一种高效代谢油脂的大肠杆菌及其在生物基化学品生产中的应用

技术领域

本发明涉及一种高效代谢油脂的大肠杆菌及其在生物基化学品生产中的应用。

背景技术

甲羟戊酸途径在自然界中广泛存在,甲羟戊酸和其下游衍生物如异戊二烯和类异戊二烯 化合物可以通过在工程菌中表达外源的甲羟戊酸途径的重组酶获得,如Tabata等利用工程大肠 发酵生产甲羟戊酸（Tabata et al.,2004Biotechnology Letters,26:1487-1491），美国的Genencor 公司利用工程大肠杆菌发酵生产异戊二烯（Whited et al.,2010Industrial Biotechnology,6:152）， Piteta等利用工程大肠杆菌合成类异戊二烯化合物（Piteta et al.,2007Metabolic Engineering, 9:193-207）；尽管上述研究利用不同的宿主和不同的酶进行甲羟戊酸和下游衍生物类异戊二烯 化合物的发酵,但是均有一个共同点,就是以糖为原料进行发酵。理论上来讲1.5分子的糖通过 甲羟戊酸途径只能生成1分子的甲羟戊酸，因此理论质量转化率只有52%，并且至甲羟戊酸 下游途径产物如类异戊二烯化合物的发酵得率更低。由于采用糖为原料通过工程菌发酵生产 类异戊二烯化合物的产率较低,限制了其商业化应用。

发明内容

本发明提供了一种高效代谢油脂的大肠杆菌，是在大肠杆菌中引入来自真氧产碱杆菌的 油脂代谢途径得到的重组菌。

所述来自真氧产碱杆菌的油脂代谢途径是真氧产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组 （NCBI登陆号：NC_008313.1）内编号为H16_A0460至H16_A0464的五个基因（NCBI中 NC_008313.1基因组Locus tag编号：H16_A0460,H16_A0461,H16_A0462,H16_A0463, H16_A0464）。

优选将上述真氧产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组内编号为H16_A0460至 H16_A0464的五个基因导入敲除了FadR基因的大肠杆菌。

所述大肠杆菌为任意已知大肠杆菌，优选标准菌株BL21（DE3）或者JM109（DE3）。

本发明还提供了一种高效代谢油脂的大肠杆菌的构建方法，是在大肠杆菌中引入来自真 氧产碱杆菌的油脂代谢途。

更进一步，所述大肠杆菌为敲除了FadR基因的大肠杆菌，优选敲除了FadR基因的BL21 （DE3）或者JM109（DE3）。

具体而言，所述高效代谢油脂的大肠杆菌的构建方法如下：

1）FadR基因的敲除，根据已有的大肠杆菌标准菌株JM109（DE3）基因组信息，找到 FadR基因上下游各500个碱基的基因序列合并为1千个碱基的序列，并且在5’端和3’端分别 加入15bp和质粒pRE112多克隆位点两端相同的同源臂；根据序列信息化学合成线性DNA 片段如SEQ ID NO.1所示；将通用自杀质粒pRE112和合成的线性DNA片段重组为新质粒 pJZ1，将pJZ1通过热激转化法转入大肠杆菌X7213，通过细菌转导的方式将pJZ1通过大肠 杆菌X7213导入JM109（DE3）进行FadR基因敲除；

2）工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇，提取真养产碱杆菌Ralstonia  eutropha H16的基因组（NCBI登陆号：NC_008313.1），根据已经公布的真养产碱杆菌 Ralstonia eutropha H16基因组信息，设计引物从真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16的基因 组扩增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段，合成时分别在序列的两端分别加上 15bp和质粒pBBR1MCS-2相同的同源臂序列；将重组基因簇片段和通用表达质粒 pBBR1MCS-2的部分序列，重组为新表达载体pBBR-H16HZ1，序列如SEQ ID NO.2所示；

3）将表达载体pBBR-H16HZ1转入步骤1）构建的重组大肠杆菌得到大肠杆菌ZM1。

上述大肠杆菌可高效代谢油脂。

本发明还提供了一种发酵生产甲羟戊酸的方法，具体步骤如下：

1）从大肠杆菌标准菌株BL21（DE3）或者JM109（DE3）出发，敲除其基因组上的FadR 基因；

2）将真氧产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组内编号为H16_A0460至H16_A0464的五 个基因导入大肠杆菌进行表达；

3）将合成甲羟戊酸的酶基因导入步骤2）得到的大肠杆菌；

4）利用步骤3）得到的大肠杆菌以植物油或脂肪酸为碳源发酵生产甲羟戊。

更进一步，本发明构建的大肠杆菌能够高效的转化油脂类底物生成甲羟戊酸，更进一步 的用于发酵生产异戊二烯，该转化过程在温和的条件下（30-37℃）进行，且碳源至甲羟戊酸 和下游衍生物异戊二烯的转化率较高，有效的降低了生产成本，该方法为生物合成甲羟戊酸 和异戊二烯的工业化应用打下了坚实的基础。

具体实施方式

实施例1：针对大肠杆菌标准菌株JM109（DE3）基因组的遗传修饰，即FadR基因的敲除 和表达来自真养产碱杆菌H16基因组内编号为H16_A1526至H16_A1531基因的基因簇。

FadR基因的敲除。大肠杆菌标准菌株JM109（DE3）被用作基本菌株来进一步进行遗传 修饰。根据已有的大肠杆菌标准菌株JM109（DE3）基因组信息，找到FadR基因上下游各500 个碱基的基因序列合并为1千个碱基的序列，并且在5’端和3’端分别加入15bp和质粒pRE112 多克隆位点两端相同的同源臂；根据序列信息化学合成约1千碱基的线性DNA片段（SEQ ID  NO.1）。利用In-Fusion HD试剂盒（Takara，货号639648）将通用自杀质粒pRE112（Addgene 公司）和合成的线性DNA片段重组为新质粒pJZ1，将pJZ1通过传统的热激转化法转入大肠杆 菌X7213（来自德国微生物菌种保藏中心）。而后通过细菌转导的方式将pJZ1通过大肠杆菌 X7213导入JM109（DE3）进行FadR基因敲除，该操作步骤和使用自杀质粒进行基因敲除的标 准方法一致（Edwards et al.,1998Gene,207:149）。

工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇。敲除FadR基因的JM109（DE3）被用 作出发菌株来进一步进行遗传修饰。提取真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16的基因组 （NCBI登陆号：NC_008313.1），根据已经公布的真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因 组信息，设计引物（上游引物CAGGAAACAGCTATGTCCAATTTCATCGTCAAGAAGG；下 游引物AAATATTAACGCTTACTCGAACTTCGTAAAATCCGGC）从真养产碱杆菌Ralstonia  eutropha H16的基因组扩增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段（总长度5551bp）， 合成时分别在序列的两端分别加上15bp和质粒pBBR1MCS-2相同的同源臂序列。然后利用 In-Fusion HD试剂盒（Takara，货号639648）重组基因簇片段和通用表达质粒pBBR1MCS-2 （荷兰菌种保藏中心，编号NCCB3434）的部分序列（不含lacZ基因的序列），重组为新表达 载体pBBR-H16HZ1（SEQ ID NO.2）。

将表达载体pBBR-H16HZ1通过传统的热激转化法转入敲除FadR基因的JM109（DE3）来 构建能够高效代谢油脂的工程大肠杆菌ZM1。

细胞生长实验证明遗传修饰的工程大肠杆菌ZM1具备比出发菌株JM109（DE3）更强的油 脂代谢能力：将ZM1和JM109（DE3）分别挑取单克隆接入10ml摇管进行菌种细胞生长实验， 发酵温度32℃，pH值控制在7.0，培养基组分见表1（ZM1的培养基不加氯霉素，JM109（DE3） 的培养基不加氯霉素和卡那霉素），以花生油为唯一碳源进行菌体生长，摇管放入微生物培 养箱，220转培养12小时后，ZM1的菌体密度OD₆₀₀达到0.6，对照菌的菌体密度OD₆₀₀只有0.1， 证明以油脂为唯一碳源时，ZM1的生长显著强于对照菌JM109（DE3），拥有更高的油脂代谢 能力。

实施例2：构建产甲羟戊酸的工程大肠杆菌和产异戊二烯的工程大肠杆菌。

根据已经公布的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA） 合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的全长序列信息（Tabata et al.,2004 Biotechnology Letters,26:1487-1491），和我实验室在前期研究中已公布的质粒构建方法（Yang  et al.,2012PLOS ONE,7:e33509），构建表达质粒pACY-mva。将表达载体pACY-mva通过传统 的热激转化法转入重组有H16_A1526至H16_A1531基因的大肠杆菌ZM1来构建利用油脂底物 产甲羟戊酸的工程大肠杆菌ZM2。

实施例3：利用构建的工程大肠杆菌以植物油或中长链脂肪酸（碳链长度C8至C18）为碳源发 酵生产甲羟戊酸。

使用工程菌株ZM2以植物油（花生油或橄榄油）为碳源发酵生产甲羟戊酸。使用该菌株 发酵甲羟戊酸的条件为：使用该菌株发酵甲羟戊酸的条件为：在500毫升摇瓶体系中使用100 毫升装液量，接种量5%，发酵温度32℃，pH值控制在7.0，培养基组分见表1，初始植物油添 加量为2克/升，搅拌速度为300至600rpm，溶氧控制在20%至40%，发酵60小时后，以不同植 物油为碳源发酵甲羟戊酸的产量见表2。

使用工程菌株ZM2以脂肪酸（月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸）为碳源发酵生产甲羟戊酸。 使用该菌株发酵甲羟戊酸的条件为：在500毫升摇瓶体系中使用100毫升装液量，接种量5%， 发酵温度32℃，pH值控制在7.0，培养基组分见表1，初始脂肪酸添加量为2克/升，搅拌速度 为300至600rpm，溶氧控制在20%至40%，发酵60小时后，以不同植物油为碳源发酵甲羟戊酸 的产量见表2。

表1工程大肠杆菌ZM2发酵甲羟戊酸培养基组分表

*微量元素储液配方为：15.00克/升FeSO₄，2.40克/升MnSO₄，2.40克/升ZnSO₄，0.48克/升 CuSO₄。

表2工程大肠杆菌ZM2发酵甲羟戊酸产量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。