云芝及含有云芝的制剂的检测方法

技术领域

本发明涉及一种云芝及含有云芝的制剂的检测方法，具体涉及云芝药材以及含有云芝、或云芝有效部位、或云芝有效部位群的制剂的质量控制和评价方法。

背景技术

云芝为多孔菌科真菌彩绒革盖菌Coriolus versicolor (L.ex Fr.) Quel干燥子实体。东汉时期《神农本草经》已有记载以云芝治疗癌症，《本草纲目》记载云芝有安神、益寿、利关节、坚筋骨、治耳聋作用。现代研究表明，从云芝中提取的云芝多糖用于肿瘤患者的辅助治疗，能显著提高癌症病人的生存质量，增强免疫，减少继发感染，缓解病痛，改善癌症患者的食欲减退作用。由于云芝多糖的独特活性与低毒效应在临床应用中具有极大的潜力，针对云芝多糖类成分开发的保健品、药品日益增加，1977年，从云芝中提取纯化的云芝多糖（PSK），在日本被开发成抗癌新药Krestin；1998年，以从云芝中提取纯化得到的云芝多糖肽（PSP）为主要成分的云芝糖肽胶囊正式获得我国卫生部的正式生产批准文号，目前已上市产品有云芝糖肽、云芝菌胶囊、云芝肝泰片、云芝肝泰胶囊等。目前，国内总多糖含量测定主要采取紫外分光光度法进行，经典的显色体系有苯酚-硫酸法（λmax=490nm）和蒽酮-硫酸法（λmax= 630nm），均选择无水葡萄糖为对照品。也有采用滴定法测定总多糖含量的，常用有斐林氏滴定法和间接碘量滴定法。如2010版《中国药典》中，云芝药材中的总多糖含量测定就采用的是间接碘量法。由于云芝药材及其制剂大多为有色样品，应用此类方法测定样品中的云芝总多糖时，方法的干扰因素多，结果准确度、专属性差。在国外对多糖的质量控制多采用高效凝胶色谱法测定多糖分子量及其分布，这也是对多糖产品质控手段之一，其对纯度较高的多糖产品质量控制较好，能有效的评价该产品的真伪。国内云芝类产品也有采用高效凝胶色谱法测定多糖分子量及其分布，以此来评价该类产品的质量，此方法能在一定程度上控制产品的质量，但对于主要含多糖类成分的云芝药材及其制剂的质量控制方法较少，由于它们所含的有效多糖是一大类，很难对其多糖含量、分子量分布范围来评价药材及其制剂质量的真伪和优劣，该评价方式不能反映它们整体的内在质量变化，存在一定的不合理性和不科学性，且专属性也较差。同时，云芝药材及其制剂中多糖分子组成、空间结构不同，而以相应对照品测得的样品多糖的分子量，并非分子量的绝对值。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确度高、专属性强、操作简便的云芝及含有云芝的制剂的检测方法，以便更好进行质量控制和评价。

本发明根据云芝药材及其制剂多糖的单糖组成是其一级结构的主要内容，是其空间结构的基础，首先需要将其多糖进行完全酸水解为单糖类物质之后，其中所含单糖的成分、各单糖成分含量的相互比例应该是具有物种唯一性和个体相似性的，因此，针对其开展的色谱分析，所获的色谱图谱具有较强的专属性。采用液相色谱分离检测技术，分析云芝药材及其制剂中多糖的单糖组成，建立相应的特征图谱，通过运用多糖中单糖组分特征图谱的相对保留时间和相对峰面积来评价该药材真伪，该质量控制和评价方法具有较强的专属性和创新性。同时，在特征图谱的基础上，建立单糖组分定量测定，并制定各含量限度，通过对单糖质量的控制可间接控制多糖的含量，以此质量控制方法评价药材质量的优劣，该质量控制和评价方法具有较高精确度和新颖性。

本发明的技术方案是：

取云芝药材3～6g（加水适量，加热回流提取，提取液离心，量取适量提取液,减压浓缩至适量）或制剂0.5～1g（加水使溶解），加入3～6倍体积的无水乙醇，分取沉淀，沉淀加水溶解，并加入稀硫酸（浓度为10%），100-120℃加热回流水解5-6小时，水解后溶液调pH至中性并定容，吸取上清液，置具塞试管中，加入NaOH溶液和PMP的甲醇溶液，于60～80℃衍生化反应30-60min，反应完全后调PH至中性并定容，取上清液加等体积三氯甲烷振摇提取，弃去有机溶液，重复操作3次，水溶液减压浓缩至适量用乙腈定容，作为供试品溶液；取D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖和L-岩藻糖对照品适量，加水溶解，按上述供试品溶液的衍生方法制备混合对照品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪，测定各单糖含量。其中超高效液相色谱检测条件是：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.3～1.0毫升/分钟；检测波长245nm；以乙腈为流动相A，以磷酸缓冲盐溶液（称取K₂HPO₄ 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸调pH至6.5，并加水稀释至1000mL）为流动相B，流动相梯度洗脱表：

高效液相色谱检测条件是：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.8～1.5毫升/分钟；检测波长245nm；以乙腈为流动相A，以磷酸缓冲盐溶液为流动相B，流动相梯度洗脱表：

 所得的色谱图中，供试品溶液的特征图谱中应呈现甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖4个特征峰，其应分别与相应的参照物峰的保留时间相一致，以其中任意一个参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间、相对峰面积，其相对保留时间应在规定值的±5～10%范围之内，相对峰面积可上下浮动10～30%。

云芝提取物真伪鉴别：

以半乳糖参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%范围之内，规定值为：0.5（甘露糖）、0.9（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、1.1（岩藻糖）；

以半乳糖参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定值的±30%范围之内，相对峰面积规定值为：0.6（甘露糖）、16.5（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、0.4（岩藻糖）。

云芝药材真伪鉴别：

以半乳糖参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%范围之内，规定值为：0.5（甘露糖）、0.9（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、1.1（岩藻糖）；

以半乳糖参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定值的±30%范围之内。相对峰面积规定值为：0.8（甘露糖）、22.5（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、0.3（岩藻糖）；

各特征峰存在，相对保留时间和相对峰面积符合要求，以此可评价云芝及含有云芝的制剂的真伪。

质量评价：

A、云芝药材含云芝多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖总量计，不得少于4.0%；

B、云芝提取物含云芝多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖总量计，不得少于25%。

本发明产生的积极效果是：本发明采用“提取粗多糖-多糖水解-衍生化-特征图谱-定量”质量控制模式，评价云芝药材及其制剂的质量，该质量控制和评价方法和现有对含多糖的药材和制剂的质量控制方法相比，更具有较强的专属性和创新性。在特征图谱的基础上，建立单糖组分定量测定，通过对单糖质量的控制可间接控制多糖的含量，以此质量控制方法评价云芝及含有云芝的制剂质量的优劣，该质量控制和评价方法具有较高精确度和新颖性。本发明思路和模式能为含多糖类中药及制剂提供专属性强、准确度高的质量控制和评价方法。

附图说明

图1 为标准单糖混合对照品（10种单糖）的UPLC-PDA色谱图；

图2 为标准单糖混合对照品（5种单糖）的HPLC-DAD色谱图；

图3 为空白溶剂的UPLC-PDA色谱图；

图4 为云芝药材中多糖的单糖组成的HPLC-DAD色谱图；

图5 为云芝药材中多糖的单糖组成的UPLC-PDA色谱图；

图6 为云芝提取物中多糖的单糖组成的HPLC-DAD色谱图；

图7 为云芝提取物中多糖的单糖组成的UPLC-PDA色谱图。

具体实施方式

本发明的制备方法和色谱条件以及质量控制和评价方法是经过大量的试验筛选得到的最佳方案，下面的实验例用于进一步说明本发明的技术方案和技术效果。

 实验例1 ：云芝药材及其制剂的特征图谱研究

  由于云芝多糖为一大类的杂多糖，结构复杂，目前仍没有专属性强的质量控制方法，无法分辨不同类型的多糖。而本发明的方法稳定，重现性好，专属性强，能区分不同类型的多糖，可用于控制评价云芝药材及其制剂的质量。试验结果如下：

1、参照溶液的制备

参照溶液的配制  准确称取标准品单糖适量，用水溶解配制成合适的单糖标准品液液。

参照溶液的衍生   量取上述参照溶液适量，加0.5mLNaOH（0.5M），0.8mLPMP甲醇液（0.5mol/L），混匀，于70℃衍生化反应45min，放冷后加盐酸（0.5mol/L）0.7mL（pH值为4），转移至10mL量瓶，并加水稀释至刻度，5000rpm离心10min，取上清液加等体积氯仿萃取，振荡、离心，弃去下层氯仿，重复3次，取上层水溶液，即得参照溶液。

2、供试品溶液制备

  称取云芝提取物制剂1.0g，加水5mL使溶解，再加入4倍量乙醇，摇匀，离心10min，分离沉淀，并用无水乙醇洗涤沉淀3次，沉淀加8mL水使溶解，再加稀硫酸（重量浓度为10%）7mL，摇匀，100-120℃加热回流水解5-6小时，放冷，用NaOH溶液调pH至中性，并转移至25mL量瓶，加水稀释至刻度，离心，精密量取上清液0.5mL，按“参照溶液的衍生”方法衍生，即得供试品溶液。

本发明对中药多糖提取的无水乙醇用量（1倍、2倍、3倍、4倍、5倍）进行了考察，结果选用4倍量的乙醇能将样品中游离的单糖有效的去除。

本发明对中药多糖水解的酸进行了考察，结果无明显差别，选用硫酸水解液更稳定，水解更完全。同时，对重量浓度为10%的稀硫酸的用量（5ml、7ml、9ml）和水解时间（4小时、7ml、9ml）进行了考察，以加入7 ml稀硫酸效果最佳。

本发明对衍生试剂PMP甲醇液的用量（0.6 mL、0.8 mL、1.0mL）和浓度（0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.8mol/L）进行考察，结果选用0.8 mL和0.5 mol/L的PMP甲醇液效果最佳。同时对衍生化的温度（60℃、70℃、80℃）和时间（30min、45min、60min）均进行了考察，结果选用70℃衍生化反应45min效果最佳。

3、空白溶液制备  取空白试剂按“供试品溶液制备”方法制备空白溶液。

4、色谱条件与系统适用性试验

仪器：waters UPLC, DAD检测器；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(Kinetex C₁₈ 100A，4.6×150mm，2.6μm)，以乙腈和磷酸盐（称取K₂HPO₄ 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸调pH至6.5，并加水稀释至1000mL）为流动相按下表进行梯度洗脱；柱温：35℃；检测波长：245nm；进样量：2.0μl；流速：0.9ml/min。

分别精密吸取参照溶液和样品溶液、空白溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪，在此条件下各单糖色谱峰达到基线分离，空白试剂无干扰。

5、流动相的选择

对流动相的梯度进行了考察，结果以选定的梯度最佳，能将10个单糖达到基线分离；并对流动相的磷酸盐和缓冲溶液进行选择，其中缓冲溶液pH对色谱峰影响较大，结果以选定的条件pH值为6.5最佳。

6、方法学验证

仪器精密度试验：结果供试品溶液以半乳糖为参照溶液，其各主要组成单糖相对保留时间RSD%分别为：

其各主要组成单糖相对峰面积RSD%分别为：

结果表明该仪器精密度较好。

供试液稳定性试验：结果供试品溶液24小时内，各主要组成单糖的相对保留时间RSD分别为：

结果表明主要组成单糖的相对保留时间稳定性较好。

各主要组成单糖的相对峰面积RSD分别为：

结果表明主要组成单糖的相对峰面积稳定性较好。

重复性试验：按该方法重复试验，各主要组成单糖的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为：

结果表明主要组成单糖的相对保留时间重复性较好。

结果表明主要组成单糖的相对峰面积重复性较好。

7、特征图谱确定

经过多批云芝提取物制剂的供试品特征图谱测定，其中供试品图谱中应呈现4个特征图谱，以半乳糖参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的5%范围之内，相对保留时间规定值为：0.5（峰1）、0.9（峰2）、1.00（峰3）、1.1（峰4）；并计算各特征峰与S峰的相对峰面积，应在规定值的30%范围之内，相对峰面积规定值为：0.6（甘露糖）、16.5（葡萄糖）、1.00（半乳糖）、0.4（岩藻糖）。

实验例2 ：云芝药材及其制剂中各单糖的含量测定研究

由于云芝药材及其制剂多糖含量测定多采用分光光度法和滴定法测定，其中多以葡萄糖为对照品，此类方法专属性差，准确度低，质量可控性差，本发明采用其主要的单糖组分的含量，控制中药多糖的质量，试验结果表明，在选定条件下分离效果好，各单糖的线性、稳定性、重复性、回收率等方法学考察均符合含量测定的要求，可用于控制中药多糖的质量，能有效的评价含中药多糖药材及制剂的质量。试验结果如下：

1、    溶液的制备

对照品溶液：准确称取标准品甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖单糖各适量，用水溶解配制成合适的单糖标准品液。

对照溶液的衍生：同实验例1 “参照溶液的衍生”。

供试品溶液制备：取实验例1“供试品溶液”。

2、     色谱条件与系统适用性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AQ C₁₈，4.6×250mm，5μm)，以乙腈和磷酸盐（称取K₂HPO₄ 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸调pH至6.5，并加水稀释至1000mL）为流动相按下表进行梯度洗脱；柱温：35℃；检测波长：245nm；进样量：10μl；流速：1.0ml/min。

3、    方法学验证

线性关系考察：以峰面积为纵坐标，单糖浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，结果如下：

试验表明，在表中浓度范围内，峰面积（A）与浓度C（mg/mL）均呈良好的线性关系。

仪器精密度试验：结果标准对照品溶液的各主要组成单糖峰面积RSD%分别为：

结果表明该仪器精密度较好。

供试液稳定性试验：结果供试品溶液24小时内，各主要组成单糖的峰面积RSD分别为：

结果表明供试品溶液稳定性较好。

重复性试验：按该方法重复试验，各主要组成单糖的含量分别为：

结果表明该方法重复性较好。

回收率试验：各主要组成单糖的平均回收率和RSD%分别为：

结果表明该方法回收率较好。

     因此，该方法能用于含多糖的中药及其制剂中单糖的含量测定。

4、     含量限量的确定

根据检测多批云芝提取物制剂的样品，并考虑生产实际情况，暂确定本品含云芝多糖以D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖、L-岩藻糖总量计，不得少于25%。

具体实施例如下：

实施例1  超高效液相色谱法测定云芝提取物制剂多糖的单糖

1、超高效液相色谱法测定云芝提取物制剂的特征图谱：照高效液相色谱法（中国药典2010版一部附录VI D）；

色谱条件  仪器：watersUPLC, DAD检测器;色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(Kinetex C₁₈ 100A，4.6×150mm，2.6μm)，以乙腈和磷酸盐（称取K₂HPO₄ 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸调pH至6.5，并加水稀释至1000mL）为流动相按下表进行梯度洗脱；柱温：35℃；检测波长：245nm；进样量：2.0μl；流速：0.9ml/min。

参照溶液的配制  准确称取半乳糖标准品单糖适量，用水溶解配制成合适的单糖标准品液。

参照溶液的衍生   量取上述参照溶液适量，加0.5mLNaOH（0.5M），0.8mLPMP甲醇液（0.5mol/L），混匀，于70℃衍生化反应45min，放冷后加盐酸（0.5mol/L）0.7mL（PH值为4），并加水稀释至5mL，5000rpm离心10min，取上清液加等体积氯仿萃取，振荡、离心，弃去下层氯仿，重复3次，取上层水溶液，即得参照溶液。

供试品溶液制备  称取云芝制剂0.5g，加水5mL使溶解，再加入4倍量乙醇，摇匀，离心10min，分离沉淀，并用无水乙醇洗涤沉淀3次，沉淀加8mL水使溶解，再加稀硫酸（浓度为10%）7mL，摇匀，加热回流水解6h，放冷，用NaOH溶液调pH至中性，并转移至25mL量瓶，加水稀释至刻度，离心，精密量取上清液0.5mL，按“参照溶液的衍生”方法衍生，即得供试品溶液

测定法  分别精密吸取参照溶液和样品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

供试品特征图谱中应呈现4个特征图谱，以半乳糖参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的5%范围之内，相对保留时间规定值为：0.5（甘露糖）、0.9（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、1.1（岩藻糖）；并计算各特征峰与S峰的相对峰面积，应在规定值的30%范围之内，相对峰面积规定值为：0.6（甘露糖）、16.5（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、0.4（岩藻糖）。结果见表1。

表1  云芝提取物UPLC特征图谱相对保留时间及相对峰面积

2、超高效液相色谱法测定云芝提取物制剂的单糖含量：照高效液相色谱法（中国药典2010版一部附录VI D）。 

色谱条件同实施例1项下的“色谱条件”。

混合对照溶液制备：取D-甘露糖对照品、D-葡萄糖对照品、半乳糖对照品、L-岩藻糖对照品适量，分别精密称定，加水溶解并稀释成每1ml含D-甘露糖0.5mg、D-葡萄糖10mg、半乳糖0.5mg、L-岩藻糖0.3mg的混合溶液，即得。

混合对照溶液的衍生：同实施例1 项下“参照溶液的衍生”。

供试品溶液制备：同实施例1项下“供试品溶液”

测定法  分别精密吸取混合对照溶液和供试品溶液各2μL，注入超高液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含云芝多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖总量计，本品含云芝多糖以D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖、L-岩藻糖总量计，不得少于25%。

表2  UPLC法测定云芝提取物中单糖含量

实施例2  高效液相色谱法测定云芝提取物制剂多糖的单糖

1、高效液相色谱法测定云芝提取物制剂的特征图谱：照高效液相色谱法（中国药典2010版一部附录VI D）

色谱条件  色谱条件与系统适用性试验  仪器： AgilentHPLC1100, 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AQ C₁₈，4.6×250mm，5μm)，以乙腈和磷酸盐（称取K₂HPO₄ 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸调pH至6.5，并加水稀释至1000mL）为流动相按下表进行梯度洗脱；柱温：35℃；检测波长：245nm；进样量：10μl；流速：1.0ml/min。

参照溶液的配制制备  同实施例1 项下“参照溶液”。

供试品溶液制备：同实施列1项下“供试品溶液”

测定法  分别精密吸取参照溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

供试品特征图谱中应呈现4个特征图谱，以半乳糖参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的5%范围之内，相对保留时间规定值为：0.5（甘露糖）、0.9（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、1.1（岩藻糖）；并计算各特征峰与S峰的相对峰面积，应在规定值的30%范围之内，相对峰面积规定值为：0.6（甘露糖）、16.5（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、0.4（岩藻糖）。

表3  云芝提取物HPLC特征图谱相对保留时间及相对峰面积

2、高效液相色谱法测定云芝提取物制剂的单糖含量：照高效液相色谱法（中国药典2010版一部附录VI D） 

 色谱条件同实施例2项下的“色谱条件”。

混合对照溶液制备：同实施例1项下的“混合对照溶液”。

供试品溶液制备：同实施例1项下“供试品溶液”

测定法  分别精密吸取混合对照溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含云芝多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖总量计，本品含云芝多糖以D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖、L-岩藻糖总量计，不得少于25%。

表4  HPLC法测定云芝提取物中单糖含量

实施例3  超高效液相色谱法测定云芝药材多糖的单糖

1、超高效液相色谱法测定云芝提取物制剂的特征图谱：照高效液相色谱法（中国药典2010版一部附录VI D）

色谱条件  同实施例1项下“色谱条件”

参照溶液的配制  同实施例1项下“参照溶液”。

供试品溶液制备  称取云芝药材5g，精密加水120mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取40ml,减压浓缩至干, 加水5mL使溶解，再加入4倍量无水乙醇，摇匀，离心10min，分离沉淀，并用无水乙醇洗涤沉淀3次，沉淀加8mL水使溶解，再加稀硫酸（浓度为10%）7mL，摇匀，加热回流水解6h，放冷，用NaOH溶液调pH至中性，并转移至25mL量瓶，加水稀释至刻度，离心，精密量取上清液0.5mL，按“参照溶液的衍生”方法衍生，即得供试品溶液。

测定法  分别精密吸取参照溶液和样品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

供试品特征图谱中应呈现4个特征图谱，以半乳糖参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的5%范围之内，相对保留时间规定值为：0.5（甘露糖）、0.9（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、1.1（岩藻糖）；并计算各特征峰与S峰的相对峰面积，应在规定值的30%范围之内，相对峰面积规定值为：0.8（甘露糖）、22.5（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、0.3（岩藻糖）。

表5  云芝药材UPLC特征图谱相对保留时间及相对峰面积

2、超高效液相色谱法测定云芝药材多糖水解的单糖含量：照高效液相色谱法（中国药典2010版一部附录VI D）。 

 色谱条件同实施例1项下的“色谱条件”。

混合对照溶液制备：同实施例1 项下“混合对照溶液”。 

供试品溶液制备：同实施列3项下“供试品溶液”。

测定法  分别精密吸取混合对照溶液和供试品溶液各2μL，注入超高液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含云芝多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖总量计，本品含云芝多糖以D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖、L-岩藻糖总量计，不得少于3%。

表6  UPLC法测定云芝药材中单糖含量

实施例4  高效液相色谱法测定云芝药材多糖的单糖

1、高效液相色谱法测定云芝药材的特征图谱：照高效液相色谱法（中国药典2010版一部附录VI D）

色谱条件  色谱条件与系统适用性试验  仪器： AgilentHPLC1100, 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AQ C₁₈，4.6×250mm，5μm)，以乙腈和磷酸盐（称取K₂HPO₄ 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸调pH至6.5，并加水稀释至1000mL）为流动相按下表进行梯度洗脱；柱温：35℃；检测波长：245nm；进样量：10μl；流速：1.0ml/min。

参照溶液的配制制备  同实施例1 项下“参照溶液”。

供试品溶液制备：同实施列3项下“供试品溶液”

测定法  分别精密吸取参照溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

供试品特征图谱中应呈现4个特征图谱，以半乳糖参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的5%范围之内，相对保留时间规定值为：0.45（甘露糖）、0.90（葡萄糖）、1.00（半乳糖）、1.16（岩藻糖）；并计算各特征峰与S峰的相对峰面积，应在规定值的±30%范围之内，相对峰面积规定值为：0.8（甘露糖）、22.5（葡萄糖）、1.0（半乳糖）、0.3（岩藻糖）。

表7  云芝药材HPLC特征图谱相对保留时间及相对峰面积

2、高效液相色谱法测定云芝药材的单糖含量：照高效液相色谱法（中国药典2010版一部附录VI D）

色谱条件同实施例2项下的“色谱条件”。

混合对照溶液制备：同实施例1项下的“混合对照溶液”。

供试品溶液制备：同实施例3项下“供试品溶液”

测定法  分别精密吸取混合对照溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含云芝多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖总量计，本品含云芝多糖以D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖、L-岩藻糖总量计，不得少于3%。

表8  HPLC法测定云芝药材中单糖含量