基于软骨内成骨体系的组织工程骨及其构建方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，涉及一种组织工程骨及其构建方法。

背景技术

由于各种创伤、感染及肿瘤切除等原因导致的骨缺损是临床的常见疾病，目前临床上通 常应用自体骨、异种骨、同种异体脱钙骨、或人工骨代用品移植修复骨缺损。自体骨移植具 有骨传导和骨诱导作用，且无疾病传播的危险，但因其来源有限、不能随意切取塑形、遗留 供区形态功能缺陷及术后无法预测骨吸收量等问题，应用受到限制。为了解决自体骨移植所 带来的这些问题，多种骨替代材料相继被研制出来，如异种骨、同种异体脱钙骨和人工骨代 用品等，但这些骨替代材料也都存在着不同程度的局限性，如异种骨具有植骨成活率较低、 易导致免疫排斥反应、有疾病传播之嫌等缺陷，难以满足临床需要；而同种异体脱钙骨最大 的缺陷是疾病传播、大块骨移植后在受体内难以成形，容易发生骨折和感染等，且同样存在 来源问题。

近年来，组织工程技术的兴起为临床骨缺损的修复提供了新思路，有望突破现有骨缺损 治疗方法中存在的瓶颈。组织工程骨修复骨缺损过程包括血管化、骨再生、骨端融合3个基 本环节。其中血管化是骨愈合过程中最基本的环节，它能将成骨细胞、前体细胞、相关信号 分子、营养物质及其它参与骨发生与修复的细胞大量携带到局部微环境中，并带走局部新陈 代谢产生的废物及坏死分解产物，维持局部为一个动态的微环境。血管化贯穿于整个修复过 程中，对骨再生与融合的方式及效果有决定意义。组织工程骨植入体内后，如不能尽早完成 血管化，将成为没有活性的大块死骨，导致最终修复失败。国内外许多学者的研究证明，用 组织工程骨修复骨缺损时，其早期成骨及后期骨愈合效果明显，但应用大块组织工程骨修复 大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，导致修复失败，其主要原因就在于未能很好 的解决组织工程骨的早期血管化问题。因此，组织工程骨特别是大段组织工程骨植入骨缺损 区后如何尽快完成血管化、重建局部血供，是当前研究的重点。

骨组织工程的三要素包括供给充足的有成骨分化潜能的种子细胞、维持空间结构并发挥 骨传导功能的支架材料、具有趋化诱导等作用的生长因子。目前解决组织工程骨早期血管化 问题的方法主要有：1.血管内皮细胞与成骨细胞或血管平滑肌细胞加生物材料联合移植。该 方法需要体外大量培养、扩增血管内皮细胞，而细胞体外培养的要求高、周期长，规模扩增 相当困难，且成熟血管内皮细胞的成血管作用较弱。2.应用显微外科技术将成骨细胞、生物 材料及带血管蒂的组织瓣包埋或血管束植入重建组织工程骨血运。该方法能够得到血管化的 组织工程骨，但必须将其异位植入，待血管束长入后再断蒂用于移植，不但有异位创伤的问 题，而且等待的时间也较长。3.利用血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素等与生物材料 复合促进血管生长。但直接应用的促血管生长因子在体内的半衰期较短，迅速降解为无活性 的片段，达不到理想的效应浓度，而如果采用首次大剂量给药，则易导致局部血管瘤。4.通 过转染促血管生长因子的基因至种子细胞。但这种细胞的安全性和免疫问题尚待进一步研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对目前应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心 部位往往发生缺血坏死，易导致修复失败的问题，提供一种基于软骨内成骨体系的组织工程 骨，以避免大块组织工程骨如何均匀血管化和保证足够营养供给的难题。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.基于软骨内成骨体系的组织工程骨的构建方法，是将间充质干细胞(MSCs)种植于 多孔骨支架材料上构建组织工程复合体，再在体外对其进行成软骨分化诱导培养2周，继而 进行成肥大化软骨分化诱导培养2周，即得基于软骨内成骨体系的组织工程骨。

优选的，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干 细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。

更优选的，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。

优选的，所述多孔骨支架材料为脱细胞骨基质或脱钙骨基质。

更优选的，所述多孔骨支架材料为脱钙骨基质。

优选的，所述成软骨分化诱导培养采用完全软骨诱导培养基，所述完全软骨诱导培养基 为DMEM低糖培养基中添加10ng/mL TGF-β3，1wt％ITS+premix，100mg/mL链霉素、100 U/mL青霉素、50μg/mL维生素C、40μg/mL脯氨酸和100nM地塞米松；所述成肥大化软 骨分化诱导培养采用肥大化软骨诱导完全培养基，所述肥大化软骨诱导完全培养基为DMEM 低糖培养基中添加1wt％ITS+premix、100mg/mL链霉素、100U/mL青霉素、50μg/mL维 生素C、40μg/mL脯氨酸、1nM地塞米松和20-100ng/mL的三碘甲状腺原氨酸。

优选的，所述基于软骨内成骨体系的组织工程骨的构建方法是取脱钙骨基质支架材料， 用DMEM培养基浸泡48小时，调节pH值为7.2；取第二代处于指数增长期的骨髓间充质干 细胞，用PBS洗涤后，用0.1wt％I型胶原酶溶液孵育1小时，再加入含0.25wt％胰酶与0.02wt％ EDTA的溶液消化3～5分钟，用含10wt％胎牛血清的DMEM培养基洗涤并重悬后，接种至前 述处理后的脱钙骨基质支架材料上，使细胞悬液刚好浸润支架材料且不溢出支架材料之外；3 小时后在无菌操作条件下将脱钙骨基质支架材料的底面翻转变成顶面，同前述方法接种细胞 悬液；3小时后加入含10wt％胎牛血清的DMEM培养基至刚好没过脱钙骨基质支架材料的顶 面，再在37℃、5％CO₂条件下培养；24小时后，在体外对其进行成软骨分化诱导培养2周， 继而进行成肥大化软骨分化诱导培养2周，即得基于软骨内成骨体系的组织工程骨。

2.采用上述方法构建的基于软骨内成骨体系的组织工程骨。

本发明的有益效果在于：软骨内成骨是骨重建的重要方式之一，针对目前应用大块组织 工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，易导致修复失败的问题，本发明 主要基于如下理由：1)软骨细胞通常存在于乏血管和低氧环境，与组织工程骨移植于体内的 环境类似；2)MSCs可在软骨诱导条件下自然分化为肥大化软骨细胞，符合软骨内成骨的自 然发展历程；3)MSCs在沿着“软骨内成骨”分化为软骨细胞并继而肥大化的过程中所释放 的生长因子，相比人工构建的任何生长因子组合，在时空上具有更加的复杂性和调控性；建 立了一种基于软骨内成骨体系的组织工程骨构建方法，避免了大块组织工程骨如何均匀血管 化和保证足够营养供给的难题。体内研究结果显示，用本发明方法构建的基于软骨内成骨体 系的组织工程骨能够在体内异位成骨，并成功修复骨缺陷，从而本发明在组织工程骨构建及 骨缺损修复中有着良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为骨髓间充质干细胞肥大化诱导后肥大化细胞标志基因Col Ⅹ的表达量随时间变化 情况。

图2为细胞团经肥大化诱导后免疫组织化学染色检测Col Ⅹ的表达显著升高(A为对照 组，B为肥大诱导组)。

图3为骨髓MSCs种植于支架材料，并进行软骨诱导2周，以及继续肥大化诱导2周后 Osterix、Sox9、Col X的表达情况。

图4为本发明构建的组织工程骨裸鼠皮下种植8周后Safranin O染色检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。

实施例1、基于软骨内成骨体系的组织工程骨的构建

1、骨髓MSCs的培养

采用肝素处理注射器于无菌条件下抽取人骨髓2～3mL，立即加至盛有等量DMEM低糖 培养基的离心管中，迅速轻轻吹打制成细胞悬液，所得细胞悬液沿管壁轻轻加至预置等体积 淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min离心20min，收集白膜层的单个核细胞于另一离心 管中，用DMEM洗涤(1000r/min离心5min)两次，弃上清，细胞用含15％胎牛血清的DMEM-L 完全培养基重悬后，以1×10⁶/mL细胞密度接种于培养瓶中，记为原代，置37℃、5％CO₂恒 温培养箱中培养，每隔3天换液，换液后于倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态特征，待 细胞接近融合时用0.25％胰蛋白酶消化，以1∶2比例传代。

待上述培养的骨髓MSCs融合至70％左右时，于倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态 特征，结果显示，细胞生长状态良好，形态均一，大部分细胞为呈宽大多角形或扁平状的成 熟间充质干细胞。

2、骨髓MSCs成软骨分化诱导继而成肥大化软骨分化诱导

待上述培养的骨髓MSCs融合至90％左右时，用0.25％胰蛋白酶消化，再用不完全软骨 诱导培养基(即DMEM低糖培养基中添加1％ITS+premix，100mg/mL链霉素、100U/mL青 霉素、50μg/mL维生素C、40μg/mL脯氨酸和100nM地塞米松)重悬并调整细胞密度至 5.0×10⁵/mL，所得细胞悬液按每个15mL离心管中0.5mL细胞悬液(2.5×10⁵个细胞)进行分 装，然后500g离心10min使细胞凝集成团，离心结束后无需弃上清或重悬细胞，将离心管 轻柔地放置于恒温培养箱中，静置24h，然后更换为完全软骨诱导培养基(即DMEM低糖培 养基中添加10ng/mL TGF-β3，1％ITS+premix，100mg/mL链霉素、100U/mL青霉素、50 μg/mL维生素C、40μg/mL脯氨酸和100nM地塞米松)，每个离心管加入完全软骨诱导培养 基500μL，换液完成后轻弹离心管壁使细胞团处于自由悬浮状态，之后每隔3天换液，培养 14天。从第15天开始，将离心管分为肥大组和对照组，肥大组更换为肥大化软骨诱导完全 培养基(即从前述完全软骨诱导培养基中去除TGF-β3，降低地塞米松浓度至1nM，并添加 20-100ng/mL的三碘甲状腺原氨酸(T3))，对照组仍然使用完全软骨诱导培养基，继续培养14 天。

分别于不同诱导时间观察上述骨髓MSCs成软骨肥大化分化诱导情况，结果显示，细胞 微团自由悬浮在离心管中，随诱导时间长短不同细胞团大小无明显差异。

分别取诱导14天、21天、28天的细胞团，提取总RNA，逆转录为cDNA，PCR检测X 型胶原(Col X)的表达。使用All-in-One^TM qPCR Mix试剂盒，PCR反应体系为：2×All-in-One  qPCR Mix 10μL，2μM上游引物2μL，2μM下游引物2μL，cDNA 2μL，ddH₂O 4μL；PCR反 应条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，80℃20s，共35次循环；扩增反应结 束后从72℃缓慢加热到99℃。结果如图1所示，骨髓间充质干细胞肥大化诱导后肥大化细胞 标志基因Col Ⅹ的表达量随时间变化逐渐升高，第28d与对照组相比差异较显著(P＜0.05)。 将诱导后肥大化细胞进行免疫组织化学染色检测检测Col Ⅹ表达情况，结果如图2所示。结 果显示，该过程中Col X的表达量显著升高。

在软骨内成骨分化后期，TGF-β可抑制软骨细胞向肥大化软骨细胞分化，阻断后续的细 胞外基质矿化、软骨细胞凋亡、破骨细胞入侵等一系列骨形成过程；而甲状腺激素可以使软 骨细胞继续去分化形成肥大化软骨细胞，促进细胞外基质的矿化以及破骨细胞的入侵。上述 骨髓MSCs成软骨分化诱导继而成肥大化软骨分化诱导是体外模拟间充质干细胞软骨内成骨 过程，先通过离心使骨髓MSCs高度凝集以模拟正常生理过程，再在培养基中添加TGF-β3 诱导骨髓MSCs向软骨分化，当分化进行一段时间后去除TGF-β3并添加甲状腺激素T3，打 破TGF-β3对软骨细胞后续分化的抑制，在T3的作用下软骨细胞继续去分化形成肥大化软骨 细胞，促进细胞外基质的矿化以及破骨细胞的入侵。

3、基于软骨内成骨体系的组织工程骨的构建

取脱钙骨基质(decalcified bone matrix,DBM)支架材料(正方体型，体积3mm×3mm× 3mm)，放置于6孔板中，用DMEM培养基浸泡48h，调节pH值约7.2；取第二代处于指数 增长期的骨髓MSCs，用PBS洗涤2次后，用0.1％I型胶原(Col I)酶孵育1h，再加入0.25％ 胰酶与0.02％EDTA消化3～5min，用含10％胎牛血清的DMEM培养基洗涤并重悬，调节细 胞密度至4×10⁷/mL，再接种至上述处理后的DBM支架材料上，使细胞悬液刚好浸润材料且 不溢出材料之外；3h后在严格无菌操作条件下将DBM支架材料的底面翻转变成顶面，同上 述方法接种细胞悬液；3h后沿6孔板的孔壁缓慢加入含10％胎牛血清的DMEM培养基至刚 好没过DBM支架材料的顶面，再置37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养；24h后，按照前述方 法进行骨髓MSCs成软骨分化诱导继而成肥大化软骨分化诱导：首先利用完全软骨诱导培养 基进行软骨诱导培养2周，再利用肥大化软骨诱导完全培养基继续肥大化诱导培养2周(肥 大组)，即得基于软骨内成骨体系的组织工程骨；同时设置对照组(以完全软骨诱导培养基替 代肥大化软骨诱导完全培养基继续培养2周)。诱导培养结束后，PCR检测Osterix2、Col X 和Sox9 mRNA的表达，番红O(Safranin O)染色进行糖胺聚糖(GAG)含量评价，茜素红 染色进行钙盐沉积矿化检测。

在诱导培养过程中，根据镜下观察和细胞培养液颜色情况，每隔1～2天换液1次，期间 可见组织工程骨代谢旺盛。PCR检测结果如图3所示，结果显示，肥大组Osterix 2和Col X 的表达较对照组显著升高(p<0.01)；Sox9的表达较对照组显著降低(p<0.01)。番红O染色 显示，肥大组GAG的含量较对照组明显降低(p<0.01)。茜素红染色显示，肥大组钙盐沉积 矿化明显高于对照组(p<0.01)。

实施例2、基于软骨内成骨体系的组织工程骨体内异位成骨

将实施例1构建的基于软骨内成骨体系的组织工程骨(肥大组和对照组)植入裸鼠皮下， 饲养8周后，取出皮下骨块，进行Safranin O染色，观察裸鼠皮下异位骨形成情况，结果如 图4所示。

结果显示，肥大组体内培育8周后，裸鼠皮下异位形成骨组织标本。大体观察：被包膜 包裹，呈半透明白色，触压有一定韧性。组织学观察：周围有少量纤维细胞及纤维组织包裹， 可见淋巴细胞但未见浸入深层，植入组织中存在少量的软骨样组织，可见典型的软骨陷窝样 结构，陷窝内有大量圆形软骨细胞，软骨周围为染色均一的玻璃样基质，番红O染色可见细 胞周围是分泌旺盛的GAG，Col II免疫组织化学染色显示有大量的Col II存在；大量新骨形 成，骨小梁表面有大量丰富的成骨细胞，小梁间隙内见血管、血细胞，支架材料大部分降解； 番红O染色呈现较少的阳性区域；骨钙素染色显示较体内培育4周时，骨钙素阳性区域显著 增加；组织块中心有毛细血管长入。而对照组内软骨形成较多，少见新骨形成。

实施例3、基于软骨内成骨体系的组织工程骨修复骨缺损

取体重2.6±0.3kg的新西兰大白兔，肌肉注射陆眠宁0.2mL/kg(体重)，5min后再肌肉注 射3％戊巴比妥钠0.2mL/kg(体重)进行麻醉，然后双侧下肢去毛，取仰卧位固定于兔台，下 肢常规消毒后，逐层切开表层皮肤、皮下筋膜和肌肉，暴露股骨中段，用微摆锯制备长约2cm 的节段性完全骨缺损，用重建锁定钢板进行固定，再用生理盐水反复冲洗创腔，清除骨屑； 然后将实施例1构建的基于软骨内成骨体系的组织工程骨(肥大组和对照组)置入缺损区， 再逐层关闭创面。于术后8周、12周后分别取骨折断端标本进行组织学、组织化学、microCT 扫描等检测。

结果显示，术后8周，肥大组整个缺损区均可见新生骨痴且新骨密度增高，明显形成骨 缺损区的桥接，组织学显示编织骨转化为板层骨；而对照组仅在两断端有少量的云雾状骨痴 形成，可见有编织骨，缺损区中央部分仍无明显骨形成影像，组织学显示存在大量软骨细胞， 并有丰富的血管形成。术后12周，肥大组骨缺损区完全被新生骨组织填充，影像基本与自体 骨一致，皮质骨连续，髓腔再通；而对照组骨缺损区骨痴形成增多，但桥接性较差，并可见 两端有骨质硬化现象，组织学显示软骨及骨细胞多见，血供较差。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。