigma Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)中。

细胞制备：在使用rFVIII最后一次免疫后3至7天取得脾脏。切 碎脾细胞并且使其通过70μm细胞过滤器(Becton Dickinson,Franklin  Lakes,NJ)。将单一细胞收集于以下培养基中：补充有10%预选胎牛 血清(FCS；Hyclone,Logan,UT)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉 素/链霉素(两者均来自Gibco)以及5×10^-5M巯基乙醇(Sigma-Aldrich) 的RPMI 1640培养基(Gibco,Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad, CA)。使用主要由0.15M氯化铵、10mM碳酸氢钾(两者均来自Merck, Darmstadt,Germany)以及0.1mM乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich)组成的 低渗缓冲液(pH7.2)溶解红血球。洗涤细胞并且使用库尔特计数器Z1 计数。

产生T细胞杂交瘤以鉴定FVIII肽

用人类rFVIII体外再刺激脾细胞：在20μg/mL人类FVIII存在下以 1.5×10⁶个细胞/毫升的浓度于培养基中再刺激脾细胞3或10天。在6 天后更新用于10天培养的培养基。

小鼠T细胞与BW细胞的融合：用无血清培养基洗涤体外再刺 激的脾细胞培养物和BW细胞(α-β-)两次，并且随后以1:3至1:10(T 细胞:BW细胞)的比率组合。BW细胞系来源于小鼠AKR/J T细胞淋 巴瘤。这些细胞在其表面(α-β-)上不具有T细胞受体且因此在与小鼠 脾细胞融合后的任何T细胞受体来源于融合搭配物。在第三个洗涤步 骤后，移除上清液。通过在45秒内添加1ml聚乙二醇(PEG；50% HybiMax,Sigma-Aldrich)来达成融合条件。再培育45秒后，接着添加 50ml无血清培养基以防止PEG的毒性效应。在1300rpm下不间断 地离心细胞5分钟以形成非常结实的沉淀。弃去上清液并且非常缓慢 地添加50ml新的无血清培养基，旨在不使沉淀移位。缓慢颠倒试管 直至细胞再悬浮并且如前所述离心。进行此操作两次以移除剩余 PEG。用培养基进行最后的洗涤步骤。接着稀释细胞并且在96孔板 中培养。在48小时后将培养基更换为选择培养基(HAT培养基补充 物，Sigma Aldrich)且选择生长克隆。保留选择培养基2周，其后接 着将培养基更换回正常培养基。

FVIII特异性T细胞杂交瘤的肽特异性：测试T细胞杂交瘤的抗原 特异性。为此目的，使1×10⁵个细胞与抗原呈现细胞共培养。使用5×10⁴个Mgar细胞(表达HLA-DRB1*1501)或1×10⁵个来源于未处理的 HLA-DRB1*1501-E17小鼠的完整脾细胞。在37°C、5%CO₂下用10 μg/mL人类rFVIII或1μg/mL肽/肽池培育细胞24小时。收集上清液且 根据制造商方案使用IL-2ELISA(BioLegend,San Diego,CA)或IL-2 Bio-Plex(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)测量释放于培养上清液 中的IL-2。在FVIII(或肽)存在(而非不存在)下IL-2释放量≥20pg/ml视 为阳性，或者在FVIII存在下，与不存在FVIII相比IL-2释放量增加10 倍视为阳性。

T细胞杂交瘤的亚克隆：为确保各克隆仅表示一种类型的T细胞， 亚克隆所有杂交瘤克隆。将杂交瘤克隆稀释成0.3个细胞/孔的限制稀 释度并且与每孔200个喂养细胞共培养。喂养细胞是通过以丝裂霉素 C处理融合搭配物细胞BW细胞来产生。在室温下用0.1mg来自头状 链霉菌(Streptomyces caespitosus)的丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理 2×10⁸个BW细胞10分钟且在37°C、5%CO₂下于培育箱中培育25分 钟。每个克隆选择五个生长亚克隆且测试其FVIII特异性。

用以确定T细胞杂交瘤特异性的FVIII肽池：如Ay等 (Biopolymers 88:64-75(2007))所述，使用SPOT合成法产生FVIII肽 池。简单地说，在两个相同的纤维素膜上合成15聚体肽。将膜切割 为垂直和水平条带。肽从膜条带释放并且在如上所述的特异性测试中 用作肽池。将肽溶解于DMSO(Hybrimax,Sigma Aldrich)中且用PBS 进一步稀释。

结果

产生181种FVIII特异性杂交瘤克隆。针对覆盖整个人类FVIII的 肽库筛选这些克隆。使用偏移三个氨基酸的15聚体肽。使用此方法 鉴定含有与HLA-DRB1*1501结合的肽的六个不同FVIII区。发现人类 FVIII的两个肽域在A1域内、两个肽在A2域内、一个在B域内、两个 在A3域内且一个肽域在C1域内。先前并未描述FVIII肽^1401-1424(表11)。 已经在WO 09/071886中使用计算机预测程序继之以T细胞杂交瘤技 术鉴定肽FVIII^474-494、FVIII^545-559、FVIII^1788-1802以及FVIII^2161-2175。肽 FVIII^2030-2044公开于WO 03/087161中。肽FVIII^2161-2180已由Jacquemin等, Blood 101(4):1351-8(2003)公开。

表11.FVIII的包括T细胞表位的区域

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