一种胡芦巴总皂苷提取物的质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种胡芦巴总皂苷提取物中总皂苷的检测方法。

背景技术

胡芦巴为豆科胡芦豆属植物胡芦巴Trigonella foenum-graecum L.的干燥成熟种子，原产于地中海东岸、中东、伊朗高原及西马拉雅地区，我国主要分布于四川、安徽、河南、新疆等地，且南北各地均有栽培。胡芦巴在非洲、北美等国家作为调味品和开胃品使用，民间也将其作为滋补品和营养品使用；埃及人将胡芦巴作为生活必需品^[1]。在中国胡芦巴属于药食同源之品，始载于《嘉佑本草》。据《本草纲目》记载:胡芦巴，右肾命门药也，元阳不足，冷气潜伏，不能归元者宜之。张子和《儒门事亲》云，有人病目不睹，思食苦豆，即胡芦巴，频频不缺，不周岁而目中微痛，如虫行入眦，渐明而愈。按此亦因其益命门之功，所谓益火之源，以消阴翳是也。《中国药典》记载本品味苦，性温，归肾经，具有温肾助阳，祛寒止痛之功效^[2]，常用于治疗寒疝，腹胁胀满，寒湿脚气，肾虚腰酸，阳痿。

胡芦巴种子中含有多种化学成分，其中主要为甾体皂苷类、黄酮类、氨基酸类等成分。现代药理研究发现胡芦巴具有降血糖、降血脂、抗糖尿病并发症、抗肿瘤、抗血脂异常、抗氧化损害、解乙醇中毒、杀虫等生物活性^[3]。

研究发现皂苷类成分为胡芦巴药材的主要药效成分。现代药理研究发现胡芦巴总皂苷提取物具有防治糖尿病及糖尿病慢性并发症、调节血糖血脂等作用^[4]。胡芦巴总皂苷可通过下调组织型转谷氨酰胺酶(tTG)实现对大鼠心肌的保护作用^[5]；胡芦巴总皂苷能够降低大鼠酒精性脂肪肝的血清TNF-α水平，升高脂联素(adiponectin)水平，从而促进肝脏脂肪氧化，减少脂质生成，实现对酒精性脂肪肝的治疗作用^[6]；Sreemayee>[7]研究发现胡芦巴提取物在肿瘤发生的所有阶段均有效，且其能影响小鼠肝脏抗氧化防御系统，调节谷胱甘肽和过氧化脂质体水平；胡芦巴总皂苷对脑缺血具有保护作用^[8]；胡芦巴皂苷还有调节食源性代谢紊乱作用^[9]。

胡芦巴总皂苷作为胡芦巴药材的主要有效成分，市面上销售较大，但存在着不法商贩用廉价皂苷掺假销售现象，而目前主要检测胡芦巴总皂苷的方法是紫外分光光度法，但是此方法误差大、专属性不好，易受环境、仪器等外部因素影响。因此，建立一种较为准确检测胡芦巴总皂苷含量的方法是极其迫切的。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种胡芦巴总皂苷提取物的检测方法。

本发明提供了一种胡芦巴总皂苷提取物的检测方法，它是以薯蓣皂苷元为总皂苷水解产物中的指标成分，采用高效液相色谱法进行检测，其中，色谱条件为：

色谱条件：SSI series 1500高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱：TIANHE Kromasil C₁₈(200mm×4.6mm,5μm)，S/N:18201306；流动相：甲醇(B)-水(A)[0-30min:90％B；30-35min:90％B-100％B；35-60min:100％B]；流速：0.8-1.0ml/min；柱温：30-40℃；进样量：10μl；检测波长为：203-210nm。

进一步优选地，所述的检测波长为203nm；所述的柱温是35℃；所述的流速：1.0ml/min。

本发明检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a、对照品溶液的制备：精密称取薯蓣皂苷元对照品适量，置容量瓶中，加入甲醇充分溶解后，定容至刻度，制备成浓度为1.080mg/ml的对照品溶液，备用；

b、供试品溶液的制备：取胡芦巴总皂苷提取物，加入总皂苷提取物量10-90倍的5％-25％硫酸溶液，超声处理使溶解，于100℃恒温水浴中回流水解1-5小时，期间每隔1h取出一次，超声处理使其分散，然后继续水解，水解完毕后，立即冷却终止反应，过滤，沉淀用水洗至中性，即得水解产物；水解产物用甲醇溶解并定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；

c、将供试品溶液注入液相色谱仪，测定薯蓣皂苷元的含量。

其中，b步骤加入总皂苷提取物量30-40倍的15％硫酸溶液；所述的水解时间为4小时。

本发明检测方法是针对胡芦巴总皂苷提取物的质量进行检测，在确定此检测方法之前，发明人对各种水解方法进行了比较，如直接回流水解法、加有机相回流水解法、加入振荡作用水解法、加入超声作用水解法，实验结果表明加入超声处理的作用所得产物量最高。因此，本发明加入超声处理的作用，较其他方法稳定性最好，准确度最高。且操作步骤少(直接定容检测，无萃取操作)，减少了有机溶剂的用量，避免萃取不完全，所得结果更准确，可靠。

本发明通过酸水解将胡芦巴总皂苷水解成薯蓣皂苷元，然后采用高效液相色谱法测定薯蓣皂苷元的含量继而标定总皂苷的含量。此方法简便、可行，准确度优于紫外分光光度法，为测定胡芦巴中总皂苷的含量提供了新手段。

附图说明

图1对照品在不同检测波长下的HPLC色谱图(注：A：210nm；B：205nm；C：203nm)

图2样品在不同检测波长下的HPLC色谱图(注：A：210nm；B：205nm；C：203nm)

图3样品在不同柱温下的HPLC色谱图(注：A：40℃；B：35℃；C：30℃)图4样品在不同流速下的HPLC色谱图(注：A：1.0ml/min；B：0.8ml/min)图5样品在不同色谱柱下的HPLC色谱图(注：A:TIANHE Kromasil C₁₈(200mm×4.6mm,5μm)，S/N:18201306；B:C₁₈(250mm×4.6mm,5μm),S/N:3D8702-23；C:ODS-3(250mm×4.6mm,5μm),S/N:1A7133271)

图6样品在Angilent Technologies 1200Series上的HPLC色谱图

图7样品在SSI series 1500上的HPLC色谱图

图8对照品溶液的色谱图

图9空白溶剂(甲醇)的色谱图

图10供试品溶液的色谱图(t＝30min)

图11供试品溶液的色谱图(t＝60min)

图12酸浓度考察趋势图

图13水解时间考察趋势图

图14酸液加入量考察趋势图

图15水解后各部分的TLC图谱，其中，展开体系：氯仿：甲醇＝9:1；

1：水解后的母液；2：水解后水层的沉淀产物；3：薯蓣皂苷元对照品；4：水解前总皂苷样品

图16水解后各部分的TLC图谱，其中，展开体系：氯仿:甲醇:水＝4:1:0.1；

1：水解后的母液；2：水解后水层的沉淀产物；3：薯蓣皂苷元对照品；4：水解前总皂苷样品

图17正交试验最优水解条件水解样品的HPLC图谱

具体实施方式

实施例1本发明检测方法

1仪器、材料与药材

1.1仪器

SSI series 1500高效液相色谱仪(奥泰公司，紫外检测器，CSChrom Plus色谱工作站)；Angilent Technologies 1200Series(紫外检测器)；BP211D型电子天平(德国Sartorius公司)；紫外-可见分光光度仪(UV1100，上海天美科学仪器有限公司)，KQ-600DE型数控超声波清洗器(40K Hz，600W)；优普UPT系列超纯水器(成都优普电子产品有限公司)；电热恒温水浴锅DSY-1-4孔(北京国华医疗器械厂)；ZF-90型暗箱式紫外透射仪(上海顾村电光仪器厂)。

1.2材料

色谱柱Kromasil C₁₈(200mm×4.6mm,5μm)，S/N:18201306(中国TIANHE)、C₁₈(250mm×4.6mm,5μm),S/N:3D8702-23、ODS-3(250mm×4.6mm,5μm),S/N:1A7133271；石英比色皿(JB760-68标准)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3药材

胡芦巴药材于2012年9月1日购自成都荷花池药材市场，由四川大学刘海峰博士鉴定为豆科植物胡芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)的干燥成熟种子，标本存放于成都中医药大学药学院中药化学实验室，标本编号为HLB-20120901-HHC。胡芦巴总皂苷提取物共四批，其中二批由成都合盛有限公司提供，标本存放于成都中医药大学药学院中药化学实验室，标本编号为HLBZZG-20131128-HS-1、HLBZZG-20131128-HS-2；另外两批由实验室自制HLBZZG-20121010-ZZ；HLBZZG-20131107-ZZ。薯蓣皂苷元对照品(1.中国药品生物制品检定所，批号：111539-200001；2.实验室自制，纯度达到98％以上)。

2含量测定

2.1色谱条件的选择

色谱条件：SSI series 1500高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱：TIANHEKromasil C18(200mm×4.6mm,5μm)，S/N:18201306；流动相：甲醇(B)-水(A)[90:10]；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl。

2.1.1测定波长的考察

根据薯蓣皂苷元的结构考虑，其为一种甾烯醇(C₂₇H₄₂O₃),醇羟基和双键分别在A、B环内,无共轭结构,不能在长波长下检测。参考以往文献的检测方法，因此考察203nm、205nm、210nm下供试品溶液的吸收情况。结果表明，以203nm波长下的信息量较丰富而且色谱峰的表观丰度高，具有最佳的信噪比和最小干扰，因此以203nm作为检测波长。结果如图1，2。

2.1.2柱温的考察

考察了柱温30℃、35℃、40℃。结果表明，柱温为35℃时优于30℃和40℃，故确定柱温为35℃。结果如图3。

2.1.3流速的考察

考察了流速0.8ml/min、1.0ml/min。结果表明，流速为1.0ml/min出峰时间早于0.8ml/min，故确定流速为1.0ml/min。结果如图4。

2.1.4耐用性的考察

①色谱柱的考察

考察了色谱柱TIANHE Kromasil C₁₈(200mm×4.6mm,5μm)，S/N:18201306、C₁₈(250mm×4.6mm,5μm),S/N:3D8702-23、ODS-3(250mm×4.6mm,5μm),S/N:1A7133271。结果表明，以上色谱柱分离度都好，故Kromasil、同类型的色谱柱均可用于胡芦巴总皂苷酸水解产物中薯蓣皂苷元的含量测定。结果如图5。

②色谱仪器的考察

考察了高效液相色谱仪SSI series 1500、Angilent Technologies 1200Series。结果表明，样品在两色谱仪上均达到良好分离，故SSI series、AngilentTechnologies均可用于胡芦巴总皂苷提取物酸水解产物中薯蓣皂苷元的含量测定。结果如图6、7。

2.1.5色谱条件的确定

色谱条件：SSI series 1500高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱：TIANHE Kromasil C₁₈(200mm×4.6mm,5μm)，S/N:18201306；流动相：甲醇(B)-水(A)[90:10]；流速：1.0ml/min；检测波长：203nm；柱温：35℃；进样量10μl。结果如图8、9、10、11。

由图11可知，30min之后没有色谱峰出现，因此以保留时间t＝30min为宜。

2.2胡芦巴总皂苷的酸水解工艺研究

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取薯蓣皂苷元对照品适量，置10ml容量瓶中，加入适量甲醇充分溶解后，定容至刻度，制备成浓度为1.080mg/ml的对照品溶液，备用。

2.2.2标准曲线的绘制

分别精密吸取上述“2.2.1”项下的对照品溶液2、6、10、14、18、20μl注入液相色谱仪，记录峰面积，以薯蓣皂苷元的峰面积(Y)为纵坐标，对照品溶液进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程:

Y＝497027X+594816(R²＝0.9993)。实验结果表明薯蓣皂苷元进样量在2.160～21.60μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.3胡芦巴总皂苷酸水解工艺的预实验

(1)参考以往文献研究，采用以下方法进行试验：取胡芦巴总皂苷提取物2g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入50ml15％硫酸溶液，超声处理使溶解，于100℃水浴中回流水解4h，水解完毕后，立即冷却，过滤，沉淀水洗至中性，沉淀用甲醇溶解并定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。将水解后各部分进行TLC检测。将供试品溶液注入液相色谱仪测定其含量。结果：供试品溶液中薯蓣皂苷元的含量为44.30mg/g。

结果表明，直接回流水解胡芦巴总皂苷薯蓣皂苷元的得率不高，可能是水解过程的沉淀凝结成块，导致一些次生苷水解不完全，因此考虑加入有机相。

(2)取胡芦巴总皂苷提取物2g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入50ml15％硫酸溶液，超声处理使溶解，加入100ml石油醚(60-90℃),于80℃水浴中回流水解4h，水解完毕后，立即冷却。过滤，沉淀水洗至中性后甲醇溶解并定容，作为供试品溶液Ⅰ；滤液，置分液漏斗中，取上层，下层酸液用乙酸乙酯萃取4次，合并有机层，减压浓缩至干，加甲醇溶解并定容，作为供试品溶液Ⅱ。将水解后各部分进行TLC检测。将供试品溶液Ⅰ、Ⅱ注入液相色谱仪测定其含量。结果：供试品溶液Ⅰ中薯蓣皂苷元的含量为6.78mg/g；供试品溶液Ⅱ中薯蓣皂苷元的含量为13.90mg/g。

结果表明，有机层和水层沉淀中均有薯蓣皂苷元，且有机层中还含有许多其它杂质。考虑到石油醚不能很好的将水解过程中产生的薯蓣皂苷元都提取到有机层，导致水解过程操作繁琐，转移率降低，因此，放弃水解过程中加入有机层的方法，考虑水解过程中加入振摇作用。

(3)取胡芦巴总皂苷提取物2g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入50ml15％硫酸溶液，超声处理使溶解，于100℃水浴恒温振荡器以100转/分转速密封水解4h，水解完毕后，立即冷却，过滤，沉淀水洗至中性，沉淀用甲醇溶解并定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。将水解后各部分进行TLC检测。将供试品溶液注入液相色谱仪测定其含量。结果：供试品溶液中薯蓣皂苷元的含量为39.30mg/g。

结果表明，水浴恒温振荡器并没有起到很好的分散作用，水解得到的沉淀产物中仍然包裹了一些次生皂苷，导致其水解不完全。因此，考虑超声处理使沉淀分散，以利于水解完全。

(4)取胡芦巴总皂苷提取物2g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入50ml15％硫酸溶液，超声处理使溶解，于100℃恒温水浴中回流水解4h，期间每隔1h取出一次，超声处理使其分散，然后继续水解，水解完毕后，立即冷却终止反应，过滤，沉淀用水洗至中性，即得水解产物。水解产物用甲醇溶解并定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。将水解后各部分进行TLC检测。将供试品溶液注入液相色谱仪测定其含量。结果：供试品溶液中薯蓣皂苷元的含量为80.30mg/g。

结果表明，超声处理使得水解沉淀产物中包裹的次生苷分散，得到了充分的水解，使得水解完全，薯蓣皂苷元得率增加。因此，选择水解过程中加入超声处理的操作。

2.2.4单因素试验

(1)酸浓度的考察

取样品2g，精密称定，平行取5份，分别加入50倍量5％、10％、15％、20％、25％硫酸溶液，置100℃水浴中加热回流水解4h，期间每隔1h取出一次，超声处理使其分散，然后继续水解，水解完毕后，立即冷却终止反应，过滤，沉淀用水洗至中性，沉淀用甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别将供试品溶液注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，采用外标法计算即得。结果表明，15％硫酸的水解产量最高，故选择15％硫酸作为水解溶剂。结果如图12。

随着硫酸浓度的增大，薯蓣皂苷元的得率先增加后降低。当硫酸浓度为15％(约3mol·L^-1)时，薯蓣皂苷元的得率达到最大值。分析其原因，可能是当体系中[H⁺]<3mol·L^-1时，参加催化作用的H⁺的量太少，酸催化作用不明显，皂苷类成分水解不完全；而当[H⁺]>3mol·L^-1时皂苷元量减少，可能是因为在强酸性环境中，薯蓣皂苷元转化为脱水产物，导致其得率下降。因此，最佳的酸液浓度为15％硫酸。

(2)水解时间的考察

取样品2g，精密称定，平行取5份，分别加入50倍量15％的硫酸溶液，置100℃水浴中依次加热回流水解1h、2h、3h、4h、5h,期间每水解一段时间后取出，超声处理(共3次)使其分散，然后继续水解，水解完毕后，立即冷却终止反应，过滤，沉淀用水洗至中性，沉淀用甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别将供试品溶液注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，采用外标法计算即得。结果表明，水解4h所得产物量最高，故水解的最佳时间为4h。结果如图13。

随着水解时间的加长，薯蓣皂苷元的得率先增加后降低。当水解时间为4h时，薯蓣皂苷元的得率达到最大值。分析其原因，可能是因为当水解时间过短时，薯蓣皂苷元类成分没有水解完全；而当水解时间过长时，薯蓣皂苷元在酸性环境中脱水转化为去氧薯蓣皂苷元的副反应不断增加，导致薯蓣皂苷元的得率下降。因此，反应的最佳时间为4h。

(3)酸液加入量的考察

取样品2g，精密称定，平行取5份，分别加入10倍、30倍、50倍、70倍、90倍的15％的硫酸溶液，置100℃水浴中加热回流水解4h，期间每隔1h取出一次，超声处理使其分散，然后继续水解，水解完毕后，立即冷却终止反应，过滤，沉淀用水洗至中性，沉淀用甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别将供试品溶液注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，采用外标法计算即得。结果表明，加入30倍酸液水解所得产物量最高，故酸液的最佳加入量为30倍量。结果如图14。

随着硫酸用量的增加，薯蓣皂苷元的得率先增加后降低。当硫酸用量为30倍量时，薯蓣皂苷元的得率达到最大值。分析其原因在于，当硫酸用量过少时，酸催化反应需要的H⁺量不足，皂苷类成分水解不完全；当硫酸用量过多时，胡芦巴总皂苷提取物被稀释的程度加剧，致使副反应加剧，导致薯蓣皂苷元的得率下降。因此，最佳的酸液加入量为30倍量。

2.2.5正交试验

根据单因素试验结果可知，影响胡芦巴总皂苷酸水解的主要因素有酸液浓度、水解时间及酸液加入量，故采用正交试验L₉(3)³表，以水解产物中所含薯蓣皂苷元的量为考察指标确定酸液浓度、水解时间及酸液加入量。正交试验因素水平设计见表1，结果及直观分析见表2-3，方差分析结果见表2-4。

表1 正交试验的因素与水平表

表2 正交试验结果及直观分析表

表3 方差分析结果表

(1)由表2正交试验结果及直观分析可知，3个影响因素的主次顺序，分别是A>B>C，即酸液浓度>水解时间>酸液加入量，最佳工艺参数为A₂B₂C₃，即加入40倍量15％硫酸溶液，水浴温度水解4h，水解产物中所含薯蓣皂苷元的量最高。

(2)由表3方差分析结果可知，各因素对实验结果影响的程度是A>B>C，即影响最大的是酸液浓度，其次是水解时间，然后是酸液加入量。因素A有显著性，与上面结果分析一致。

2.2.6验证试验

(1)按正交试验优选的水解条件重复3次，对该工艺进行验证。结果见表4。将水解后的各部分进行TLC检测，结果如图15、16。

表4 验证试验结果表

(2)按正交试验最优条件水解样品，将所得供试品溶液按色谱条件(SSIseries 1500高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱：TIANHE Kromasil C₁₈(200mm×4.6mm,5μm)，S/N:18201306；流动相：甲醇(B)-水(A)[0-30min:90％B；30-35min:90％B-100％B；35-60min:100％B]；流速：1.0ml/min；检测波长：203nm；柱温：35℃进行测定。结果如图17。

(3)由表4可知，按上述确定的水解工艺进行水解，水解产物中所含薯蓣皂苷元的量接近正交实验的最优值，工艺重现性好，说明优选出的水解工艺合理可行。

(4)由图15,16可知,按正交实验最优条件进行水解，总皂苷水解完全，且水解产物中大部分是薯蓣皂苷元。由图17可知，胡芦巴水解后还会有其他皂苷元生成，但主要的还是薯蓣皂苷元，因此通过测定酸水解后产物中薯蓣皂苷元的量间接标定总皂苷的量是合理可行的。

2.3方法与结果

2.3.1对照品溶液的制备

精密称取薯蓣皂苷元对照品适量，置10ml容量瓶中，加入适量甲醇充分溶解后，定容至刻度，制备成浓度为1.080mg/ml的对照品溶液，备用。

2.3.2供试品溶液的制备

取样品2g，精密称定，加入40倍量15％的硫酸溶液，置100℃水浴中加热回流水解4h,期间每隔1h取出一次，超声处理使其分散，然后继续水解，水解完毕后，立即冷却终止反应，过滤，沉淀水洗至中性，沉淀用甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.3线性关系试验

分别精密吸取上述“2.2.3.1”的对照品溶液2、6、10、14、18、20μl注入液相色谱仪，记录峰面积，以薯蓣皂苷元的峰面积(Y)为纵坐标，对照品溶液进样量(X)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程:Y＝497027X+594816(R²＝0.9993)。实验结果表明薯蓣皂苷元的进样量在2.160～21.60μg范围内呈良好的线性关系(如表5)。

表5 线性关系试验结果表

2.3.4精密度试验

精密吸取上述“2.2.3.1”的对照品溶液10μl，连续进样5次，记录峰面积，薯蓣皂苷元对照品峰面积的RSD为1.54％。表明仪器精密度好。结果如表6。

表6 精密度试验结果表

2.3.5稳定性试验

精密吸取上述“2.3.2”的供试品溶液5μl，于0、2、4、6、8、10、24h进样测定，薯蓣皂苷元峰面积的RSD为1.53％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。结果如表7。

表7 稳定性试验结果表

2.3.6重复性试验

取同批次本品粉末2g，精密称定，平行取6份，按“2.2.3.2”供试品制备方法制备，精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，薯蓣皂苷元峰面积的RSD为1.21％，表明重复性良好。结果如表8。

表8 重复性试验结果表

2.3.7加样回收试验

取1g已知含量的胡芦巴总皂苷提取物，精密称定，每个供试品中分别精密加入一定量的薯蓣皂苷元对照品(实验室自制，纯度大于98％)(为供试品含量的80％、100％、120％)，按“2.3.2.3”项下供试品制备方法制备，共有9个样品，以“2.2.1.5”项下色谱条件进样5μl，测定薯蓣皂苷元的含量。结果表明，本法的准确度较好。结果如表9。

表9 加样回收试验结果表

2.3.8样品测定

取三批样品，每批2份，按“2.2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1.5”项下色谱条件进行测定。结果表明，批次3的含量最高，达到84.31mg/g。三批样品的平均含量为83.24mg/g。结果如表10。

表10 三批样品含量测定结果表

2.3.9HPLC法与UV法测定胡芦巴总皂苷含量的比较

(1)薯蓣皂苷元UV法标准曲线的绘制：按“2.2.2.1”项下方法配制0.0995mg/ml薯蓣皂苷元标准品甲醇溶液，分别精密吸取该溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml置于具塞试管中，水浴蒸干，分别精密加入5％香草醛冰醋酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，水浴60℃保温15min，快速冷却。冰醋酸定容至10ml，摇匀，于547nm处测吸光度。以薯蓣皂苷元标准品浓度(C)为横坐标，以吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程:A＝8.140C+0.091(R²＝0.9986),线性范围:0.02～0.06mg/ml。

(2)水解样品中薯蓣皂苷元的含量测定：取总皂苷样品2g，精密称定，按正交实验最优水解条件制备样品，将水解所得的沉淀于50℃真空干燥箱干燥，精密称定(0.45231g)。

①UV法：精密称取水解样品25mg，甲醇溶解并定容至50ml容量瓶中。精密吸取该溶液0.5ml，按上述“2.2.3.9(1)”项下方法进行测定。结果表明，总皂苷样品水解得薯蓣皂苷元的含量为17.5％。

②HPLC法：精密称取水解样品40mg，甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中。按“2.2.1.5”色谱条件进行测定。结果表明，总皂苷样品水解得薯蓣皂苷元的含量为8.5％。

(3)胡芦巴总皂苷的含量测定：

①UV法：精密称取胡芦巴总皂苷样品50mg，甲醇溶解并定容至50ml容量瓶中。精密吸取该溶液1ml，按上述“2.2.3.9(1)”项下方法进行测定。结果表明，总皂苷的含量为39.2％。

②HPLC法：验证试验得出，胡芦巴总皂苷酸水解得到薯蓣皂苷元的含量约为8.0％。总皂苷中我们以薯蓣皂苷为准，薯蓣皂苷的分子量为869.0，薯蓣皂苷元的分子量为414.6，因此我们可以间接标定出能够转化为薯蓣皂苷元的胡芦巴总皂苷(以薯蓣皂苷计)的含量为16.8％。计算公式如下：

通过上述实验结果发现，UV法测定胡芦巴总皂苷及水解产物中薯蓣皂苷元的含量明显高于HPLC法，表明HPLC法检测的专属性较强，因此，可以作为UV法的补充，两者作为标准全面反映胡芦巴总皂苷的含量。

建议UV法测定的含量为40％的胡芦巴总皂苷酸水解所得薯蓣皂苷元的含量用HPLC检测不得少于8.0％。

本发明通过酸水解将胡芦巴总皂苷水解成薯蓣皂苷元，然后采用高效液相色谱法测定薯蓣皂苷元的含量继而标定总皂苷的含量。此方法简便、可行，准确度优于紫外分光光度法，为测定胡芦巴中总皂苷的含量提供了新手段。