富含亚氨基糖类的N-酸类和/或2-哌啶酸类的桑提取物

本发明涉及从植物桑(Morus)的叶可获得的富含亚氨基糖的N-酸类 (与中性和碱性亚氨基糖类不同)和/或2-哌啶酸类的提取物。

所述提取物已经显示出具有酶催化活性，这使该富含这些化合物的 提取物，和从这些提取物分离的化合物成为用于治疗疾病，特别地而非 排他性地治疗代谢障碍比如例如糖尿病的良好候选物。

定义

亚氨基糖类是一类广泛分布的植物和微生物的化合物，其具有与人 糖苷酶、其它蛋白和糖受体相互作用的能力。在本说明书中，其被认为 是多羟基化的仲胺和叔胺，其中所述分子类似于单糖糖类，但是其中环 氧被氮代替。存在适合该类别的5种环结构，其是天然最常见的：

a.   吡咯烷，

b.   哌啶，

c.吡咯双烷，

d.   吲哚里西啶，和

e.降托烷(nor-tropane)。

在自然中，这些水溶性次级植物化合物的存在主要被其它以更大量 存在的水溶性初级化合物比如例如∶常见糖类、肽类和氨基酸类所掩盖， 并且其它亚氨基糖酸类(ISA)也被如下占优势的碱性亚氨基糖所掩盖：比 如：

a.1脱氧野尻霉素(DNJ)，

b.桑叶生物碱(fagomine)，

c.1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇(DAB)，和

d.打碗花精(calystegine)B2。

本发明的新提取物富含前述亚氨基糖类的N-酸类，并且包括但不限 于亚氨基糖类的N-烷链烷酸，比如N-乙酸、丙酸和丁酸DAB及N-乙酸、 丙酸和丁酸DNJ。它们也富含2-哌啶酸类。

富含指亚氨基糖类的N-酸类和/或2-哌啶酸类在提取物中的存在量 为以重量计大于5％、更优选地大于10％、更优选地仍然大于15％ (wt/wt)。

优选地，包含亚氨基糖类的N-酸类和2-哌啶酸类的级分占大于 10％、至20％，和30％至40％、50％、60％、70％、80％90％或以上(wt/wt)。

提取物中存在的其它组分可以包括寡糖组分和氨基酸组分。

对于提取物，典型的质量平衡为：

a.亚氨基糖酸类5-25％，典型地为15％；

b.2-哌啶酸类5-35％，典型地为20％；

c.寡糖类5-25％，典型地为15％；和

d.氨基酸类(中性和酸性)25-75％，典型地为50％。

然而，可能的是，减少寡糖和氨基酸成分，以提高亚氨基糖酸类和 2-哌啶酸类的相对量，从而使得它们含有提取物的初级成分，和/或由其 中分离单独化合物。

背景技术

在1976年，Yagi等人研究了桑葚植物分离的DNJ的抗糖尿病活性， 发现它是α和β葡糖苷酶的酶家族的有效抑制剂。

接着，对DNJ骨架应用药物化学，产生N-羟乙基DNJ(米格列醇)， 其已经成功地开发为抗糖尿病药然而，其具有广泛糖苷酶活 性，会引起副作用。

本发明是WO2011/032502中公开的提取物的发展，WO2011/032502 描述了从桑葚植物叶得到的提取物，其抑制α葡糖苷酶并且可用于控制 血糖水平。

说明书教导了所述提取物富含亚氨基糖类，包含至多40％重量。该 提取物另外包含至多70％的氨基酸类。

所描述的提取物是水易溶性的，颜色为浅黄色或接近白色，在1％ 水溶液中具有5.5-6.5的pH，并且在218和263nm处具有最大吸收峰。

教导的是，该提取物适用于控制血糖水平。

实例显示该组合物包括含量为提取物的5.2％-39％(w/w)的亚氨基 糖类，初级亚氨基糖DNJ的存在量为总提取物的1.4％-18.6％(w/w)，但 是在所有情形中，DNJ含量占亚氨基酸含量的至少19％(w/w)(通过其 DNJ、N-甲基DNJ和桑叶生物碱含量来测量)。

提取物是通过如下制备的：

a.进行水或乙醇提取；

b.用强酸性阳离子交换树脂进行柱色谱，并且收集用氨水洗脱的被 结合的级分；

c.对洗脱液进行使用大孔树脂的柱色谱，收集洗脱液；和

d.浓缩且干燥提取物。

观察到在实施例1(5.8％DNJ，21％的总亚氨基糖类)中的IC₅₀(抑 制α葡糖苷酶)为13.6μg/ml，与之相比纯DNJ的IC₅₀为70μg/ml。

提取物中鉴别的其它亚氨基糖类包括1,4-双脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉 伯糖醇(DAB)、2-Oα-D-吡喃半乳糖基-DNJ(GAL-DNJ)和打碗花精B2。

而且，注意到DAB是糖原磷酸化酶抑制剂。

得到的级分典型地包括约0.04-1.4％(w/w)的起始原料(桑叶)。

包含大量DNJ(典型地为5-10％重量的DNJ)的这些及其它桑提取物 的问题是DNJ不是任何一种α-葡糖苷酶的选择性抑制剂，因此，包含大 量DNJ的提取物由于抑制多种葡糖苷酶(包括消化性二糖酶类)产生副作 用。

寻求采用单一药物实体治疗新陈代谢疾病的其它问题是这些药物通 常经由单一机制起作用，而大多数代谢障碍的特征是多重效应，其将受 益于通过多种机制治疗而不仅仅是减少消化道的葡萄糖摄取。

本发明的一个目的是开发组合物或分离化合物，所述组合物或化合 物可以以多种水平起作用或提供更多特异性，如此它们很可能被证实在 治疗疾病比如代谢障碍中更有效和/或更安全，并且可以是预防剂或治疗 剂。

发明简述

根据本发明的第一个方面，提供从桑叶可获得的纯化的提取物，特 征在于其为

a.水溶性的；

b.抑制α-葡糖苷酶，和

c.包括大于提取物重量的5％(w/w)的亚氨基糖的N-酸类和/或2-哌 啶酸类。

优选地，亚氨基糖的N-酸类和/或2-哌啶酸类占所述提取物的至少 10％至15％、至20％、至30％(w/w)或以上。

优选地，亚氨基糖类的N-酸类包括DAB、DNJ、桑叶生物碱或打碗 花精B2的一种或多种的C1-C9烷链烷酸。这些包括乙酸、丙酸和丁酸。

优选地，所述提取物进一步抑制糖原磷酸化酶。该活性可以在不存 在DAB的情况下存在。

优选地，所述提取物优选地且选择性地抑制稻米α葡糖苷酶。

纯化的提取物可以进一步包含寡糖类和氨基酸类。

在一个优选的实施方案中，纯化的提取物具有质量平衡，其中：

a.亚氨基糖酸类占提取物重量的5-25％；

b.2-哌啶酸类占提取物重量的5-35％；

c.寡糖类占提取物重量的5-25％；和

d.氨基酸类占提取物重量的25-75％。

氨基酸主要地包括酸性氨基酸类，寡糖类包括含有脱氧糖类、芳基 糖苷类和糖醛酸类的稀有的三糖类和更大糖类。

大部分非酸性亚氨基糖类(比如DNJ和DAB)被除去，因此亚氨基糖 类包括亚氨基酸含量的小于19％(w/w)的DNJ至小于15％的(w/w)至 10％(w/w)、至5％(w/w)、至3％(w/w)、至1％(w/w)的DNJ。

纯化的提取物为白色半结晶或无定形物质，并且相对于起始原料的 重量纯化倍率(factor)为至少200，通常超过1000。

纯化的提取物也可以起下述的一种或多种的抑制剂作用：柚苷酶、 葡糖苷酶、或甘露糖苷酶；葡糖醛酸糖苷酶或氨基已糖苷酶；或α和β 半乳糖苷酶或艾杜糖醛酸酶(I-d-uronidase)。

提取物得自

a.桑(Morus alba L.)，

b.鲁桑(Morus alba var.multicaulis L)

c.黑桑(Morus nigra)或

d.鸡桑(Morus australis Poir)。

纯化的提取物是使用强酸性阳离子交换树脂获得的，并且可以在纯 化过程中进一步使用强碱性阴离子交换树脂和/或弱碱性阴离子交换树 脂。

其中DNJ不是初级亚氨基糖的提取物的选择违背了常规思维。

之前没有提出过使用从植物桑(Morus)的叶可获得的富含亚氨基糖 类的N-酸类(与碱性亚氨基糖类相对的)和/或2-哌啶酸类的提取物。

本发明的提取物是有效的桑叶提取物，其富含酸性亚氨基糖类和2- 哌啶酸类(且包含极少的DNJ或DAB)。

相反，大多数市售可获得的桑叶提取物具有其中DNJ是最大量亚 氨基糖(通常占桑叶亚氨基糖的50％)的亚氨基糖含量(Asano et al.2001J. Agric.Food Chem.49:4208-4213)。

本发明的提取物富含亚氨基糖酸类(ISA)和/或2-哌啶酸类，其可以 在有或没有其它组分比如寡糖类和氨基酸类的情况下存在。

存在的ISA典型结构包括下述通式1至5的化合物：

式1

R-DAB

其中R为C1-C9直链烷酸基，比如乙酸基、丙酸基或丁酸基。

式2

R-DNJ

其中R为C1-C9直链烷酸基，比如乙酸基、丙酸基或丁酸基。

式3

R-桑叶生物碱

其中R为C1-C9直链烷酸基，比如乙酸基、丙酸基或丁酸基。

式4

R-5-羟基2-哌啶酸类

其中R为C1-C9直链烷酸基，比如乙酸基、丙酸基或丁酸基，和

式5

R-打碗花精B2

其中R为C1-C9直链烷酸基，比如乙酸基、丙酸基或丁酸基。

对于亚氨基糖DNJ是非选择性的、而反而对于ISA含量和/或2-哌 啶酸是选择性的、且实质上富含ISA内容物和/或2-哌啶酸的提取物与任 何报道的桑叶提取物截然不同。更特别地，它们在下述方面不同：

(1)本发明的提取物是新的，与常规桑叶提取物具有完全不同的化 学特性。本发明的提取物的最显著且重要的化学特性之一是提供多种N- 取代的亚氨基糖，其被认为是来自亚氨基糖的有希望的药物候选物来源。 取代的亚氨基糖的成功实例包括N-烷基化亚氨基糖，其仅有两种经批准 的亚氨基糖基药，米格列醇(Glyset)-标明用于II型糖尿病，其是N-2-羟 乙基烷基化的亚氨基糖，和美格鲁特(Zavesca)，正丁基-DNJ，用于I型 高歇氏病和C型Niemann Pick疾病，然而本发明教导N-链烷酸取代。

(2)本发明的提取物具有与常用桑叶提取物不同且可能有利的生物 活性特性，例如，在增强治疗效果的酶抑制作用方面特异性更强，并且 降低了副作用。由DNJ引起的GI副作用应归于其非选择性抑制葡糖苷 酶，并且可以通过降低DNJ含量使GI副作用最小化。另外，N-烷基取 代的ISA可改变活性分子的亲水性/疏水性，以改善它们的生物利用度和 膜透性或结合亲和力。而且，富含ISA的组合物可提高活性化合物的立 体结构(例如，手性)的易变性，允许伴侣(chaperon)介导的活性机制参与 治疗相应疾病，比如溶酶体贮积症。

(3)本发明的提取物由于其上述提及的独特性，可以具有扩展的治 疗谱：代谢综合征、I型和II型糖尿病到抗病毒、抗炎或比如罕见疾病 如I型高歇氏病。

(4)本发明的提取物应当具有更好的安全特性。桑叶是一种自身非 常安全的药用植物物质，是蚕的唯一食物，并且在传统医学中已经以未 加工形式或水煎剂形式用于人类数千年。

(5)本发明的提取物的制造方法可以容易地按比例放大，而无需使 用有机溶剂。在常规植物化学研究和大多数目前的商业生产方法中，通 常通过使用多种不同极性的有机溶剂比如乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、 二氯甲烷等获得并浓缩植物提取物。水溶性组分保留在植物物质中或者 在纯化过程中被弃去。更通常地，该方法很难(即使不是不可能)按比例 放大重复，并且最终提取物中的溶剂残留可能成为一个问题。

因此，生产根据本发明富含亚氨基糖类的N-酸类和2-哌啶酸类的提 取物，除了在WO2011/032502中教导的之外还包括分馏步骤。优选的方 法包括使用多种离子交换技术，其包括使用：:

a.强酸性阳离子交换树脂，比如Dowex50或IR120；

b.强碱性阴离子交换树脂，比如Dowex1、Dowex2或Amberlite  CG400；和

c.弱碱性阴离子交换树脂，比如Amberlite IR45。

根据本发明的一个进一步的方面，提供一种包括本发明的提取物的 药物制剂、食品补充剂或食物成分。

根据本发明的一个仍然进一步的方面，提供使用本发明的纯化的提 取物治疗代谢障碍的用途。

提取物可以提供下述的一种或多种∶

a.降低胰岛素抵抗；

b.体重减轻；

c.血脂控制；和

d.β-细胞保护。

在一个优选的实施方案中，所述提取物用于治疗糖尿病。

根据本发明的一个仍然进一步的方面，提供一种制备本发明的纯化 提取物的方法，包括如下步骤：

a.从桑叶获得水溶性提取物；

b.使用强酸性阳离子交换树脂结合期望级分，用水洗涤，然后用氨 水洗脱期望级分来选择富含亚氨基的级分；和

c.使用下述的一种或多种选择酸性级分：

i.第二种强酸性阳离子交换树脂；

ii.强碱性阴离子交换树脂；和

iii.弱碱离子交换树脂。

优选地，在步骤ci)中，选取未保留的级分，将所述级分通过使用cii) 和ciii)的一种或多种进一步纯化。

根据本发明的仍然一个进一步的方面，提供一种筛选用于治疗代谢 障碍的化合物的方法，包括从本发明的提取物分离化合物和筛选其酶活 性。

附图简述

参照下述实施例和与实施例4和5有关的附图进一步描述本发明， 其仅仅作为举例，其中：

图1为PhynoRadiance粗提取物的GC-MS色谱图；

图2为Imino Norm粗提取物的GC-MS色谱图；

图3在9.5分钟亚氨基糖的质谱(tms)；

图4为PhynoRadiance IR120保留的(亚氨基糖级分)1.38g的 GC-MS色谱图；

图5为IminoNorm IR120保留的(亚氨基糖级分1)6.14g的GC-MS 色谱图；

图6a和b为来自IminoNorm还没有鉴别的两种亚氨基糖的质谱；

图7a和b为IminoNorm IR120保留的(亚氨基糖级分2)23g的 GC-MS色谱图的桑叶生物碱的质谱；

图8a、b和c为IminoNorm IR120保留的(亚氨基糖级分3)25.5g 的GC-MS色谱图和羟基化2-哌啶酸的两种质谱；

图9为来自PhynoRadiance的DNJ的N-乙酸(tms)的质谱；

图10为来自PhynoRadiance的DAB-N-乙酸(tms)的质谱；

图11为来自IminoNorm的DNJ的N-乙酸(tms)的质谱；

图12为来自IminoNorm的DAB-N-乙酸(tms)的质谱；

图13为来自IminoNorm的DNJ的N-丙酸(tms)的质谱；和

图14为显示本发明的提取物对小鼠血糖水平的影响的图。

详细说明

如下给出的实施例举例说明了，可以如何制备本发明要求保护的提 取物和分离化合物以及如何用于治疗所述病症，该实施例仅提供作为举 例。

所述发明考虑的起始点为WO2011/032502中公开的提取物。

与常规原理不同，本申请人注意到提取物的α苷酶活性大于纯DNJ， 决定除去DNJ，并观察不同子级分的活性。这些实验鉴别了显示出良好 的活性的富含亚氨基糖的N-酸和2-哌啶酸的级分，并且导致该发现的实 验细节为如下列出的：

实施例1

起始提取物

桑叶的干提取物，批次ML091210

方法

将样品溶于水中，通过强酸性阳离子交换(柱2×30cm中的IR120H⁺形式树脂)分馏，得到

i.水转移的未保留的样品(预期主要包含糖类、类黄酮类等)；

ii.2M吡啶转移的结合级分(通常除去剩余糖类、酚类及中性和酸性 氨基酸类)；和

iii.2M氨水溶液转移的结合级分(预期包含任何生物碱类[亚氨基糖 类]和碱性氨基酸类)

在未保留的物质中检测到某些DNJ(或许是由于样品过载或pH导 致)，因而使其通过第二个IR120柱(相同尺寸)，得到新的未保留的样品 和第二种氨水级分。第二种未保留的样品不包含DNJ。

将级分列在下表1中：

将该级分冷冻干燥并称重。通过GC-MS和500MHz NMR色谱(在 D₂O中)分析等分试样。通过GC-MS和NMR数据测定DNJ含量。

GC-MS

在衍生化之前，将所有样品冷冻干燥。使用六甲基二硅氮烷和三甲 基氯硅烷在吡啶中的混合物(Pierce‘Tri Sil’硅烷化试剂，2:1:10比例的 HMDS:TMCS:吡啶)制备三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物。在60℃下加热 样品15分钟，然后静置在室温下至少60分钟。通过离心沉降不溶性反 应产物，并使用注射器将上清液转移到新小瓶中。

通过GC-MS，采用高极性熔融-二氧化硅柱(Varian‘Factor  Four’VF-5ms柱，25m x0.25mm内径(i.d.)，0.25μm相厚度)，使 用Perkin Elmer Autosystem XL气相色谱仪进行分析。载体气体(氦)流 速为1ml分钟-1。使用温度程序分离三甲基甲硅烷基-(TMS)衍生物，其 开始于160℃5分钟，接着以10℃分钟-1的速率线性递增至300℃。将 温度再保持在300℃下10分钟；总分析时间为29分钟。使用Perkin Elmer  TurboMass Gold质谱仪进行柱洗脱液的电子轰击质谱法，在分析期间其 固定在250℃下进行，所述质谱仪具有四极离子过滤系统。检测器的质 量范围设置在100至650amu。传输线(GC至MS)的温度保持在250℃。 通过装有去活化(deactivated)石英毛的熔凝二氧化硅窄孔注射衬垫，经由 分流出口(分流比50:1)将样品注入所述柱上；进样口温度保持在200℃。 注射体积为1μl。使用Perkin Elmer TurboMass软件(TurboMass v.4.4) 进行系统控制、数据收集和质谱分析。通过比较样品的峰面积(在小瓶中 每个样品1mg)进行DNJ定量，使用纯DNJ(每小瓶0.05-0.33mg)制备校 准曲线。通过使用NMR数据估计样品的DNJ，确认定量。

糖苷酶测定

该测定使用购自Sigma-Aldrich的对-硝基苯基底物和市售酶。在 27℃下，在0.1M柠檬酸/0.2M磷酸氢二钠缓冲液中、在酶的最适pH值， 测定酶。培养混合物由10μl酶溶液、10μl的10mg/ml提取物的水溶液、 和50μl在缓冲液(酶的最适pH值)中制备的合适的5mM对-硝基苯基底 物组成。在反应的指数期期间，通过加入70μl的0.4M甘氨酸(pH10.4) 终止反应，在开始时，使用其中水替代桑级分的未限制测定对所述反应 进行测定。使用Versamax微板读数器(Molecular Devices)在405nm处 读取最终吸光度。进行测定，一式三份，给出值为每次测定的三次重复 的平均值。结果表示为抑制％。

结果

IR120级分的GC-MS色谱图(没有显示)全部由DNJ占重要的地位。

在第二次IR120柱之后，未保留的物质主要是糖类，并且不包含DNJ 或其它亚氨基糖。

也通过其特征性质谱检测其它亚氨基糖和亚氨基糖酸(羟基化的非 蛋白亚氨基酸)。

测定三种保留级分b)、c)和d)-表1中的DNJ水平，并显示在表2 中：

通过GC-MS定量样品中的DNJ

表2

假定桑叶生物碱、DAB、2-哌啶酸类(合并的)和13.35分钟的亚氨基 糖的检测器响应相同，则10g中这些化合物的含量估计为：

NMR分析(没有显示)显示，在IR120上未保留的物质主要是糖类； 阳离子交换之后，该级分占10g样品的约50％重量。

含有DNJ的主要含氮组分测定为氨基酸(精确鉴别不可行，但是通 过GC-MS试验性鉴别了苯丙氨酸和脯氨酸)。

糖苷酶测定

室内糖苷酶测定结果显示在表3中。

鉴于存在显著量的DNJ，预期IR120保留级分抑制α-和β-葡糖苷酶。

其它糖苷酶类比如葡糖醛酸糖苷酶和氨基已糖苷酶的抑制不能归因 于DNJ、DAB或桑叶生物碱。可能的是，鉴别为2-哌啶酸的主要组分负 责这些其它糖苷酶抑制。

在包括糖尿病的许多疾病中观察到的是，升高的血清水平的葡糖醛 酸糖苷酶和氨基已糖苷酶活性。

讨论

IR120保留级分都包含DNJ，但是分析和糖苷酶结果显示存在更宽 范围的糖苷酶抑制剂。

IR120未保留物质也显示令人惊奇的某些糖苷酶抑制，但是这可能 归因于在该级分中主要的糖类，并且可受糖苷酶测定的干扰。

DNJ、DAB和桑叶生物碱全部是葡糖苷酶抑制剂，令人感兴趣的是 IR120保留级分得到良好的糖苷酶抑制，其不受DNJ影响。

已知在包括糖尿病的多种疾病中，血清或尿液中这些酶活性物的一 些比如氨基已糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶升高。

在随后的实施例中，为了更确凿鉴别决定所述活性的更主要的化合 物，将这些级分进一步分馏。

特别感兴趣的是2-哌啶酸化合物。

实施例2

使用阳离子交换色谱(IR120H+形式)，将实施例1的提取物分馏成 四种级分。

未保留的级分包含具有用吡啶和然后用氨水转移的含有亚氨基糖的 糖类。

某些DNJ存在于每个保留级分中，但是大多数存在于第一次氨水级 分中。还检测了其它亚氨基糖类，包括试验性的桑叶生物碱、DAB、某 些羟基化亚氨基酸类及其它可能的新亚氨基糖。

下表4显示由实施例1中级分所观察到的酶抑制作用。

实施例2中，目的为：

a.进一步分解所有四种级分中的组分：

b.通过GC-MS和500MHz NMR分析化合物，尽可能地鉴别许多 组分；和

c.对纯化化合物进行糖苷酶测定，以进一步辨别不同组分赋予的抑 制作用。

分析

该实施例主要包括进一步分馏实施例1中使用的10g桑叶提取物。

GC-MS

其根据实施例1进行。

NMR

其根据实施例1进行。

糖苷酶测定

其根据实施例1进行。

纯化方法

a)糖组分(IR120未保留的)

GC-MS显示来自实施例1的IR120未保留级分主要包含糖类，但 是在糖苷酶(包括糖原磷酸化酶)测定中具有相当令人惊奇的活性。因此， 进一步分馏该样品以分离常见糖类与更稀有的组分(可能产生活性)，并 且除去一些褐色物质(可能是酚类)。

将5g溶于最小体积的蒸馏水中，并应用于OH-型的Amberlite  CG400阴离子交换树脂的柱(2×10cm)。

收集十一个2ml的水级分，之后用1M HOAc除去保留物质。干燥 样品，并通过GC-MS、NMR分析，基于该分析，提供一些物质进行糖 苷酶和糖原磷酸化酶测定。一些褐色物质永久性地结合树脂。

获得的糖级分是无色或淡黄色。将一些物质再混合进行之后的进一 步分离。所述级分显示在下表5中：

因此，在10g样品中，糖类的总重量似乎为3.728g左右，但是可能 通过GC或NMR不能检测某些无机物质。

b)吡啶和氨水级分

进一步分馏IR120吡啶和氨水级分1和2，以减少存在的DNJ与其 它组分，以允许通过NMR解析其结构。

为了实现该目的，使用下述色谱运行一组柱：

a.阴离子交换色谱(OH^-和Ac-形式的Amberlite CG400)，和

b.使用弱酸性树脂的阳离子交换色谱(铵形式的Amberlite CG50)。

结果

a)糖分馏

糖类(来自实施例1的IR120未保留物质)的CG400分馏显示之前级 分中的糖醇。在所有级分中存在某些常见单糖(呋喃糖和吡喃糖)。二糖 类增加，然后在主要乙酸级分中显示其它单糖类(某些可能是由于酸性水 解)。有趣地是，测试的所有级分都出现糖苷酶和糖原磷酸化酶抑制。检 测到一些稀有组分。

b)亚氨基糖分馏(来自IR120吡啶和氨水级分)

从实施例1中得到的IR120结合级分，部分地纯化一些组分，进行 进一步表征。

通过GC-MS，保留时间10.37分钟的化合物与来源于DAB的结构 具有良好的匹配。

保留时间12.91和13.31分钟的化合物与可以来源于DNJ的哌啶N- 酸类型化合物具有良好的匹配。

纯化GC保留时间19.36分钟的组分-3.3mg。该组分得到与糖苷一 致的质谱数据，但是其是含有结合IR120树脂的糖苷类的稀有组分。

尝试进一步纯化桑叶生物碱和DAB类型化合物。以2.0mg的单个 级分最终获得其中一些化合物。

在级分JH0806/101/23中鉴别出2-哌啶酸类。

除了糖级分和葫芦巴碱(在NMR谱的式6中观察到的)和6-羟基葫芦 巴碱(式7)(在NMR光谱中可观察到，但是是非常微量的组分)之外，使 所有五种级分都进行酶测定。

式6

葫芦巴碱

式7

6-羟基葫芦巴碱

化合物和级分的糖苷酶测定

表6中给出了所述级分的测定结果。

糖原磷酸化酶测定结果

下表7中给出了这些测定结果：

讨论和结论

鉴别包括某些新天然化合物的亚氨基糖类是可能的，试验性地鉴别 为DAB和DNJ的N-酸类。

样品的糖级分也同时显示出糖苷酶和糖原磷酸化酶抑制作用。

糖类比如葡萄糖和蔗糖没有抑制糖原磷酸化酶或糖苷酶类。

通过GC-MS鉴别糖级分中存在的某些稀有组分，推测这些物质决 定糖苷酶类和糖原磷酸化酶的抑制作用。糖级分是高比例的未分馏的提 取物，因此可能对样品活性有显著的贡献。

尽管DAB被报道具有糖原磷酸化酶抑制作用，但是未分馏的提取物 显然具有一些亚氨基糖组分，其具有该抑制作用。

提取物中鉴别的2-哌啶酸类和葫芦巴碱不会极大地抑制糖原磷酸化 酶。DNJ和桑叶生物碱不会抑制该酶。很可能的是DAB和DNJ的N- 酸类是活性组分。

在除去DNJ、DAB和桑叶生物碱之后，提取物中的许多组分也抑制 糖苷酶类。

实施例3

对实施例2中描述的级分进行分析，得到关于样品的亚氨基糖和糖 的其它信息。

糖级分占样品的几乎一半，显示出对于多种糖苷酶和糖原磷酸化酶 的有活性。

糖类比如蔗糖、海藻糖和葡萄糖不会显著地抑制这些酶。

在该实施例中，尝试表征糖级分的活性组分，并且进一步观察其活 性。

在这点上，使用一组离子交换柱将其进一步分馏。

方法

将来自实施例1的IR120未保留级分在阴离子交换树脂CG400(OH^-型)上进行色谱分析，得到水级分(1-11)和两种乙酸级分(表5-实施例2)。 在该实施例中仍然将这些级分进一步分馏，并且进一步研究所述级分的 活性。

分析

GC-MS

其根据实施例1进行。

NMR

其根据实施例1进行。

糖苷酶测定

其根据实施例1进行。

纯化方法

糖样品的进一步分馏包括使用以OH-型和以乙酸盐型使用的强碱性 阴离子交换树脂CG400。

将各级分收集在水中，并冷冻干燥。使用1M乙酸除去保留的物质， 并且通过旋转蒸发将这些级分蒸发至几乎无水，然后冻干。

结果

为了进一步纯化糖样品和除去任何可能的无机物质，将所有样品通 过CG400(OH-型)再次进行色谱分析。将糖级分1-11合并成样品1-11， 并且也将两种乙酸样品再合并。

将两种样品都装在CG400OH-2×20cm柱上，并且收集水级分，之 后用1M HOAc进行最后洗涤以除去保留物质。级分的重量显示在下表8 中。

令人惊奇地是在第一个CG400OH-柱上未保留的样品1-11现在得 到显著重量的保留。这表明第一个柱的pH影响或可能过载。

样品1-11的未保留级分为白色半结晶物质，如前所述。

不出所料，酸样品占保留级分的大部分重量，但是少量物质未保留， 并且样品3-7具有大部分糖苷酶抑制活性。

初期的1-11级分具有白色固体半结晶物质，其没有得到GC峰，表 明是比二糖类更大的糖类。

更迟的级分显示为一些糖醇类，但是量很少。

使表8中编号为A-F的样品进行NMR分析。

使A、B、E和F也进行糖苷酶测定，将其结果制表在下表9中。

使用乙酸盐型的CG400进一步分馏CG400OH-保留的物质样品 (C和D)。

样品C(HS0804/119)与样品D(HS0804/120)都得到了良好的分 离。

C中的化合物类似于单糖和二糖糖类，但是常见糖类不会保留在 CG400上。

样品D显示某些类似的化合物，但是某些更大分子的保留时间为 约24-25分钟。

下表中给出了级分C和D的量和活性：

表10-来自在CG400乙酸盐型上分馏的酸样品C的级分重量

表11-来自在CG400乙酸盐型上分馏的酸样品D的级分的重量

样品C和D在乙酸盐柱上分馏良好。

在CG400乙酸盐型树脂的2×10cm柱上，使用5ml水级分，接着 使用1M HOAc，进一步分馏样品HS120/2，得到样品HS0804/122。

表12-来自HS0804/120/2的级分的重量

这些样品的GC-MS分析显示出分离良好和一些感兴趣的组分。

使级分5、8、10和18进行测定。

这些样品显示出令人感兴趣的稻米(rice)葡糖苷酶的选择性，其在 实施例2中制备的第一个HOAc样品中也很明显。

来自样品1-11的级分倾向于不仅赋予对稻米葡糖苷酶的良好抑 制作用，而且赋予对酵母菌酶和杆菌属酶的良好抑制作用。

HS0804/122级分的GC-MS分析显示一些可能的新组分。122/18 中的一个组分得到了亚氨基糖相当典型的质谱，并且一些其它化合物 在裂解为亚氨基糖类方面具有某些相似性。

讨论和结论

从10g PhynoRadiance样品获得5.026g的糖级分。在阴离子交换 色谱之后，通过可能的除去无机或芳香族物质之后，其减少为3.728g。 包括37％的PhynoRadiance样品的该级分具有显著的糖原磷酸化酶抑 制活性，以及有效地抑制三种α-葡糖苷酶。该实施例证实了 PhynoRadiance糖类的活性，并且确定存在一些具有活性的更大的糖 类，某些可能的糖酸类(亚氨基糖酸类)更强选择性抑制稻米α-葡糖苷 酶。

葡糖苷酶类之中活性的选择性被证实对于治疗某些病症很重要， 因为在哺乳动物系统存在许多葡糖苷酶活性，综合抑制所有葡糖苷酶 类可引起一些脱靶效应。也应当注意葡糖苷酶类的抑制剂通过伴侣活 性对于产生有缺陷的糖蛋白的细胞也可以具有有益作用；据推测这种 作用可能与抗老化性质有关(Best et al.，2010)。

继续来自实施例2的初级糖级分的糖苷酶测定，表明 PhynoRadiance糖级分显示出对大量α-葡糖苷酶类的良好抑制作用， 但是对于广泛的其它糖苷酶类没有进行试验。该抑制特性有点类似于 DNJ，但是DNJ也不抑制糖原磷酸化酶。糖分馏和测定倾向于表明保 留的组分特别地抑制稻米葡糖苷酶，而未保留的组分抑制测定的所有 三种α-葡糖苷酶。在CG400OH-保留的和未保留的级分中都发现了糖 原磷酸化酶抑制作用。

来自样品1-11的CG400OH-未保留的级分的GC-MS分析没有提 供非常有用的信息，但是NMR显示看上去是相当纯的糖类，推定为 比二糖类更大的糖类。CG400保留的组分得到了良好的GC-MS数据， 似乎相当复杂；存在某些二糖类(非蔗糖)，以及稀有糖类或亚氨基糖 类(推测具有最初保留在CG400上的羧基基团或芳香族单元)。得出结 论：糖级分包含具有有效的糖苷酶和糖原磷酸化酶活性的某些新糖类。 很可能的是，在未保留的CG400OH-级分中看到的更大糖类是新的， 并且具有结合其以赋予活性的亚氨基糖类。CG400OH-上保留的化合 物可以是从较大糖类释放的较小的单元，或者是新糖酸类。

从样品A(一种来自样品1-11的高活性未保留的CG400OH-级分) 收集的NMR数据显示良好的纯度，但是对这种较大糖类得到极少的 结构信息。

实施例4

实施例4寻求证实提取物的非亚氨基糖级分的活性.

概述

该实施例证实桑提取物中存在的DNJ和DAB的N-酸类比DAB 和DNJ对α-葡糖苷酶具有更强选择性抑制作用，并且这些化合物也 对哺乳动物β-葡糖醛酸糖苷酶、氨基已糖苷酶和α-L-艾杜糖苷酸酶良 好的抑制作用。

在包括糖尿病的一些疾病中血清β-葡糖醛酸糖苷酶和氨基已糖苷 酶类升高。

β-葡糖醛酸糖苷酶的增加可引起作为葡糖苷酸的毒素分泌较少， 从而抑制该酶，可有益于健康。

据报道，亚氨基糖类可以同时作为糖苷酶类的抑制剂和伴侣分子， 从而，也可以在低于抑制浓度下，提高被所述亚氨基糖类抑制的糖苷 酶类的活性。

DNJ和DAB的N-酸是新的分离的天然产物。

也试验性鉴别了具有脱氧糖和芳基糖苷的稀有三糖。

研究的物质

IminoNorm200ml粗提取物；和

PhynoRadiance50g批料，如在表13中列出的

表13。

分析

GC-MS

其根据实施例1进行。

NMR

其根据实施例1进行。

糖苷酶测定

其根据实施例1进行。

纯化方法

糖样品的进一步分馏包括使用以OH-型和以乙酸盐型使用的强碱 性阴离子交换树脂CG400。

如实施例3描述的，将各级分收集在水中，并冷冻干燥。

使用1M乙酸除去保留的物质，并且通过旋转蒸发将这些级分蒸 发至几乎无水，然后冷冻干燥。结果

下表14提供IminoNorm和PhynoRadiance阴离子交换树脂 (CG400)未保留的和保留的级分的α-葡糖苷酶结果(在2mg/ml的抑 制％)

使样品IminoNorm和PhynoRadiance(如在WO2011/032502中 所述稀释的提取物)另外进行：

1)阳离子交换色谱；和

2)阴离子交换色谱，如上述实施例中描述的。

阴离子交换保留的物质赋予对稻米α-葡糖苷酶的更特异性抑制作 用。

两种样品的阴离子交换树脂未保留的物质赋予更宽的α-葡糖苷酶 抑制作用。

亚氨基糖DAB和DNJ的N-酸类似乎决定特异性稻米α-葡糖苷酶 抑制(参见表16的糖苷酶)。

来自IminoNorm的阴离子交换树脂保留的物质(表15)相应地更 重(71％)可能是由于其对糖类的稀释度更大。

因此，将糖类加入到PhynoRadiance中对样品的阴离子交换未保 留的级分的重量有贡献。

然而，两种样品都具有抑制活性，从而向PhynoRadiance中加入 的糖类不必具有似乎来自桑本身的活性。

表15

DNJ为两种预分馏的提取物的主要组分。

GC-MS色谱图(和质谱)提供在图1-13中。

关于这些附图，提及下述：

图1和2为PhynoRadiance和IminoNorm粗提取物的GC-MS 色谱图。应当注意，在IminoNorm色谱图中，某些亚氨基糖以相对较 高浓度出现。一种是具有如图3所示质谱的化合物(9.5分钟)。

图4和5分别是PhynoRadiance IR120保留的(亚氨基糖级分) 1.38g和IminoNorm IR120保留的(亚氨基糖级分1)6.14g的GC-MS 色谱图。

由于亚氨基糖含量高，iminoNorm样品使阳离子交换树脂(IR120) 过载两次。

结合级分(2和3)显示在图7和8中，亚氨基糖类的某些优先转移 是显然的。碱性亚氨基糖比中性或酸性亚氨基糖类更易于转移。

在PhynoRadiance中仅仅勉强看到的两种相关的亚氨基糖在 IminoNorm IR120结合级分1中是相当多的。这可用于纯化和鉴别那 些亚氨基糖类(8.72和9.49分钟)。

选择性转移也允许进一步表征DAB和DNJ的三种N-酸类，其为 新天然产物。这些N-酸类也出现在PhynoRadiance中。

图6a和b为来自IminoNorm还没有鉴别的两种亚氨基糖的质谱。

图7a为IminoNorm IR120保留的(亚氨基级分2)23g的GC-MS 色谱图，图7b为桑叶生物碱的质谱。

DNJ目前是IR120上第二个IminoNorm保留的级分中主要的亚 氨基糖。在7.4分钟的亚氨基糖是桑叶生物碱。

图8a为IminoNorm IR120保留的(亚氨基级分3)25.5g的 GC-MS色谱图。图8B和8C为羟基化2-哌啶酸的两种质谱。

在IminoNorm的第三个IR120保留的级分中，羟基化的2-哌啶 酸比DNJ更多。它们的质谱及实施例2中鉴别的一种显示如下。在 3.59分钟的主要组分可以是苯丙氨酸。

图9为PhynoRadiance中DNJ的N-乙酸(tms)的质谱；

图10为来自PhynoRadiance的DAB-N-乙酸(tms)的质谱；

图11为在IminoNorm的DNJ的N-乙酸(tms)的质谱；.

图12为来自IminoNorm的DAB-N-乙酸(tms)的质谱；和

图13为IminoNorm中DNJ的N-丙酸(tms)的质谱。

这些酸的分子式为下述式8至10中图解的：

式8

DAB的N-乙酸

式9

DNJ的N-乙酸

式10

DNJ的N-丙酸

DAB和DNJ的N-酸类在没有浓缩的PhynoRadiance提取物中可 见，但是在IminoNorm中更不明显。然而，它们在两种样品中都存 在。

这些新分离的酸类的活性显示在下表14中。

亚氨基糖N酸类的糖苷酶结果(0.8mM的抑制％)

DNJ-N-丙酸对于牛类动物肝β-葡糖醛酸糖苷酶具有的IC₅₀为 340uM，且对于人重组α-L-艾杜糖苷酸酶具有的IC₅₀为383uM。

DAB-N-乙酸对于β-葡糖醛酸糖苷酶具有的IC₅₀为523uM，且对 于艾杜糖苷酸酶具有的IC₅₀为196uM。

DNJ-乙酸对于牛类动物β-葡糖醛酸糖苷酶具有的IC₅₀为208uM， 但是仅仅在0.8mM下很弱地抑制艾杜糖苷酸酶。

讨论和结论

实施例4证实一旦除去DNJ，PhynoRadiance和IminoNorm的 糖苷酶抑制特性存在很大的类似性。

在两种样品中都存在DNJ和DAB的N-酸类，与DAB和DNJ相 比，这两种样品赋予对α-葡糖苷酶的更强选择性抑制作用，但是这些 化合物也赋予对哺乳动物β-葡糖醛酸糖苷酶、氨基已糖苷酶和α-L- 艾杜糖苷酸酶的良好抑制作用。

包含这些化合物的选择性级分显然可用作药物和食物成分。

在包括糖尿病和阿尔茨海默病的一些疾病中，血清β-葡糖醛酸糖 苷酶和氨基已糖苷酶类升高了。β-葡糖醛酸糖苷酶的升高可导致作为 葡糖苷酸类的毒素的分泌较少，因而抑制该酶可有益于健康。据报道， 亚氨基糖类可以同时作为糖苷酶类的抑制剂和伴侣分子，从而也可以 在低于抑制浓度下，提高被所述亚氨基糖类抑制的糖苷酶类的活性。

DNJ和DAB的N-酸类是新天然产物。

根据实施例可以得出结论：在PhynoRadiance和IminoNorm中 都存在一些有助于糖苷酶抑制的化合物。这些化合物包括DNJ、 DAB、桑叶生物碱、羟基化2-哌啶酸、DAB和DNJ的N-酸类，以及 至今仍未表征的其它亚氨基糖类。芳基糖苷和包括三糖的糖类也可赋 予糖苷酶类和糖原磷酸化酶的抑制作用。

因此，选择性水溶性的桑提取物富含羟基化2-哌啶酸类、DAB和 DNJ的N-酸类，并且其包含显著降低水平的亚氨基酸DNJ、DAB和 桑叶生物碱，或者基本上纯的羟基化2-哌啶酸类、DAB和DNJ的N- 酸类可用于药物中。所述酸类包括N-乙酸化DAB和N-乙酸化DNJ。

实施例5

方法学∶

在急性糖激发ddy小鼠模型中评价本发明的提取物(PYN8)降低 进食后血糖波峰的功效。将十只小鼠分成两组，处理组和安慰剂组。 动物口服接受2.5g/kg体重的麦芽糖，与500mg/kg的PYN8(活性组) 或生理盐水(对照)。在时间点0、15分钟、30分钟、60分钟和120分 钟测量血糖浓度以评价对麦芽糖摄入之后降低血糖的任何作用。

结果∶

本发明的提取物显示出显著地降低麦芽糖激发之后的血糖水平， 如图14中图解的。

结论∶

体内研究证实了体外发现：本发明的提取物可以显著地降低进食 后血糖水平。所述提取物抑制多种参与葡萄糖代谢的葡糖苷酶酶类。 体内研究表明提取物是生物可利用的，并且不会被胃酸、胃酶或活性 代谢所灭活。