稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的制备方法及其生物成像应用

技术领域

本发明属于纳米生物材料技术领域，具体涉及一种稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的制备及其生物成像应用。

背景技术

近些年来，荧光成像已经成为光学成像技术中的研究热点，这是由于其具有灵敏度高、从细胞到生物组织无损伤观察等优点。而在其中，稀土掺杂上转换发光纳米材料作为一种新兴荧光材料引起了人们的广泛关注，这是因为它通常是采用低能光激发（通常是近红外光980 nm），发射出高能光（红光、绿光、近红外光800 nm），这些优点可以消除生物背景荧光干扰以及低的信噪比，使其可以广泛运用在一系列生物成像领域，如细胞成像、小动物成像、CT成像等。

尽管近红外光在生物组织有着深的穿透深度，但它的热效应却不容忽视，因此发展多种模式激发的稀土掺杂上转换发光纳米荧光材料是非常有必要的。它在不同波长光激发下得到多种波段的发射光并在不同的生物体系中得到多功能应用。在多模式荧光材料中研究较为广泛的是上下转换多模式成像，但是大部分研究是集中在新型基质中掺杂不同的稀土离子或者基质与荧光材料通过简单的混合，这会造成产物重复性差、粒径大、稳定性不好从而限制了在生物成像领域的应用。

发明内容

针对上述方法的不足，本发明的目的在于提供一种具有上/下转换发光多功能材料的制备方法并应用在上、下转换多模式生物成像，为实现上述目的，本发明所提供的技术方案包括以下步骤：

在油溶性稀土上转换纳米晶表面包覆一层介孔硅，并分散在甲苯中形成第一分散液，同时将二苯甲酰甲烷改性后的硅氧烷分散在甲苯中形成第二分散液；然后，将稀土配合物溶解在乙醇中，形成第三分散液；将第一、第二分散液混合，回流、离心、洗涤、重新分散在乙醇中，生成二苯甲酰甲烷功能化的上转换发光介孔材料，形成第四分散液；将第三、第四分散液混合，回流、离心、洗涤、重新分散在乙醇中，制得稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料。

第一分散液的制备具体包括以下步骤：首先，预备10～15 mg 粒径为30~35 nm亲油性NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄分散在环己烷中，形成第一混合液；将0.1 g CTAB和水混合升温到60 °C溶解，冷却到室温后搅拌除去环己烷，形成第二混合液，将第一、第二混合液升温至70 °C，温度稳定后加入200 μL TEOS，反应2 h，离心洗涤，产物分散在乙醇中得到第三混合液；向第三混合液中加入0.3 g硝酸铵乙醇溶液，升温至60 °C除去CTAB，离心洗涤，产物分散在甲苯中，得到第一分散液；

第四分散液的制备具体包括以下步骤：将0.2 ~ 0.4 g二苯甲酰甲烷改性后的硅氧烷分散在20 mL甲苯中形成第二分散液，并与第一分散液混合，回流、离心、洗涤，重新分散在乙醇中，得到二苯甲酰甲烷功能化的上转换发光介孔材料，即第四分散液。

将所得0.3 ~ 0.4 g稀土配合物分散在20 ml乙醇中，得到第三分散液，将第三和第四分散液混合，回流、离心、洗涤，分散在乙醇中，即得到稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料。

稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的生物成像应用，稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料用于细胞成像具体包括以下步骤：

（1）预备10 ~15 mg稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料，5 mL去离子水，96孔板培养的Hela细胞；

（2）将预备的纳米介孔材料与去离子水混合，超声10分钟分散，形成第五分散液；

（3）取第五分散液不同的量加入96孔板中，随后置于恒温恒湿机箱中培养2小时，在激光共聚焦显微镜下观察。

稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料用于活体成像具体包括以下步骤：

（1）预备4 mg稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料，2 mL去离子水，麻醉剂，裸鼠；

（2）将预备的稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料与去离子水混合，超声10分钟分散，形成第六分散液；

（3）用注射器通过尾静脉向裸鼠体内分别注射200 μL第六分散液和麻醉剂；

（4）1 h后，在活体成像仪器上对裸鼠进行观察。

本发明的有益效果为：提出的合成方法简单、重复性高，本发明方法的特点是利用稀土配合物功能化介孔包覆的上转换纳米荧光材料，得到具有上/下转换的多功能纳米荧光材料，相比于传统上转换荧光材料，该材料具有很多突出的优点：（1）实验过程简单、重复性高；（2）单分散性好；（3）具有上/下转换多模式成像，有望应用于靶向诊断和靶向药物的运输。

本发明方法具体是一种稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料制备及其生物应用。首先，将疏水性的稀土上转换发光纳米晶进行介孔包覆；然后将其加入二苯甲酰甲烷功能化的硅氧烷和甲苯的混合溶液中，回流反应24 h，形成二苯甲酰甲烷功能化的介孔材料；最后，将其与二元稀土配合物结合进行配体交换反应，即得到稀土配合物功能化介孔包覆的上转换纳米材料。本发明方法具有工艺简单、操作方便、结构易控的优势。此纳米荧光材料不仅尺寸均一、核壳结构明显，并且具有上/下转换多模式荧光成像、生物相容性好等优点，可用于不同模式下的荧光成像等生物医学领域。

附图说明

图1是本发明实施例1所得样品的TEM照片；

图2是本发明实施例1所得样品在980 nm激光光源激发下的荧光光谱图；

图3是本发明实施例1所得样品在405 nm激光光源激发下的荧光光谱图；

图4是本发明实施例7所得样品的细胞成像图片；

图5是本发明实施例8所得样品的小鼠体内成像图片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行详细说明：

实施例1：

本实施例提供稀土铕配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的合成，其包括以下步骤：

（1）预备10～15 mg 粒径为30~35 nm亲油性NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄分散在环己烷中，形成第一混合液；将0.1 g CTAB和20 mL水混合升温到60 °C溶解，冷却到室温后搅拌除去环己烷，形成第二混合液。

（2）将第一、第二混合液升温至70 °C，温度稳定后加入200 μL TEOS，反应2h，离心洗涤，产物分散在乙醇中得到第三混合液；向第三混合液中加入0.3 g硝酸铵乙醇溶液，升温至60 °C除去CTAB，离心洗涤，产物分散在乙醇中，得到第一分散液。 

（3）将0.2 g 二苯甲酰甲烷改性后的的硅氧烷，20 mL甲苯，混合超声溶解，得到第二分散液；将0.3~0.5 g Eu(dbm)₃(H₂O)₂ 20 mL乙醇中，得到第三分散液。

（4）将第一、第二分散液混合，回流24 h，得到第四混合液；将第四混合液用乙醇离心洗涤，分散在20 mL乙醇中，得到第四分散液；将第四分散液和第三分散液混合，回流6 h得到第五混合液；将第五混合液离心、洗涤、分散在20 mL乙醇中，得到最终产物铕配合物功能化的上/下转换发光材料。

实施例2：

本实施例提供稀土钐配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的合成，其包括以下步骤：

（1）预备10～15 mg 粒径为30~35 nm亲油性NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄分散在环己烷中，形成第一混合液；将0.1 g CTAB和20 mL水混合升温到60 °C溶解，冷却到室温后搅拌除去环己烷，形成第二混合液。

（2）将第一、第二混合液升温至70 °C，温度稳定后加入200 μL TEOS，反应2h，离心洗涤，产物分散在乙醇中得到第三混合液；向第三混合液中加入0.3 g硝酸铵乙醇溶液，升温至60 °C除去CTAB，离心洗涤，产物分散在乙醇中，得到第一分散液。 

（3）将0.2 g 二苯甲酰甲烷改性后的的硅氧烷，20 mL甲苯，混合超声溶解，得到第二分散液；将0.3~0.5 g Sm(dbm)₃(H₂O)₂ 20 mL乙醇中，得到第三分散液。

（4）将第一、第二分散液混合，回流24 h，得到第四混合液；将第四混合液用乙醇离心洗涤，分散在20 mL乙醇中，得到第四分散液；将第四分散液和第三分散液混合，回流6 h得到第五混合液；将第五混合液离心、洗涤、分散在20 mL乙醇中，得到最终产物钐配合物功能化的上/下转换发光材料。

实施例3：

本实施例提供稀土铽配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的合成，其包括以下步骤：

（1）预备10～15 mg 粒径为30~35 nm亲油性NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄分散在环己烷中，形成第一混合液；将0.1 g CTAB和20 mL水混合升温到60 °C溶解，冷却到室温后搅拌除去环己烷，形成第二混合液。

（2）将第一、第二混合液升温至70 °C，温度稳定后加入200 μL TEOS，反应2h，离心洗涤，产物分散在乙醇中得到第三混合液；向第三混合液中加入0.3 g硝酸铵乙醇溶液，升温至60 °C除去CTAB，离心洗涤，产物分散在乙醇中，得到第一分散液。 

（3）将0.2 g 二苯甲酰甲烷改性后的的硅氧烷，20 mL甲苯，混合超声溶解，得到第二分散液；将0.3~0.5 g Tb(acac)₃(H₂O)₂ 20 mL乙醇中，得到第三分散液。

（4）将第一、第二分散液混合，回流24 h，得到第四混合液；将第四混合液用乙醇离心洗涤，分散在20 mL乙醇中，得到第四分散液；将第四分散液和第三分散液混合，回流6 h得到第五混合液；将第五混合液离心、洗涤、分散在20 mL乙醇中，得到最终产物铽配合物功能化的上/下转换发光材料。

实施例4：

本实施例提供稀土钕配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的合成，其包括以下步骤：

（1）预备10～15 mg 粒径为30~35 nm亲油性NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄分散在环己烷中，形成第一混合液；将0.1 g CTAB和20 mL水混合升温到60 °C溶解，冷却到室温后搅拌除去环己烷，形成第二混合液。

（2）将第一、第二混合液升温至70 °C，温度稳定后加入200 μL TEOS，反应2h，离心洗涤，产物分散在乙醇中得到第三混合液；向第三混合液中加入0.3 g硝酸铵乙醇溶液，升温至60 °C除去CTAB，离心洗涤，产物分散在乙醇中，得到第一分散液。 

（3）将0.2 g 二苯甲酰甲烷改性后的的硅氧烷，20 mL甲苯，混合超声溶解，得到第二分散液；将0.3~0.5 g Nd(dbm)₃(H₂O)₂ 20 mL乙醇中，得到第三分散液。

（4）将第一、第二分散液混合，回流24 h，得到第四混合液；将第四混合液用乙醇离心洗涤，分散在20 mL乙醇中，得到第四分散液；将第四分散液和第三分散液混合，回流6 h得到第五混合液；将第五混合液离心、洗涤、分散在20 mL乙醇中，得到最终产物钕配合物功能化的上/下转换发光材料。

实施例5：

本实施例提供稀土铒配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的合成，其包括以下步骤：

（1）预备10～15 mg 粒径为30~35 nm亲油性NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄分散在环己烷中，形成第一混合液；将0.1 g CTAB和20 mL水混合升温到60 °C溶解，冷却到室温后搅拌除去环己烷，形成第二混合液。

（2）将第一、第二混合液升温至70 °C，温度稳定后加入200 μL TEOS，反应2h，离心洗涤，产物分散在乙醇中得到第三混合液；向第三混合液中加入0.3 g硝酸铵乙醇溶液，升温至60 °C除去CTAB，离心洗涤，产物分散在乙醇中，得到第一分散液。

（3）将0.2 g 二苯甲酰甲烷改性后的的硅氧烷，20 mL甲苯，混合超声溶解，得到第二分散液；将0.3~0.5 g Er(dbm)₃(H₂O)₂ 20 mL乙醇中，得到第三分散液。

（4）将第一、第二分散液混合，回流24 h，得到第四混合液；将第四混合液用乙醇离心洗涤，分散在20 mL乙醇中，得到第四分散液；将第四分散液和第三分散液混合，回流6 h得到第五混合液；将第五混合液离心、洗涤、分散在20 mL乙醇中，得到最终产物铒配合物功能化的上/下转换发光材料。

实施例6：

本实施例提供稀土镱配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的合成，其包括以下步骤：

（1）预备10～15 mg 粒径为30~35 nm亲油性NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄分散在环己烷中，形成第一混合液；将0.1 g CTAB和20 mL水混合升温到60 °C溶解，冷却到室温后搅拌除去环己烷，形成第二混合液。

（2）将第一、第二混合液升温至70 °C，温度稳定后加入200 μL TEOS，反应2h，离心洗涤，产物分散在乙醇中得到第三混合液；向第三混合液中加入0.3 g硝酸铵乙醇溶液，升温至60 °C除去CTAB，离心洗涤，产物分散在乙醇中，得到第一分散液。 

（3）将0.2 g 二苯甲酰甲烷改性后的的硅氧烷，20 mL甲苯，混合超声溶解，得到第二分散液；将0.3~0.5 g Yb(dbm)₃(H₂O)₂ 20 mL乙醇中，得到第三分散液。

（4）将第一、第二分散液混合，回流24 h，得到第四混合液；将第四混合液用乙醇离心洗涤，分散在20 mL乙醇中，得到第四分散液；将第四分散液和第三分散液混合，回流6 h得到第五混合液；将第五混合液离心、洗涤、分散在20 mL乙醇中，得到最终产物镱配合物功能化的上/下转换发光材料。

实施例7：

本实施例提供铕配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料应用于细胞成像实验，其包括以下步骤：

（1）配200~300μg/mL的铕配合物功能化上/下转换发光纳米介孔材料的RPMI. 1640溶液培养液；

（2）将Hela 细胞在上述培养液中培养3小时；

（3）用PBS缓冲液冲洗细胞3次，将没有被细胞吸收的培养液洗去；

（4）将培养后的细胞在共聚焦显微镜上进行成像，成像过程使用0~650mW功率可调、连续波激发的稳态405 nm激光器作为激发光源，观测到位于600~700 nm的发射光，可以观察到明显的红光信号。

实施例8：

本实施例提供稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料应用于活体成像实验，其包括以下步骤：

（1）将制备的稀土配合物功能化上/下转换发光纳米介孔材料用水配制成1~2 mg/mL的分散液；

（2）通过尾静脉注射进裸鼠内100μL，1 h后将其放在活体成像仪器上进行成像观察，以980 nm激光器作为激发光源，可以在小鼠的肝脏和肺里面观察到明显的发光信号。

通过图1至图5可以看出：

图1是本发明实施例1所得样品铕配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的TEM照片，从图中可以看出纳米粒子粒径分布均匀，在外部的介孔层能清晰的观察到孔通道，说明该方法能得到形貌好、分散性能好、核壳结构明显的介孔硅材料并且功能化后的纳米材料平均粒径约为80~90 nm，因为球形、小尺寸纳米粒子更容易被细胞内吞，这对于其用作生物探针在生物体内循环具有重要意义。

图2是本发明实施例1所得样品为铕配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料在980 nm激光激发下的荧光光谱图，从图中可以观察到位于400 nm和800 nm处的发射峰，对应于Tm³⁺的¹G₄ → ³H₆和³H₄ → ³H₆跃迁，而800 nm刚好位于生物组织的“光学窗口”，表明稀土配合物功能化的上/下转换纳米材料仍然保持良好的上转换荧光性能，非常适合于小动物成像。

图3是本发明实施例1所得样品为铕配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的激发和发射光谱图，通过可见光401 nm激发，得到发射光谱，其在613 nm处的最强发射峰位于红光区，且由于是低能量、无伤害、热效应低的可见光激发所得，可用于细胞成像。

图4是本发明实施例7稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料用于细胞成像图片，从图中可以看出细胞对纳米介孔材料的内吞效果非常好，并且细胞内的荧光强度较强，证实了该纳米材料适用于细胞荧光成像。

图5是本发明实施例8稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料用于小鼠成像照片，通过该图可知，纳米材料经静脉注射后主要被小鼠的肝脏和肺部吸收，并且荧光强度较强，信噪比大，说明该纳米材料可以应用于小动物的荧光成像。

按照本发明所提供的制备方法，得到的产物不仅尺寸小、结构稳定，并且同时具有上/下转换荧光等优点，特别是所得纳米材料可应用于细胞成像和小动物体内成像。并且该产物表面可以进一步功能化，可应用于靶向诊断和靶向药物的运输。

本发明方法具有工艺简单、操作方便的优势，具体是稀土配合物功能化的上/下转换发光纳米介孔材料的合成及生物应用。特点是该发明利用稀土配合物功能化，得到了在可见光和近红外光激发下分别具有上下转换荧光的纳米介孔材料。首先，通过CTAB将上转换发光纳米晶分散在水中，然后在其表面包覆一层介孔硅；其次，通过硅羟基水解缩聚将烷氧基改性后的二苯甲酰甲烷嫁接到介孔硅上；最后，将稀土二元配合物键合到功能化的介孔纳米材料，即得稀土配合物功能化的上下/转换介孔发光材料。本发明方法具有工艺简单、操作方便、结构易控的优势。功能化后的上/下转换介孔纳米材料不仅尺寸均一、核壳结构明显、并且同时具有上/下转换荧光、生物相容性好等优点，且可用于不同稀土离子掺杂纳米晶的表面改性和键合不同稀土离子的配合物，最终产物可应用于上/下转换荧光成像、靶向载药等生物医学领域。

如本发明上述实施例所述，采用与其相同或相似方法所得到的其它用于稀土配合物功能化的上/下转换纳米介孔荧光材料的方法，如不同的上转换纳米晶(NaYF₄:Yb,Er; NaYF₄:Yb,Er,Tm; NaYF₄:Yb,Ho等)、用于嫁接稀土配合物的不同硅氧烷、不同的稀土配合物物等均在本发明保护范围内。