一种人γδT细胞对K562细胞株的杀伤活性检测方法

本申请是2012年2月10日、申请号为201210030197.4的发明专利《一种简单高效制备 人γδT细胞的方法》的分案申请。

技术领域

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种体外大量优势扩增人外周血γδT细胞 的对K562细胞株的杀伤活性检测方法。

背景技术

T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)的不同分为两类：TCRαβT 细胞和TCRγδT细胞，分别简称为αβT细胞和γδT细胞。其中γδT细胞是介于特异性免疫 与非特异性免疫之间的一种特殊类型的细胞，大多数为CD4和CD8分子双阴性，少数可表 达CD8分子。γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织，一般不超过T细胞总数的5%。γδT细 胞具有特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能，是机体 免疫监视的第一道防线。但由于γδT细胞在外周血和肿瘤组织中含量不高，要获得大量高细 胞毒活性的γδT细胞是十分困难的。虽然已有技术通过抗TCRγδ抗体或非肽磷酸类抗原获得 大量γδT细胞，这无疑会增加其制备的成本。经广泛查阅国内外专利文献和各种出版物，迄 今为止，均未见有实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血γδT细胞的发明或报道。因 此发明一种实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血γδT细胞的方法，对于γδT细胞免 疫功能的研究，并用其提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能力是非常重要的，对于攻克人 类渴望解决的恶性肿瘤性疾病这一难题也是十分有价值的。在人外周血γδT细胞制备后需要 对其进行对K562细胞株的杀伤活性检测，确保其效果。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种人γδT细胞对K562细胞株的杀伤活性检测方法。用于检 测人γδT细胞。

本发明所采用的技术方案是：一种制备人γδT细胞的方法，包括如下步骤：培养结核杆 菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）并制备结核杆菌耐热性抗原（Mycobacterium tuberculosis  heated antigen,Mtb-HAg），采集并分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），用Mtb-HAg激活，同时加入细胞因子rhIL-2和rhIL-21，置于37℃，5%CO2和 饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细 胞生长状态每2～3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为（0.5～2.0）×10⁶/ml。10～15天即可以获得大量、高细胞毒活性的γδT细胞。所述的Mtb培养基为苏通式液 体培养基或者Middlebrook7H9，Mtb经过高压蒸汽处理，并经离心超滤制备成Mtb-HAg。所 述的PBMCs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤2次， 低速离心后获得。所述Mtb-HAg的终浓度为5～10μg/ml，rhIL-2的终浓度为50～500IU/ml， rhIL-21的终浓度为5～20ng/ml。根据PBMCs的生长状态，细胞培养时间约为10～15天。

本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

取对数生长期的K562细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为1×105/ml、5×104/ml、2.5 ×104/ml，每孔取100μl铺于96孔培养板中，培养24小时，取制备的人γδT细胞调密度 为1×106/ml，加入96孔培养板中，使效靶比分别为10:1、20:1和40:1，各密度设3个复 孔并分别设置空白对照，培养48小时后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl，继续培养4 小时后弃上清，每孔加入DMSO100μl，于A570nm和A630nm处测吸光度(A)值，计算出 绝对A值（A=A570-A630），按下式计算杀伤活性：杀伤活性（%）=（A靶细胞+A效应细 胞—A效靶混合细胞）/A靶细胞×100%。

本发明的有益效果是：检验获得的γδT细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点， 从而确保制成的人γδT细胞能够满足临床的需要，而且实现了IPP等非肽磷酸类抗原、抗 TCRγδ抗体等刺激剂相比培养成本大大降低；解决了现有技术体外培养γδT细胞数量低、毒 性弱、成本高等问题的效果。

具体实施方式

下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件 的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

首先本发明是用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原。包括以下步骤：

1.将结核杆菌菌体种子湿重50～100克接种于200ml的苏通式液体培养基内，于37℃ 培养箱内静止培养2周，然后将其分装到含有10%～30%新生牛血清的250ml的苏通式液 体培养基内，每瓶50ml，分装成4瓶，再继续于37℃培养箱内静止培养4周，收集培养的 细菌悬液，经4000转/分，离心30分钟以收获结核杆菌菌体。

2.将收集的菌体经生理盐水洗涤2次，再用2倍体积的蒸馏水重悬浮菌体，115℃高压 蒸汽处理20分钟，4000转/分，离心30分钟收集上清液，即为Mtb-HAg。

用制备的Mtb-HAg刺激PBMCs，以获取大量、高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞。具 体操作包括以下步骤：

1.无菌条件下用血细胞分离机或50ml注射器采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖 胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为：1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层， 56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀 释血液按1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐 水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞。

2.将上述分离的PBMCs置于含有1～10μg/ml的Mtb-HAg、50～500IU/ml rhIL-2、5～ 20ng/ml rhIL-21和1%～10%自体血浆的RPMI1640、AIM-V或GT-T551培养基内，调细 胞密度为（1～2）×10⁶/ml，优选的刺激剂和细胞因子的浓度分别为：5μg/ml Mtb-HAg、200 IU/ml rhIL-2、10ng/ml rhIL-21，自体血浆的浓度为5%，细胞的初始密度2×10⁶/ml，转 入细胞培养板、培养瓶或培养袋内，优选细胞培养袋，于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养 箱内培养，72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2～ 3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为（0.5～2.0）×10⁶/ml。根据PBMCs 的生长状态，细胞培养时间约为10～15天。在细胞培养的第14天，培养增殖的人γδT细胞 绝对扩增细胞倍数平均高达500倍（n=8）。

对上述培养的γδT细胞进行形态学、纯度及免疫表型和细胞毒活性检测。具体操作包括 以下步骤：

1.细胞培养24小时即可见γδT细胞沉于培养器皿的底部，并趋于集落化，48小时集落 开始变大，培养6～10天即可以看到大的集落和不规则的单个核细胞。对培养10天的细胞进 行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆 形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见1个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富， 染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形。取培养10天的细 胞100μl，加入100μl0.4%台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数。 通过本发明可以观察到制备的细胞活力大于95%。

2.分别取第0、7、14、21和28天的细胞，用含5%新生牛血清和0.1%叠氮纳的PBS 洗涤2次，调整细胞密度为1×10⁶/ml，每个检测管内加入50μl细胞悬液，加入荧光标记抗 体（抗CD3-FITC、抗TCRγδ-PE）染色，4℃避光孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入 含有1%多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用WinMDI软件 分析。通过本发明可以检测到制备的细胞制剂，CD3+T细胞高度富集纯度达到98%，γδT细 胞从第10～14天达到峰值平均为80%（n=8）。

3.取对数生长期的K562细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为1×10⁵/ml、5×10⁴/ml、 2.5×10⁴/ml，每孔取100μl铺于96孔培养板中，培养24小时，取制备的人γδT细胞调密 度为1×10⁶/ml，加入96孔培养板中，使效靶比分别为10:1、20:1和40:1，各密度设3个复 孔并分别设置空白对照，培养48小时后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl，继续培养 4小时后弃上清，每孔加入DMSO100μl，于A570nm和A630nm处测吸光度(A)值，计算 出绝对A值（A=A570-A630），按下式计算杀伤活性：杀伤活性（%）=（A靶细胞+A效 应细胞—A效靶混合细胞）/A靶细胞×100%。结果显示本发明制备的γδT细胞对K562细 胞株具有较高的杀伤活性，杀伤率平均为82%（n=8）。