小麦条锈菌17号生理小种的分子检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术中的RAPD(Random Ampiified Polymorphic DNA)分子标记转化为SCAR(Sequence Characterized Ampiified Region)分子标记技术，设计了可用于监测和鉴定小麦条锈菌17号生理小种的特异性引物。 

技术背景

我国是世界上小麦种植面积最大和消费最多的国家之一，小麦的丰欠直接关乎国计民生。小麦条锈病是世界性小麦病害，全球大多数小麦产区均有发生。小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)可借助气流高空远距离传播，导致病害在不同小麦产区间流行，是影响粮食安全生产的重大生物灾害。小麦条锈病曾频繁造成包括我国在内的全球小麦主产国毁灭性的产量损失。自解放以来，小麦条锈病在我国发生过9次大流行，对小麦生产造成了灾难性的影响，特别是1950、1964、1990和2002年的四次大流行分别使小麦减产60亿kg、32亿kg、26.5亿kg和14亿kg(Chen et al.，2009)。进入本世纪以来，由于小麦条锈菌毒性变异和新小种产生，小麦条锈病已在我国小麦产区连续流行了近10年，每年损失小麦在10亿公斤左右。据统计，在美国，小麦品种对条锈病的平均抗性寿命为5-6年，在我国一个抗锈品种大面积推广后快则3-5年、慢则8-10年就“丧失”了抗锈性。抗病育种是防止小麦条锈病的一种经济有效的途径，但是由于小麦条锈菌毒性变异快，易产生新小种，小麦品种的抗病性很容易丢失。因此，研究生理小种的分布以及动态变化，可为小麦条锈病的防治提供重要的价值。 

传统的生理小种的鉴别采用鉴别寄主的方法，该方法工作量大，耗时久，且易因环境条件变化造成误判。本发明利用RAPD分子标记转化为SCAR分子标记的方法，开发的引物可用于CYR17鉴定和监测，具有准确快速、省时省力等优点。 

发明概述 

本发明是针对传统的小麦条锈菌生理小种鉴定方法的缺陷，建立一种针对于CYR17快速准确的分子鉴别方法，该方法的提出基于CYR17特异性引物的设计。 

1.CYR17的特异性引物设计 

选用小麦条锈菌CYR17、CYR33、CYR32、CYR31、CYR29、Su11-4、Su11-7、Hybird46-5共8种生理小种(型)，提取基因组DNA作为模板，用RAPD随机引物S13(TTCCCCCGCT)筛选出CYR17具有大小约为1000bp的特异性条带(如附图1所示)，对该条带进行胶回收、连接T-Vector、转化、提取质粒、测序，然后根据序列设计出CYR17号生理小种的特异性引物，上游引物5’-TTCCCCCGCTGTCT-3’，下游引物5’-GTTGAGCGGGGGAA-3’。利用该引物可以特异的从CYR17基因组DNA中扩增出一条约1000bp的条带(如附图2所示)。 

2.CYR17分子检测体系的建立 

(1)以小麦条锈菌的基因组DNA作为模板，PCR反应为25μL扩增体系，其中10×Buffer2.5μL、25mM的MgCl₂2.0μL、2.5mM的dNTP1.5μL、上下游引物各10ng、模板DNA50ng、Taq DAN聚合酶0.2U，用无菌去离子水补至25μL，混匀后，瞬时离心，放入PCR仪中进行扩增。扩增程序为：第一个循环94℃变性5min；94℃变性30sec，60℃退火1min，72℃延伸90sec，共35个循环；最后一个循环，72℃延伸7min。 

(2)PCR反应产物在2％琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液电泳，电压为5-6V／cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析照相。 

(3)只有CYR17在1000bp处出现特异性条带(如附图2所示)。 

3.引物的灵敏性 

将17号生理小种的DNA分别稀释为3ng／μL，3×10^-1ng／μl，3×10^-2ng／μl，3×10^-3ng／μl，3×10^-4ng／μl，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。该方法可以检测到CYR17基因组DNA的最低浓度为30pg／μL(图3)，灵敏度高。 

附图简述 

附图1：随机引物S13PCR扩增电泳图。泳道1-12分别是Maker、CYR33、CYR32、CYR31、CYR29、Su11-4、Su11-7、Hybird46-5、CYR17、CYR17、CYR17、阴性对照。显示CYR17在大约1000bp处出现特异性条带。 

附图2：使用本发明特异性引物对不同生理小种进行扩增后的电泳图。泳道1-10分别为阴性对照、Hybird46-5、Su11-7、Su11-4、CYR17、CYR29、CYR 31、CYR32、CYR33、Maker。显示，根据本发明设计的特异性引物特异性扩增CYR17，扩增出大约1000bp的条带。 

附图3：CYR17基因组DNA在不同浓度下的PCR扩增电泳图。1-7泳道分别为Maker、3ng/μL、3×10^-1ng/μl、3×10^-2ng/μl、3×10^-3ng/μl、3×10^-4ng/μl、阴性对照，结果表明本发明方法可以检测到CYR17基因组DNA的最低浓度为30pg/μL，灵敏度高。 

附图4：接菌不同天数小麦叶片CYR17的PCR检测结果。泳道1-3分别为Maker、产孢叶片DNA、花斑叶片DNA；泳道4-7分别为接菌后第9、第7、第5、第3天潜育期叶片DNA；泳道8：阴性对照；泳道9：CYR17DNA；泳道10：健康小麦叶片DNA。 

具体实施方式

实施例1：发病叶片的检测 

在13×12cm的营养钵中种植感病品种‘铭贤169’，每钵种植10粒，出苗后每钵保留6株。待小麦幼苗第一片叶完全展开时，采用饱和接种法接种夏孢子，以无菌水接种作为对照。将接菌的小麦幼苗在黑暗条件下(温度10℃、相对湿度100％)保湿36h后移至人工气候培养箱(温度14～16℃、每天光照16h、相对湿度60～80％、光强度8000～10000Lx)培养。分别在接种后的第3天、第5天、第7天、第9天、第12天(产生花斑)。第14天(产生孢子)采集小麦叶片，提取总DNA，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，采用该方法可以从接种发病并产孢的小麦叶片及尚处于花斑期的小麦叶片中检测的CYR17的存在(图4)。 

实施例2：田间小麦条锈菌17号生理小种流行频率检测 

2012年6月3日-5日，在甘肃天水、陇南和平凉随机采集50个田块，每个田块随机采集20片典型小麦条锈病发病叶片，带回实验室，采用CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)法提取发病小麦叶片的总DNA，采用本发明所设计的特异性引物及PCR反应体系进行标样的检测，结果表明，小麦条锈菌17号生理小种在甘肃天水、陇南和平凉的流行频率为11.2％(表1)。 

表1 2012年甘肃天水小麦条锈菌17号生理小种流行频率检测结果