一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法

技术领域

本发明属于水稻遗传改良与生物技术应用，具体涉及一种利用野生稻资源创 制粳型水稻新种质的育种方法。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物，全球约站50%的人口以稻米为主粮，我国是 世界上最大的水稻生产和消费国，播种面积和产量占我国粮食作物的首位。水稻 在驯化为栽培稻和栽培稻现代育种过程中，由于选择压力和追求高产，造成许多 基因丢失，现代栽培品种的遗传基础日趋狭窄和单一，未来的育种工作能否取得 持续进展和突破，很大程度上取决于种质资源的利用。

野生稻在长期的自然选择过程中形成了无数特异优良性状和遗传多样性，是 水稻育种的宝贵遗传资源。Sun的研究发现，栽培稻的等位基因数约为野生稻的 60%，国际水稻所（IRRI）的研究表明，从野生稻中寻找抗性基因的机会比栽培 稻多约50倍，而且野生稻中还含有与产量性状有关的QTL基因，是水稻育种新 基因的主要来源之一。然而由于野栽杂交的不亲和性，且优劣性状连锁遗传、后 代疯狂分离，使得野生稻与栽培稻杂交育种难度大，时间长。

《水稻分子育种法—穗茎注射法》中公开了穗茎注射法导入外源DNA在黑麦 中获得转基因植株后,Croughan.T.P等立即在水稻上获得了外源质粒转基因植株 (1988,1989)。我国黄兴奇、周建林等报道用穗茎注射法将动旺谷、云南野生稻 及稗草等材料的总DNA导入水稻品种,获得了一批性状变异并稳定遗传的材料。 目前粳型水稻栽培品种的遗传基础狭窄、抗逆性差，野生稻与粳型栽培稻杂交存 在花期不遇、杂交不结实、杂交后代不育等问题，利用野生稻改良粳型水稻育种 难度大，时间长。进行野生稻的DNA导入粳型水稻栽培品种的技术研究，利用穗 颈节导入法，将江西普通野生稻的DNA片段导入宁夏水稻栽培品种，创新粳稻种 质和育种新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法。

本发明利穗茎节导入法，将普通野生稻（AA）DNA导入宁夏水稻栽培品种宁 粳16号和宁粳23号，创造粳稻育种新材料和新方法。宁夏水稻栽培品种宁粳16 号和宁粳23号，这两个品种由宁夏农林科学院农作物研究所利用常规育种方法 选育而成，分别于1995年和2002年通过宁夏自治区品种审定定名。

本发明一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，包括如下步 骤：

S1.野生稻基因组DNA的提取

（a）剪取孕穗期的叶片5g放入50ml研钵；

（b）向步骤（a）的研钵中加入液氮，每次加入50ml，总共3次到4次，快 速研磨成细粉，将细粉倒入50ml塑料离心管；

（c）向步骤（b）的离心管中加入预热提取缓冲液25ml及β–巯基乙醇 25μl，混匀后65℃水浴30min；

（d）向步骤（c）的离心管中加5mol/L醋酸钾溶液5ml,温和混匀，冰浴 20min；

（e）向步骤（d）的离心管中加入等体积氯仿和异戊醇混合液，氯仿与异戊 醇的体积比为24：1，在4℃4500×g离心15min；

（f）吸出步骤（e）中的上清液，加-20℃预冷的等体积异丙醇，静止3min -5min至出现白色DNA线团；

（g）挑起步骤（f）中DNA线团，70%乙醇洗涤，晾干，溶于0.1ml 1×SSC， 4℃保存；

S2.DNA导入

在孕穗后期，花粉发育到单核中晚期，外部形态表现为穗顶部离剑叶叶枕 2cm，利用微量注射器将DNA导入水稻穗颈节，从上向下呈45度角刺入穗下颈节 处，注入DNA液，DNA浓度为400μg/ml，缓冲液为添加了2mg/ml CaCl₂的0.1 ×SSC缓冲液，注射时间为上午9点至上午10点，每株导入10μl，重复导入3 次；待导入株成熟后分别收获导入穗，下年种植选择变异株；

S3.筛选性状具有变异的植株

将收获的导入穗按穗及对照穗进行无土育秧，当秧苗长至10cm左右，分别 按穗行单株植入田间，以受体材料作为对照筛选性状具有变异的植株，并将变异 株继续种植，直到后代性状稳定；

S4.对筛选的变异植株进行分子鉴定

将筛选的具有变异性状的植株利用SSR分子标记进行分子鉴定，以供、受体 为对照，鉴定变异植株中有无供体野生稻的DNA片段进入。

本发明中提取缓冲液100mmol/LTris-HCl pH8.0，500mmol/L NaCl，50mmol/L  EDTA pH8.0，质量浓度为1.5% SDS。

本发明的优点和有益效果如下：

本发明提供了一种切实可行的创新水稻种质的途径，获得具有野生稻性状的 导入后代材料。

本发明提供的育种方法可以将野生稻DNA导入水稻中，导入效率高达6.8%； 后代性状变异范围广，引起了水稻株高、叶片、叶色、叶角度、粒形、粒重、抗 病性等性状的变化；选择群体大，后代稳定快，缩短育种年限，适合粳型水稻种 质创新及育种需要，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡 依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。 实施例1

本实施例的实验材料为野生稻DNA、宁粳16号和宁粳23号。本实施例中 利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，包括以下步骤：

本发明一种利用野生稻资源创制粳型水稻新种质的育种方法，包括如下步 骤：

S1.野生稻基因组DNA的提取

（a）剪取孕穗期的叶片5g放入50ml研钵；

（b）向步骤（a）的研钵中加入液氮，每次加入50ml，总共3次到4次，快 速研磨成细粉，将细粉倒入50ml塑料离心管；

（c）向步骤（b）的离心管中加入预热提取缓冲液25ml及β–巯基乙醇 25μl，混匀后65℃水浴30min；提取缓冲液100mmol/L Tris-HCl pH8.0， 500mmol/L NaCl，50mmol/L EDTA pH8.0，质量浓度为1.5% SDS。

（d）向步骤（c）的离心管中加5mol/L醋酸钾溶液5ml,温和混匀，冰浴 20min；

（e）向步骤（d）的离心管中加入等体积氯仿和异戊醇混合液，氯仿与异戊 醇的体积比为24：1，在4℃4500×g离心15min；

（f）吸出步骤（e）中的上清液，加-20℃预冷的等体积异丙醇，静止3min -5min至出现白色DNA线团；

（g）挑起步骤（f）中DNA线团，70%乙醇洗涤，晾干，溶于0.1ml1×SSC， 4℃保存；

S2.DNA导入

在孕穗后期，花粉发育到单核中晚期，外部形态表现为穗顶部离剑叶叶枕 2cm，利用微量注射器将DNA导入水稻穗颈节，从上向下呈45度角刺入穗下颈节 处，注入DNA液，DNA浓度为400μg/ml，缓冲液为添加了2mg/ml CaCl₂的0.1 ×SSC缓冲液，注射时间为上午9点至上午10点，每株导入10μl，重复导入3 次；待导入株成熟后分别收获导入穗，下年种植选择变异株；

S3.筛选性状具有变异的植株

将收获的导入穗按穗及对照穗进行无土育秧，当秧苗长至10cm左右，分别 按穗行单株植入田间，以受体材料作为对照筛选性状具有变异的植株，并将变异 株继续种植，直到后代性状稳定。

对照试验：在孕穗后期，利用微量注射器将添加了2mg/ml CaCl₂的0.1×SSC 缓冲液导入宁粳16号和宁粳23号同一株的另一个穗作为对照。

统计宁粳16号和宁粳23号杂交后代水稻变异材料的农艺性状表现（见表1）， 变异材料的叶形及叶夹角（见表2），变异材料的粒长变化（见表3），变异材料 的粒宽变化（见表4），野生稻DNA导入宁夏水稻品种后的抗病性调查（见表5）， 统计抗病性导入后代与对照的比较（见表6）。

S4.对筛选的变异植株进行分子鉴定

将筛选的具有变异性状的植株利用SSR分子标记进行分子鉴定，以供、受体 为对照，鉴定变异植株中有无供体野生稻的DNA片段进入。

表1、变异材料的农艺性状表现

表2、变异材料的叶形及叶夹角

表3 变异材料的粒长变化

表4 变异材料的粒宽变化

表5 野生稻DNA导入宁夏水稻品种后的抗病性调查

表6 抗病性导入后代与对照的比较

由上述的表1至表6中统计数据可知：

（1）D2代导入体发生变异的广泛性

共种植D2代导入体材料36份，272行，4080穴，筛选变异株系163株，总 变异率4.0%。其中，“宁粳16号”D2代导入体种植183行，2745穴，筛选变异 株系128份，变异率4.7%；“宁粳23号”D2代导入体种植89行，1335穴，筛选 变异株系35份，变异率2.6%。仅从两个材料的变异情况来看，外源DNA导入后， 其后代的变异材料间存在着一定差异，变异性状包括抗病性、育性、株高、叶型、 叶色、叶角度、穗型、粒型等（见表1、表2、表3、表4）。其中，有6份后代 材料对叶瘟、穗茎瘟和白叶枯病均表现抗性。

对25份典型变异材料进行考种，结果表明（见表1）：变异发生部位及其广 泛。包括株高、叶片、叶色、叶角度、粒形、粒重等形态均有变异株系产生。进 一步分析考种资料可以看出（见表1）：产生株高变异的株系有9份，占考种样的 35%，其中“宁粳16”D2代导入体6份，占24%，“宁粳23号”D2代导入体3份， 占12%；发生叶形变异的有19份，占76%，其中“宁粳16号”导入体11份，占 44%，“宁粳23号”导入体7份，占28%；发生穗型变异的有12份，占考种样的 48%，两份受体材料各占24%；在粒型上发生变异的有22份，占考种样的88%， 其中“宁粳16号”导入体15份，占60%，“宁粳23号”导入体7份，占28%； 甚至出现类似白皮稻的粒型，个别变异有落粒现象，另有种芒产生，程度不同； 还出现机率很低的嵌合叶和高度不育穗。

（2）外源DNA导入D2代在叶片类型上的表现

从田间调查结果来看，外源DNA导入水稻后，在D2代群体中出现叶色、叶 长、叶宽、叶角度等变异现象。以表2为例，对19份典型变异株系进行检测。 结果表明，“宁粳16号”D2代群体中有11个株系在叶片长度上发生变异，且 04D2—14—2、04D2—14—1和04D2—3—6株系显著水平在0.01水平上。在“宁 粳23号”D2代群体中有8个株系叶片长度发生变异，且04D2—22—2材料叶片 长度变异达极显著水平。

从表2还可看出，在D2代群体中2个导入体材料发生叶片宽度变异的株系 各7份。且04D2—14—1和04D2—20—1株系叶片变异达到0.01极显著水平。 在叶片变异株系中优以叶片角度变异最为明显（见表2）。在“宁粳16号”导入 体中最小叶角度仅有16℃，而最大叶角度则达到70℃，对照CK1为27℃。叶角 度变幅在16℃--70℃之间。“宁粳23号”导入体有8个株系叶角度发生变异。叶 角度最小的株系是04D2—20—3，叶角度仅为9.6℃。叶角度最大的株系是04D2 —20—1，叶角度为64℃，对照CK2叶角度为11.6℃。变幅在9.6℃--64.0℃。

（3）外源DNA导入D2代在粒型上的表现

外源DNA导入后在D2代群体后，变异发生部位非常广泛。在粒型上同样也 表现出明显的差异（见表3）。在“宁粳16号D2群体中有17个株系在粒型上发 生变异，其中有4个株系粒型变长，占23.5%，材料名称分别为：04D2—7—1、 04D2—10—3—2、04D2—14—3—1、04D2—3—7，依次为：7.99㎜、7.98㎜、 7.90㎜、7.88㎜，占粒型变异的23.5%。有8个株系粒长较对照明显变小，占 47.1%，其中，04D2—3—5株系粒长仅为6.75㎜，千粒重24.9g（对照25.6g）， 粒长变幅在6.75㎜—7.99㎜之间。在“宁粳23号”D2代群体中有4个株系发 生粒型变异，仅有04D2—19—1--①株系粒型显著变长，粒长为8.5㎜，对照CK2 为7.9㎜。有3个株系材料粒型显著变小，材料名称分别为04D2—20—1、04D2 —19—1—2、04D2—22—2—1，粒长变幅在7.12㎜—8.5㎜之间。从表4方差分 析结果同样可以看到相同的结果。

对“宁粳16号”D2代18个株系进行粒型检测。结果表明：04D2—8—1株 系籽粒宽度大于对照，04D2—10—3--②株系籽粒宽度为3.26㎜与对照相同，剩 余16份材料籽粒宽度均小于对照。说明仅从籽粒宽度而言，外源DNA导入后， 有80.9%的籽粒变窄，5.6%的籽粒变宽。在“宁粳23号”D2的群体中有5个株 系籽粒宽度发生变异，其中籽粒变宽的株系有4个，占80%；籽粒变窄的株系有 1个，占20%（见表5）。两个不同材料的D2群体结果截然相反。说明材料间对外 源DNA的感受程度存在显著差异。

（4）外源DNA导入后D1代与D2代抗病性比较

表5中收集了2003年和2004年两年参加抗病鉴定结果。参加鉴定材料36 份，两年鉴定结果，同一病级的材料4份，材料名称分别为：04D2—2、04D2—5、 04D2—10、04D2-22（见表5、表6），且这几个材料抗病性都比其受体对照强。 其余材料两年的抗病结果均有不同程度的差异。

变异植株的分子鉴定

对21份导入后代进行SSR分子鉴定，从图看出：21分材料中，有17份材 料能扩增出供体野生稻的DNA条带，证明其就是野生稻的后代；只有4份材料没 有扩增出供体野生稻特有的DNA条带，但都有受体DNA条带的减少，可能是由于 野生稻DNA片段整合到水稻基因组中该引物结合位点或附近,使原有的结合位点 破坏而造成该引物在这个区段扩增不出带。

按本发明提供的育种方法在水稻中导入野生稻DNA后，引起了水稻株高、 叶片、叶色、叶角度、粒形、粒重等性状的变化。如：（1）受体宁粳16号的株 高为105.6cm，其导入后代材料中有4份植株04D2-4-3-1、04D2-4-3-2、 04D2-10-2、04D2-15-1明显变矮，株高仅为93cm—94cm，导入后代材料中有1 份植株04D2-14-1明显变高，株高达117cm；受体宁粳23号的株高为101.4cm， 其导入后代材料中有2份植株04D2-19-1、04D2-19-2明显变矮，株高仅为94cm， 导入后代材料中有1份植株04D2-20-1明显变高，株高达126cm；（2）受体宁粳 16号的穗长为17.3cm，穗粒数为140.9粒，其导入后代材料04D2-4-3-1穗子 明显变长，为23.5cm，穗粒数明显变多，为204粒；受体宁粳23号的号的穗粒 数为178.1粒，其导入后代材料04D2-20-2穗子明显变小，穗粒数明显变少，只 有89粒，而04D2-20-1的穗长和穗粒数虽然变化不大，但其不育籽粒名显增加， 结实籽粒仅为138粒，而空秕籽粒达103粒；（3）受体宁粳16号的千粒重为25.6 克，其导入后代材料04D2-7-1和04D2-10-3-1籽粒明显变大，千粒重分别为30.7 和30.9克；受体宁粳23号的号的千粒重为26.8克，其导入后代材料04D2-19-1 和04D2-22-1籽粒明显变大，千粒重分别为37.8和32.6克；（4）还有一些导入 后代材料的籽粒长度、宽度，叶夹角等也发生了明显的改变（见表2、表3、表4）。 本发明提供的将野生稻DNA导入水稻的导入效率高达6.8%、变异广泛，选择群 体大，缩短育种年限，适合育种需要，且稳定快，导入的第3代就稳定了，本发 明提供的育种方法具有高效、性状变异广泛、后代稳定快等优点，创制的新种质 可以作为粳稻育种的亲本材料利用或经定向选育后成为新品种应用于水稻生产。