源于广西巴马长寿村的鼠李糖乳杆菌在辅助降血脂方面的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及源于广西巴马长寿村的益生菌鼠李糖乳杆菌hsryfm1301及在辅助降血脂功能方面的应用。 

技术背景

随着人们生活水平的提高，高血脂及其引发的心血管疾病发病率也逐年升高，药物作为治疗这些疾病的主要方式，具有较大的副作用。乳酸菌是人体肠道中重要的益生菌，对维持宿主肠道的微生态平衡和提高免疫系统功能起着至关重要的作用，而在一些长寿之乡如高加索山区和地中海沿岸的人们常饮用自制的酸牛奶，极少患有由高血脂引发的心血管及肥胖等疾病；近年来，大量的研究也表明，益生乳酸菌及其发酵制品具有降血脂的效果。本发明对筛选出的体外具有降胆固醇及分解甘油三酯能力的鼠李糖乳杆菌hsryfm1301进行体内辅助降血脂功能研究，为研发具有辅助降血脂功能的发酵乳制品打下基础。 

发明内容

本发明目的在于提供鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)hsryfm1301在降血糖功能方面的应用。 

本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)hsryfm1301，该菌株具有体内降胆固醇及分解甘油三酯能力，已于2013年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号是CGMCC NO.8545。 

本发明公开了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC NO.8545在制备具有辅助降血脂功能的发酵乳中的应用。 

公开了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC NO.8545在制备具有辅助降血脂功能的发酵乳饮料中的应用。 

公开了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC NO.8545在制备具有辅助降血脂功能的活菌制剂中的应用。 

经动物试验证明，鼠李糖乳杆菌CGMCC NO.8545连续灌胃7天后，大鼠生长状态正常、毛色光滑、精神活跃，菌株不发生肝肠易位等现象；对实验性大鼠辅助降血脂功能特性研究，表明该菌株及其发酵乳能够降低大鼠肝脏脂肪的堆积、降低血清低密度脂蛋白作用，表明该菌株具有辅助降血脂功能。 

具体实施方式

实施例一：菌株筛选和鉴定 

相关培养基及试剂配方 

(1)MRS-THIO培养基：蛋白胨10.0g，三水醋酸钠3.0g，牛肉膏8.0g，柠檬酸三铵2.0g，酵母浸膏4.0g，七水硫酸镁0.2g，葡萄糖10.0g，一水硫酸锰0.04g，吐温-801.0mL，磷酸氢二钾2.0g，硫乙醇酸钠2.0g，调pH至6.4，121℃灭菌15min，冷却备用。 

(3)胆固醇培养基：胆固醇0.10g、吐温-801.0mL、蔗糖酯0.10g、冰乙酸5.0mL，冰浴超声破碎备用。将上述制备的胆固醇胶束溶液加入到MRS液体培养基中，使培养基中胆固醇的终浓度为0.10mg/mL。并调pH至6.50±0.20，121℃灭菌15min，冷却备用。 

(4)甘油三酯培养基：将2％的聚乙烯醇水溶液与植物油按3:1的比例混合，用高速组织捣碎机处理后作为甘油三酯的来源。将上述制备的植物油乳化液加入到MRS液体培养基中，调pH至6.50±0.20，121℃ 灭菌15min，冷却备用。 

(5)人工胃液的配制：准确量取20.0mL1mol/L的HCl，用去离子水将pH分别调至2.0、3.0，加入NaCl使其质量分数达到0.2％，每100.0mL溶液中加入1.0g胃蛋白酶，充分溶解后，用0.22μm微孔滤膜在无菌操作台中过滤除菌，于无菌试剂瓶中低温保藏备用。 

(6)硫酸铁铵显色剂：称取4.46g硫酸铁铵溶解于100.0mL85％磷酸中，取10.0mL溶液用浓硫酸定容至100.0mL，放入硅胶干燥皿中备用。 

具体步骤： 

1样品采集 

采集广西巴马长寿村中长寿人群及其家族人群样品，加入1mL灭菌液体石蜡油密封后，迅速置于冰盒内，分离样品中的乳酸菌。 

2乳酸菌的分离 

将采集的样品经梯度稀释后，分别接种于MRS固体培养基、LBS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取平板上的典型菌落，划线分离得到纯菌落。挑取各平板上的纯菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h后，4℃冰箱冷藏备用或冻干保藏。 

3乳酸菌的生理生化试验 

对分离到的乳酸菌进行革兰氏染色，于显微镜下观察菌体形态，并进行接触酶、运动性、硝酸盐还原及吲哚等生理生化试验。 

结果表明，从采集的15份样品中分离获得217株菌株，通过生理生化试验发现156株菌革兰氏染色为阳性，形状为杆状、短杆状或球状，在15℃及45℃环境下均能生长，接触酶、运动性、硝酸盐还原、吲哚、产H2S及明胶液化试验均为阴性，所以将156株分离细菌初步鉴定为乳酸菌。 

4乳酸菌分解胆固醇及甘油三酯能力的测定 

将活化好的乳酸菌按3％的接种量接种至MRS-THIO胆固醇培养基中，37℃培养24h后，取培养液0.2mL，加入1.0mL无水乙醇振荡混匀1min，再加入3.8mL无水乙醇振荡混匀1min，静置5min后再次振荡混匀，4000r/min离心10min，取2.0mL上清液用于胆固醇的测定，以未接菌的胆固醇培养基作为对照。胆固醇的测定采用硫酸铁铵比色法，参照GB/T5009.128-2003食品中胆固醇的测定方法，测定其OD560nm值，胆固醇的分解率按下式计算： 

利用长春汇力生物技术有限公司的甘油三酯试剂盒测定培养基中甘油三酯的含量，乳酸菌的甘油三酯分解率按下式计算： 

甘油三酯分解率％＝(总甘油三酯含量-残留值)/总甘油三酯含量×100％ 

156株乳酸菌分解胆固醇及甘油三酯的能力见表1。 

表1乳酸菌分解胆固醇及甘油三酯的能力 

[0032] 

结果表明，分离获得的156株乳酸菌中，30株乳酸菌分解胆固醇及甘油三脂的能力较强；其中胆固醇及甘油三酯降解率分别大于30.35％和5.33％的菌株共16株；本发明菌株hsryfm1301的胆固醇及甘油三酯的降解率最高，分别为61.90％和37.22％。 

5乳酸菌耐酸耐胆盐能力的测定 

将活化好的乳酸菌制成菌悬液，取1.0mL的菌悬液接种至9.0mL的pH3.0人工胃液中，37℃培养，分别在0h和3h用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)。 

存活率(％)＝3h的活菌数/0h的活菌数×100％ 

将活化好的乳酸菌按3％的接种量分别接种至含0.00％(即空白)、0.10％、0.30％及0.50％胆盐的MRS培养基中，37℃培养，分别在0h和3h用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)。 

存活率(％)＝3h的活菌数/0h的活菌数×100％ 

16株乳酸菌的耐酸耐胆盐能力见表2。 

表2乳酸菌的耐酸耐胆盐能力 

结果表明，16株乳酸菌在pH为3.0的人工胃液及胆盐浓度为0.10％、0.30％、0.50％的MRS培养基中培养3h存活率均分别大于12.00％、12.50％、10.00％及8.00％；其中在pH为3.0的人工胃液中存活率大于20％，且在0.10％、0.30％、0.50％的胆盐的MRS培养基中存活率均大于8.50％的菌株共8株；其中本发明菌株hsryfm1301的耐酸耐胆盐能力较强，在pH为3.0的人工胃液及胆盐浓度为0.10％、0.30％及0.50％的MRS培养基中存活率分别为71.43％、66.37％、64.55％及19.12％。 

6乳酸菌抑菌能力的测定 

采用牛津杯法检测8株乳酸菌的抑菌能力。将致病性大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌活化24h，取0.2mL致病菌菌液均匀涂布于LB培养基平板上，涂布后以平板无可见水滴为准，并用镊子将3只无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，吸取0.2mL乳酸菌菌悬液于牛津杯中。将平皿置于3-4℃冰箱扩散24h，然后37℃培养24h，测量抑菌圈直径，结果见表3。 

表3乳酸菌的抑菌性 

由表3发现，8株乳酸菌对肠道致病菌有一定的抑制能力，其中对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌三种致病菌的抑菌圈均大于8.65mm的菌株共4株；菌株hsryfm1301对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力较强，抑菌圈直径分别为14.67mm、11.35mm及10.67mm。 

7乳酸菌抗生素敏感试验 

使用药敏纸片法检测菌株对抗生素的敏感性，抗生素及纸片浓度见表4。 

吸取1.0mL菌悬液加入到15.0mL灭菌并融化后的MRS固体培养基中(40-50℃)，于漩涡振荡混合器上混和均匀后迅速倾注到100mm×H20mm无菌平皿中，摇匀，待平板凝固后贴放标准药物纸片，在37℃恒温培养箱中倒置培养，48h后测量并记录抑菌圈直径，根据CLSI制定的《抗菌药物敏感性试验执行标准》(2010版)判定乳酸菌对抗生素的耐药性，结果见表4。 

表4乳酸菌的耐药性 

注:R为耐药，M为中度敏感，S为敏感。 

由表4发现，4株乳酸菌对青霉素G、诺氟沙星、环丙沙星有一定的耐药性，对其他抗生素有不同程度的敏感性；菌株hsryfm1301对头孢唑啉、头孢拉定、四环素、氯霉利及福平素五种抗生素均敏感，对链霉素中度敏感，耐药性较低于其他菌株。 

8乳酸菌的鉴定 

综合以上试验结果发现，本发明菌株hsryfm1301具有较强的分解胆固醇及甘油三酯能力，同时其耐酸耐胆盐能力也强于其他菌株，其对肠道致病菌的抑菌能力较强且耐药性较低。因此经比较，菌株hsryfm1301综合性能最为优异。通过革兰氏染色发现，本发明菌株hsryfm1301形状为短杆状。 

(1)糖发酵试验 

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，对菌株hsryfm1301进行糖发酵试验，结果如表5所示。 

表5hsryfm1301生理生化试验结果 

注:"+"90％菌株为阳性；"-"90％菌株为阴性。 

由表5发现，本发明菌株hsryfm1301为鼠李糖乳杆菌，它能利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、纤维二糖、松三糖，不能利用棉籽糖和木糖。 

(2)API鉴定 

利用API50CHL系列鉴定试剂条对菌株hsryfm1301进行鉴定，鉴定结果见表6。 

表6hsryfm1301的API50CHL系统鉴定结果 

[0069] 

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性 

由表6及图3可知，本发明菌株hsryfm1301为鼠李糖乳杆菌，鉴定率为99.9％。 

(3)菌株16S rDNA测序鉴定 

以菌株hsryfm1301基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用通用的16S rDNA引物进行PCR扩增。电泳检测扩增产物后，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序得到的序列(SEQ ID NO.1)与GenBank数据库中的序列进行比对分析，结果见表7。 

表716S rDNA比对结果 

结合生理生化试验、API试剂条鉴定及16S rDNA测序鉴定，将本发明菌株hsryfm1301鉴定为鼠李糖乳杆菌。 

实施例二：体内的辅助降血脂功效实验 

利用动物试验来研究hsryfm1301及其发酵乳在体内的辅助降血脂效果。通过饲喂高脂饲料建立高脂大鼠模型，灌胃hsryfm1301及其发酵乳后，测定大鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量以及肝脏中胆固醇、甘油三酯含量和粪便中胆固醇、甘油三酯、胆汁酸含量，从而检测hsryfm1301的体内辅助降血脂功效。 

1试验动物及分组 

体重约为120-140g的SPF级Wistar雄性大鼠52只，在23±1℃、干燥、清洁、通风良好的室内条件下喂养，基础饲料(面粉20％、米粉10％、玉米20％、鼓皮26％、豆料20％、鱼粉2％、骨粉2％)适应性饲养1周后，按各组间平均体重无显著差异重新分为8组(见表1)。 

安全评价组及对照组饲喂基础饲料，其余六组饲喂高脂饲料(猪油10％、胆固醇1％、胆酸钠0.2％、基础饲料78.8％)。通过饲喂高脂饲料4周来建立高脂模型，高脂模型建立后，每天上午按表8所述方式对大鼠进行灌胃，并观察大鼠的生长及死亡情况。每组灌胃量按2.0mL/100g进行，每周称量体重1次，以便调整灌胃量。 

表8动物试验分组 

2灌胃液的制备 

将保藏的hsryfm1301活化后，按3％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养24小时后，4000×g离心10分钟收集菌体。 

hsryfm1301脱脂乳悬浮液：用10％的脱脂乳悬浮收集的菌体并进行菌落计数，饲喂前用10％脱脂乳稀释至1.0×10⁹CFU/mL。 

hsryfm1301脱脂发酵乳：10％的脱脂乳中加入6％的糖，预热至60-65℃，12-20Mpa均质，95℃/5分钟热处理后，冷却至42-45℃，按3％接种量接种hsryfm1301，42℃发酵至凝乳，置于4℃贮藏。 

药物组灌胃液的制备：取5粒血脂康(北京北大维信生物科技有限公司，0.3g/粒)溶于50mL生理盐水，现用现配。 

3菌株安全性评价 

将安全评价组大鼠饲喂到180g左右用于试验，灌喂悬浮10⁹CFU/mL hsryfm1301的10％脱脂乳，按体重灌胃2mL/100g(相当于600mL/60kg标准体重人用量的20倍)，每天2次，间隔12小时，连续灌喂7d，观察1周，记录各组大鼠的生长及死亡情况。 

灌胃含10⁹CFU/mL hsryfm1301的脱脂乳悬浮液后发现，大鼠生长状态正常、毛色光滑、精神活跃；对大鼠的肝脏悬浮液进行乳酸菌检测，37℃培养48小时后未发现乳酸菌，表明hsryfm1301在大鼠体内不会发生肝肠易位现象，对大鼠是安全的。 

4高脂模型的建立 

饲喂4周后，从高脂模型组和对照组中分别随机抽取3只大鼠，同时禁食和水12小时，眼球取血，血液3000×g离心10分钟分离血清，利用日立7020全自动生化分析仪及试剂盒测定血清的TC、TG、HDL-C及LDL-C含量，结果见表9。 

表9对照组及模型组大鼠的血脂(n＝3x±sd) 

注：abc同列比较，不同字母表示具有差异性(P＜0.05) 

由表9发现，高脂模型组大鼠血清中的TC(总蛋白固醇)、TG(总三油甘酯)含量显著高于对照组大鼠血清中的TC、TG含量(p<0.05)，表明高脂大鼠模型建模成功；对照组大鼠血清中的HDL-C(高密度脂蛋白)及LDL-C(低密度脂蛋白)含量低于高脂模型组，但无显著性差异(p>0.05)。 

5指标的测定 

5.1脏器指标的测定 

取大鼠肝脏、心脏、脾、肾脏及腹腔、睾丸和肾周脂肪并称重，按下公式计算： 

(肝、心、脾、肾、脂肪)指数＝(肝、心、脾、肾、脂肪)重量/体重×100 

大鼠的肝、心、脾、肾与体脂指数如表10所示。 

表10hsryfm1301对大鼠体脂等指数的影响(n＝8x±sd) 

由表10可知，高脂模型组大鼠的肝指数显著高于对照组(p<0.05)，说明高脂饲料的饲喂使得脂肪在大鼠肝脏上堆积，造成了大鼠肝脏重量的增加；对照组大鼠的体脂指数显著低于其他各组(p<0.05)，表明高脂饲料的饲喂增加了大鼠体内的脂肪含量；hsryfm1301组及其发酵乳组大鼠的肝指数显著低于高脂模型组(p<0.05)，表明hsryfm1301及其发酵乳能够降低大鼠肝脏脂肪的堆积；hsryfm1301组及其发酵乳组大鼠的体脂指数低于高脂模型组，但无显著性差异(p>0.05)；各组间的心指数、脾指数及肾指数也无显著性差异(p>0.05)。 

5.2血清血脂的测定 

灌喂4周后，试验各组同时禁食和水12小时，眼球取血，测定各组大鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量，结果见表11。 

表11hsryfm1301对大鼠血清血脂的影响(n＝8x±sd) 

由表11发现，hsryfm1301组及其发酵乳组大鼠血清中的TC、TG、HDL-C含量显著低于高脂模型组大鼠血清中TC、TG、HDL-C含量(p<0.05)，hsryfm1301发酵乳组血清中的LDL-C含量也显著低于高脂模型组(p<0.05)，表明hsryfm1301及其发酵乳对高血脂症大鼠有显著的降血脂作用；药物组大鼠血清中的TC、TG、HDL-C含量显著低于高脂模型组大鼠血清中的TC、TG、HDL-C含量(p<0.05)，表明药物具有降血脂效果。 

5.3肝脏中TC、TG含量的测定 

取0.25g大鼠肝脏左叶，加入3mL氯仿：甲醇(2:1)混合液于研磨器中进行研磨，振荡混匀，用甲醇与氯仿(2:1)混合液定容至5mL，45℃水浴1小时，10000×g离心10分钟，弃上层液，收集氯仿层液体到新的EP管中，加0.6mL生理盐水，10000×g离心10分钟。再重复一次上述步骤后，收集氯仿层液体，置通 风橱吹干，加入异丙醇：Triton-100混合液(9:1)80μL复溶，漩涡震荡2分钟，加120μL蒸馏水，再漩涡震荡2分钟，使之充分溶解，按照试剂盒测定TC、TG含量，结果见表12。 

表12hsryfm1301对大鼠肝脏中TC、TG含量的影响(n＝8x±sd) 

由表12可知，高脂模型组大鼠肝脏中的TC、TG含量显著高于对照组(p<0.05)，表明饲喂高脂饲料使得胆固醇及甘油三酯在大鼠肝脏内大量储存；hsryfm1301组及其发酵乳组大鼠肝脏中的TC含量显著低于高脂模型组(p<0.05)，hsryfm1301发酵乳组大鼠肝脏中的TG含量显著低于高脂模型组(p<0.05)，表明hsryfm1301及其发酵乳可以显著降低大鼠肝脏中的TC、TG含量；药物组并未显著降低试验大鼠肝脏中的TC、TG含量(p>0.05)。 

5.4大鼠粪便中TC、TG及胆汁酸(TBA)含量的测定 

在试验的最后3d，每天随机收集各试验组的粪便，用真空冷冻机冷冻干燥后，取0.25g于研钵中磨细，按照肝脏中TC、TG含量的测定方法测定粪便中TC、TG的含量，结果见表13。 

称取0.05g冷冻干燥后的粪便，研磨成粉末，加入3mL无水乙醇充分振荡，70℃水浴15分钟，边水浴边振荡，3000×g离心5分钟，将上清液移至EP管中。按上述方法用无水乙醇将沉淀重提两次，合并上清液，80℃水浴将上清液中的乙醇蒸干，剩余物中加入3mL石油醚充分振荡，祛除脂肪和中性固醇，3000×g离心5分钟，弃上清液。重复洗涤两次后，剩余沉淀中加入1mL含2％TritonX-100的乙醇，振荡使沉淀充分溶解，80℃水浴蒸干乙醇，加入1mL蒸馏水溶解沉淀，即为提取的粪便总胆汁酸溶液，利用TBA试剂盒测定提取液中TBA含量，结果见表13。 

表13hsryfm1301对大鼠粪便TC、TG及TBA的影响(n＝3x±sd) 

由表13发现，hsryfm1301组及其发酵乳组、药物组大鼠粪便中TC的含量显著高于高脂模型组(p<0.05)，hsryfm1301组及药物组大鼠粪便中TG的含量显著高于高脂模型组(p<0.05)，表明hsryfm1301及其发酵乳和药物能通过增加大鼠粪便中TC、TG的排泄来降低大鼠血脂；hsryfm1301组及其发酵乳组大鼠粪便中TBA的含量也显著高于高脂模型组(p<0.05)，表明hsryfm1301及其发酵乳也可以通过促进体内胆汁酸的排泄来降低大鼠血脂。 

应用实施例 

1含本发明菌株发酵乳的制作方法 

加入6.5％的糖于标准化后的原料乳，预热至60-65℃，12-20Mpa均质，95℃热处理5min，冷却至45℃左右，按3.5％的接种量接种鼠李糖乳杆菌hsryfm1301与嗜热链球菌grx02(菌株保藏号：CGMCC No：2525)混合制备的发酵剂，42℃发酵pH至4.2-4.5，置于4℃贮藏。 

2含本发明菌株乳酸菌饮料的制作方法 

将375kg的复原脱脂乳(含11.5％的脱脂乳粉)95℃热处理10min，冷却至37-40℃；按3.5％的接种量接种鼠李糖乳杆菌hsryfm1301，37℃条件下发酵18-22h，终点酸度控制在165-175°T；将625kg的糖与稳定剂的混合物(含0.8％-1.35％的果胶和12.5％-14.8％的蔗糖)于90-115℃的条件下杀菌10s，然后与上述脱脂发酵乳混合，20-25Mpa均质，冷却至20℃后无菌灌装，置于4℃贮藏。 

3本发明菌株粉末状产品的制作方法 

将鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳冷冻干燥后(水分含量为2.5％-3.5％)压碎成粉末状，在粉末状产品中加入低聚果糖、奶粉等制成片块状或粉末状产品。 

以上本发明菌株发酵的产物都具有辅助降血脂的作用，该菌株的发酵乳及发酵乳制成的乳酸菌饮料、粉末状产品，都具有辅助降血脂的功效。