公开/公告号CN103571930A
专利类型发明专利
公开/公告日2014-02-12
原文格式PDF
申请/专利权人 清华大学深圳研究生院;
申请/专利号CN201210259374.6
申请日2012-07-20
分类号C12Q1/68;C12N15/11;
代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司;
代理人关畅
地址 518055 广东省深圳市南山区西丽镇深圳大学城清华校区
入库时间 2024-02-19 22:01:39
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-04-08
授权
授权
2014-03-12
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20120720
实质审查的生效
2014-02-12
公开
公开
技术领域
本发明涉及人类唐氏综合症DNA序列在作为检测植入鼠体内的人细胞数量的靶标序列 的应用，以及人类唐氏综合症DNA序列在检测植入鼠体内的人细胞数量的方法和基于此方法 的试剂盒中的应用。
背景技术
鼠（包括大鼠和小鼠）是常用的生物医学实验动物，广泛地用于人癌细胞转移和 人干细胞移植治疗的实验研究。实验中需注射一定数量的人细胞到鼠体内，准确掌握 这些细胞在鼠体内的分布对于研究细胞的特性及判断药物治疗效果都非常重要，但长 期缺少一种灵敏、稳定的方法，确定这些人癌细胞或干细胞在植入鼠体内后在各器官 的分布情况。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)具有特异、敏感、产率高、快 速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，基于PCR的技术已广泛应用于生物检测 和疾病诊断等领域。
虽然既往也有基于PCR技术的检测属组织中人细胞的方法，但存在方法复杂、可 重复性差、特异性低等缺陷。
发明内容
本发明的一个目的是提供人类唐氏综合症DNA序列在作为检测植入鼠体内的人 细胞数量的靶标序列的应用。
基于上述应用，本发明还提供人类唐氏综合症DNA序列在检测植入鼠体内的人 细胞数量的方法和基于此方法的试剂盒中的应用。
本发明所提供的检测植入鼠体内的人细胞数量的方法，是提取植入人细胞的鼠的 基因组基因，将人类唐氏综合症DNA序列片段作为靶标序列，利用权利要求3或4 所述的引物对进行PCR扩增，测定Ct值，根据Ct值和每个细胞含有的基因组基因的 量，推算植入的人细胞数量。
所述PCR扩增采用的realtime PCR方法。上述鼠为大鼠或小鼠。
基于上述方法的试剂盒，包括扩增人类唐氏综合症DNA序列的引物，所述引物 优选为核苷酸序列为序列表中序列1和序列2所示的寡核苷酸组成的引物对。
上述引物对也属于本发明的保护范围。
利用上述引物对，就可以采用realtime PCR方法建立在鼠组织中定量检测人细胞 数量的方法，用于检测人癌细胞在鼠组织中的转移和干细胞在鼠组织中移植的动物实 验研究，该方法具体包括：
（1）提取实验鼠组织的基因组DNA；
（2）使用本发明的试剂盒，用Real-Time PCR法检测其中人DNA含量；
发明人在长期的研究工作中发现唐氏综合症可能是灵长类特有的序列,作为噬鼠 类的大鼠和小鼠并不具有相应的同源序列,基于此,我们用人第21对染色体上人类所 特有的唐氏综合症序列Human Down Syndrome region of chromosome 21,clone A37A2-1F8.ACCESSION:U50569)对大鼠和小鼠基因组序列进行Blast,Blast的结果表 明,唐氏综合症序列对大鼠和小鼠的基因组序列具有极大的特异性,是理想的检测植 入鼠体内的人细胞数量的靶标序列,具有应用前景。
基于此发现,并达到真正的实用目的,我们在人第21对染色体上人类所特有的唐 氏综合症序列(Human Down Syndrome region of chromosome 21,clone A37A2-1F8.ACCESSION:U50569)上设计出一系列real-time PCR引物,分别用这些引物 序列对小鼠基因组序列进行Blast,分析这些引物序列与小鼠基因组序列的同源性,从 其中选出一对特异性最好的引物(其序列为：上游引物（Ｆ）：5′－ TTGATCCTGAGCGCGTGTTAG－3′（序列表中序列1）；下游引物（Ｒ）：5′－ TGGCCAGAGCAGACATTCAAG－3′（序列表中序列2）))。PCR反应中，引物设计的好坏 直接影响检测的特异性和灵敏度,由于这一对引物特异性好的原因,可以在200ng鼠 DNA中用real-time PCR方法定量检测出低至5pg的人DNA,建立了在鼠DNA中检测微 量人DNA水平的real-time PCR方法,为研究人类干细胞注入鼠尾静脉后在鼠体内各器 官分布奠定了坚实的方法学基础。此real-time PCR引物和方法,可以广泛地用于检测 人癌细胞或人干细胞在鼠体内各器官的分布,在肿瘤学和干细胞在体治疗的研究中有 广泛的应用前景。
实验结果证明，以上述引物为主要试剂的试剂盒灵敏度高，重复性好，是一种简 单、可靠的检测植入鼠体内的人细胞在各脏器分布情况的方法，在肿瘤学和干细胞研 究中有广阔的应用前景。上述试剂盒可以从鼠组织或体液中检测人细胞，具有使用特 异性引物，具有特异性高、敏感性强、重复性好之优点。
附图说明
图1为用唐氏综合症序列(ACCESSION:U50569)对大鼠基因组序列进行Blast的结 果。
图2为用唐氏综合症序列(ACCESSION:U50569)对小鼠基因组序列进行Blast的结 果。
图3为表示本发明特异性引物只是特异性的扩增人基因组中的序列，在小鼠细胞 的基因组样品中无扩增。
图4为本发明引物能特异性地在200ng鼠DNA中用real-time PCR方法定量检测 出人DNA量的标准曲线
图5为检测植入鼠体内的人细胞的试剂盒检测人间充质干细胞在静脉注射后在心 肌梗塞小鼠体内的分布的效果验证。图示测到的人DNA含量与静脉注射的人间充质 干细胞量呈良好的相关性。
具体实施方式
实施例1、检测植入鼠体内的人细胞的试剂盒的获得
1.唐氏综合症序列特异性分析
通过分析NCBI(美国国立生物技术信息中心)GenBank数据库中筛选人类特异的 基因组序列,最后选取人第21对染色体上人类所特有的唐氏综合症序列(Human Down Syndrome region of chromosome21,clone A37A2-1F8.ACCESSION:U50569，其序列如 序列表中序列3所示),下载该序列,用该序列对大鼠和小鼠基因组序列进行Blast,Blast 的结果表明,唐氏综合症序列对大鼠和小鼠的基因组序列具有极大的特异性,是理想 的检测植入鼠体内的人细胞数量的靶标序列。
2.引物对序列的设计
根据唐氏综合症序列作为模板,用Generunner软件设计出多对real-time PCR引物, 分别用这些引物序列对小鼠基因组序列进行Blast,分析这些引物序列与小鼠基因组序 列的同源性,从其中选出一对特异性最好的引物(其序列为：上游引物（Ｆ）：5′－ TTGATCCTGAGCGCGTGTTAG－3′（序列表中序列1）；下游引物（Ｒ）：5′－ TGGCCAGAGCAGACATTCAAG－3′（序列表中序列2）)。该序列扩增的片段为自 序列表中序列3的5′端第710--823位核苷酸序列。
3.引物的合成
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司的合成,该引物即构成本发明的方法 和基于此方法的试剂盒的主要成分。
4、检测植入鼠体内的人细胞数量的realtime PCR试剂盒的制备
本发明的方法和基于此方法的试剂盒由上述PCR引物和宝生物工程(大连)有限 公司(大连Takara公司)的realtime PCR试剂盒Premix Ex TaqTM组成。
5、小鼠组织基因组DNA提取、纯化和定量的试剂的制备
基因组DNA提取、纯化和定量方法按照《分子克隆实验指南(上下册)》(J.莎姆布 鲁克[美]著,黄培堂译)操作。因此，DNA提取、纯化和定量的试剂也按照《分子克隆 实验指南(上下册)》(J.莎姆布鲁克[美]著,黄培堂译)中配制。
实施例2、检测植入鼠体内的人细胞的试剂盒检测人间充质干细胞在静脉注射后 在心肌梗塞小鼠体内的分布的效果验证。.
制备小鼠（BALB/c购买自南方医科大学动物中心）急性心肌梗塞模型具体方法 如下所述
1、实验动物
11～12周balb/c小鼠,体重25～30g
2、手术器械
2%戊巴比妥钠溶液；备皮刀；固定用胶带及大头针;碘酒、酒精;手术刀片;小动物呼 吸机、心电图机、20号及24号留置针、眼科镊、眼科剪、持针器、弯钳、直钳、无损伤缝 合针、手术操作台、8/0缝线、5/0尼龙线各10捆；小动物呼吸机、心电图机；白炽灯60w。
3、麻醉、固定、监护
腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(50mg/kg)，5～7min后观察夹趾反射,如阳性则追加 10%～20%初始剂量的麻醉药。取右侧卧位,5～0尼龙线固定前上切牙,使鼠鼻距动物操作 台边缘5～10mm;胶带固定四肢、尾巴。手术野皮肤去毛,碘酒、酒精消毒。
4、气管插管、人工呼吸
以双前肢上缘5mm处垂直向上剪开10mm皮肤,钝性分离皮下组织,暴露气管,24 号留置针轻轻穿刺气管,有落空感后撤出,连接小动物呼吸机,设置呼吸频率为120次/分, 潮气量为1ml,缝合颈部切口。
5、开胸、结扎前降支
人工呼吸下,胸骨左缘心脏搏动最强处上一肋间沿肋骨方向切开皮肤10mm,逐层分 离皮下组织、肌肉,剪开胸膜,轻轻挤压右侧胸部使心脏较好呈现左心腔,在肺动脉圆锥和左 心耳之间,以左冠状静脉主干为标志，弯钳轻靠结扎点下方以稳定心脏,左心耳根部下方2 mm进针,深度0.5mm,以8/0缝线穿过心肌表层,小鼠休息10min后,予以结扎。迅速将心 脏复位；加大潮气量充盈双肺,恢复胸腔负压,5-0尼龙线逐层缝合,维持人工呼吸,动物苏 醒后拔出气管插管得到小鼠急性心肌梗塞模型。
6、小鼠心肌梗死术后的管理
①保温:观察小鼠体温,术中术后都可能出现小鼠体温降低,如手术时间短10～15分钟 可不予处理,如时间长可用60瓦灯,距离25～30cm保温,使小鼠体温控制在36～37℃之 间;②如术后呼吸困难,可以给予吸氧及呼吸兴奋剂。术后24小时，将上述制备的小鼠急 性心肌梗塞模型分为四组，每组4只，分别经小鼠尾静脉注射100万、50万、25万或 12.5万个人间充质干细胞（本科题组从人离体的胎盘中分离得到人间充质干细胞），72 小后分别提取小鼠肺、心、脾等组织DNA。
7、检测植入鼠体内的人细胞的数量
本发明通过对200ng鼠组织的基因组DNA进行real-time PCR反应测定其中人基 因组DNA的Ct值，根据预先测定的Ct值和人基因组DNA数量关系的标准曲线,可 以根据测定的Ct值推算得到200ng鼠组织的基因组DNA中人基因组DNA数量,由于 每个人体细胞含有5pg人基因组DNA量,然后根据推算得到人基因组DNA数量可以 确定人细胞的数量。
其中，PCR反应测定Ct值和人基因组DNA的量的关系是由下述方法获得的：提 取人间充质干细胞DNA，将人间充质干细胞基因组以十倍梯度稀释到各样品中，使其 个样品中分别含有100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng人间充质干细胞基因组，以稀释 样品为模板进行PCR扩增（PCR引物和方法如下所述），测定Ct值，以Ct值为横坐 标，以DNA模板的量的lg值为纵坐标，获得PCR反应测定Ct值和人基因组DNA的 量，结果如图4所示，图4中Q为人基因组DNA的量（ng），横坐标Avg Ct为PCR 反应测定Ct值。
用实施例1所述的方法和基于此方法的试剂盒进行检测，其中引物序列为：上游引 物（Ｆ）：5′－TTGATCCTGAGCGCGTGTTAG－3′（序列表中序列1）；下游引 物（Ｒ）：5′－TGGCCAGAGCAGACATTCAAG－3′（序列表中序列2）。real-time PCR方法按照大连宝生物工程有限公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书操 作。real-time PCR反应体系:上游引物：0.8微升(10微摩尔浓度)、下游引物0.8微升 (10微摩尔浓度)、模板2微升(200纳克DNA)、SYBERGREEN MIX10微升、ROX0.4 微升、无菌水6微升。共20微升反应体系,反应条件:首先95℃ 30s,然后两步反应: 95℃ 15s,63℃ 34s,进行40个循环，测定Ct值。以没有注射人细胞的小鼠组织为对照， 上述实验设重复三次。结果如图3和图5所示，图3显示，本发明特异性引物只是对 注射人细胞中的鼠组织有特异性的扩增，而对没有注射人细胞的小鼠细胞的基因组样 品中无扩增，图5显示测到的人DNA含量与静脉注射的人间充质干细胞量呈良好的 相关性，并可据此推算出细胞数量。
机译： 核酸的多肽编码分子，由DNA分子编码的人类生长蛋白质，人类生长蛋白质编码CDNA，药物化合物，人类生长蛋白质和DNA序列的应用，低生长度的测定方法，方法基因缺陷，DNA序列转化的细胞，鉴定或筛选试验的表达系统和方法，表达载体以及人类生长蛋白的应用
机译： 人类染色体21的唐氏综合症关键区域的人类基因序列，编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（MNB），在受唐氏综合症影响的神经元区域表达
机译： 免疫相互作用分子的变体，单克隆抗体，单克隆抗体3b6的去免疫形式，产生去免疫的单克隆抗体，去免疫的抗体分子，去免疫的抗体，鼠源单克隆抗体变体3b6的去免疫形式，用于人的免疫接种的鼠单克隆抗体3b6，检测人类患者血液凝块的方法，检测血液凝块或抗原结合片段的方法，促进血液凝块溶解或去除的方法人类，使用鼠源变异鼠单克隆抗体，并偶联
