一株木质素耐受性酿酒酵母菌及其在生物乙醇生产中的应用

技术领域

本发明属于本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一株木质素耐受性酿酒酵母菌 及其在生物乙醇生产中的应用。

背景技术

秸秆、树木边材、牧草等木质纤维素材料是地球上储量最丰富且可持续再生的有机 物资源，其年产约1500亿吨，所含的能量是全世界年消耗能量总和的10倍(刘刚,沈 镭.中国生物质能源的定量评价及其地理分布[J].自然资源学报.2007,41(3):9～19)。 以木质纤维素为原料的生物乙醇生产和利用被认为是解决能源、环境和粮食问题的有效 途径之一。世界各国都在着力开发木质纤维素生物乙醇生产过程的共性关键技术和专用 设备，以积极推进生物能源产业的发展。

木质纤维素生物乙醇生产过程一般包括原料预处理、酶解、乙醇发酵和乙醇精制 等主要步骤。预处理是为了破坏木质纤维素材料的结构,从而取得良好的纤维素水解效 果(曾凡洲,蒋剑春,卫民,等.生物质水解发酵生产燃料乙醇的研究进展[J].生物质化 学工程,2009,43(2):43-48)；酶解是指利用纤维素酶和半纤维素酶，将纤维素、半纤维 素转化为可发酵性糖；乙醇发酵是指利用酿酒酵母，将酶解液中的可发酵性糖转化为乙 醇。然而，在木质纤维素材料的预处理及酶解过程中，木质素会降解成小片段、以及阿 魏酸、香草醛、紫丁香醇、对羟基苯基醛(醇)等成分。因为这些木质素成分对酿酒酵 母具有毒性，所以木质纤维素水解液的乙醇发酵效率受到严重抑制(李文莉，缪冶炼， 陈介余，花卫俊，邵慧丽.木质素降解物对酿酒酵母的毒性及作用机理，生物加工过程， 2014；Ezeji T,Qureshi N,Blaschek H P.Butanol production fromagricultural residues:impact  of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation[J]. Biotechnol Bioeng,2007,97:1460-1469)。

为了提高木质纤维素水解液的乙醇发酵效率，人们尝试了对木质纤维素水解液进行 发酵前的脱毒处理。脱毒处理方法可以分为物理法、化学法和生物法。目前，物理法包 括活性炭吸附(Wang L,Chen H Z.Increased fermentability of enzymatically hydrolyzed  steam-exploded corn stover for butanol production by removal of fermentation inhibitors[J]. Process Biochemistry,2011,46:604-607)、离子交换吸附(Larsson S,Reimann A,L,et al.Comparison of different methods for the detoxification of lignocellulosic  hydrolysates of spruce[J].Appl Microbiol Biotechnol,1999b,77:91-103)、膜分离(黄洲， 缪冶炼，陈介余，李文莉.溶液中木质素和葡萄糖的超滤分离，生物加工过程, 2014,12(2):56-62)；化学法利用NH4OH、NaOH、Ca(OH)2和木质素降解物的反应(Qureshi  N,Saha B C,Hector R E,et al.Production of butanol(a biofuel)from agricultural residues: Part II-Use of corn stover and switchgrass hydrolysates[J].Biomass Bioenergy,2010,34: 566-571)；生物法利用漆酶、过氧化物酶催化木质素降解物的聚合反应(薛珺,蒲欢,孙 春宝.纤维素稀酸水解产物中发酵抑制物的去除方法[J].纤维素科学与技术,2004, 12(3):48-52；Cho D H,Lee Y J,Um Y,et al.Detoxification of model phenolic compounds in  lignocellulosic hydrolysates with peroxidase for butanol production from Clostridium  beijerinckii[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,83:1035-1043)。但是，这些方法存在 处理成本高、毒性成分去除率低、糖损失大等问题，因而其产业化应用程度不高。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株同时具有较强的木质素耐受能力和乙醇发酵能力的 酿酒酵母菌LTY-1(Saccharomyces cerevisiae LTY-1)。本发明以酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)CGMCC2.1429为原始菌，利用紫外诱变结合定向驯化、筛选的方法获得 酿酒酵母菌株LTY-1。

为实现该目的，本发明采用的技术方案如下：

一株耐受木质素的酿酒酵母菌，其特征在于，其分类命名为酿酒酵母LTY-1 (Saccharomyces cerevisiae LTY-1)，已于2014年5月6日保藏于中国典型培养物保藏 中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2014184。

本发明的第二目的是提供上述权利要求1所述的酿酒酵母菌株LTY-1在生产乙醇中 的应用。

该应用的具体技术方案如下：

(1)种子培养：将酿酒酵母菌LTY-1在种子培养基、30℃、180rpm条件下培养 至对数中期，作为种子液；

(2)乙醇发酵：将种子液按10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角 瓶中，在摇床上进行乙醇发酵。

进一步的，所述步骤(2)中初始糖浓度220-260g/L，发酵时间36-40h，发酵温度 30-33℃，摇床转速150-175rpm。

进一步的，所述步骤(2)中初始糖浓度为242g/L、发酵时间36h、发酵温度30℃、 摇床转速150rpm。

进一步的，所述步骤(2)中，发酵培养基还含有木质素或木质素成分。

进一步的，所述的木质素在发酵培养基中的浓度为4.3g/L。

进一步的，所述木质素成分包括紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛中的一种或多种。

进一步的，所述的紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛在发酵培养基中的浓度各为 1.44g/L。

本发明的有益效果：

本发明的酿酒酵母LTY-1有较强的木质素耐受能力和乙醇发酵能力，当采用葡萄糖 242g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉61g/L、pH5.5的发酵培养基，在30℃、150rpm条件 下发酵36h，酿酒酵母LTY-1的糖转化率更是高达84.4％。当发酵培养基含有紫丁香醇、 对羟基苯甲醛和香草醛等木质素成分，且各成分的浓度均为1.44g/L时，酿酒酵母LTY-1 的糖转化率仅仅降低了7.0％，糖向乙醇的转化率仍有77.4％。其降低程度远远小于原始 酵母的18.5％，具有较强的木质素耐受性。为改善木质纤维素水解液乙醇发酵效率提供 了核心技术和材料。本发明技术可应用于木质纤维素为原料的生物乙醇生产，对促进生 物乙醇生产的产业化发展、以及环境保护、粮食安全保障具有重要意义。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1：表示紫外诱变中的细胞存活率曲线。

图2：突变株MS-W驯化过程中的菌液OD值变化(a、b、c、d、e、f分别表示各木 质素成分浓度为0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5g/L的培养阶段)。

图3：突变株MS-P驯化过程中的菌液OD值变化(a、b、c、d、e、f分别表示各木质 素成分浓度为0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5g/L的培养阶段)。

图4：表示酿酒酵母LTY-1在种子培养基中的生长曲线。

图5：乙醇发酵过程中酿酒酵母LTY-1和原始酵母的发酵液OD值变化(○酿酒酵母 LTY-1，△原始酵母)。

图6：乙醇发酵过程中酿酒酵母LTY-1和原始酵母的糖转化率和残糖浓度变化(○酿酒 酵母LTY-1的糖转化率，●酿酒酵母LTY-1的残糖浓度，△原始酵母的糖转化率， ▲原始酵母的糖转化率)。

本发明提供的能耐受木质素毒性的酿酒酵母菌LTY-1(Saccharomyces cerevisiae  LTY-1)，已于2014年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地 址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2014184。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施 例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法的条件。本发明对常规方 法的做了进一步优化，以得到最优的技术效果。

实施例1 本实施例说明本发明所述的Saccharomyces cerevisiae LTY-1的筛选方法。

本发明筛选中采用的培养基为：

(1)液体YPD培养基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L,自然pH。

(2)固体YPD培养基：在液体YPD培养基中加入琼脂20g/L。

(3)固体再生培养基：在液体YPD培养基中加入琼脂20g/L、蔗糖170g/L。

(4)种子培养基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。

(5)发酵培养基：酵母浸粉61g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖350g/L，自然pH。

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.1429(中国普通微生物保藏中心) 为原始酵母菌种。菌种购入后，从安瓿管转接至斜面YPD培养基上，于30℃的生化培 养箱中培养48h，连续传两代，进行菌种活化。菌种活化后，在4℃条件下保藏待用。

具体筛选步骤如下：

1、采用紫外诱变箱对原始酵母的单倍体全细胞及其原生质体进行诱变。紫外灯功 率为15w，灯下垂直距离30cm处有磁力搅拌器，诱变箱体积为50cm×30cm×30cm。

(1)全细胞诱变

将酵母单倍体全细胞在50ml液体YPD培养基中振荡培养(30℃、180rpm、12h) 至对数早期，取5mL适当稀释的菌液(其细胞浓度为10⁶个/mL)于直径为9cm的灭菌 培养皿中，在每个培养皿中放一个回形针并置于紫外诱变箱内的磁力搅拌器上，边搅拌 边进行紫外线照射处理。紫外线照射时间分别设定为40、80、120、160、200、240、 280、320、360s。紫外线照射处理后，取菌液1mL涂布在平板YPD培养基上，每组样 品涂5-10个平板，避光条件下30℃培养48h，测定菌落数(即活细胞数)。紫外诱变 中的细胞存活率由下式计算：

(2)原生质体诱变

将适量的酵母原生质体液用高渗PB溶液稀释到一定浓度，取5mL适当稀释的悬液 在(其原生质体浓度为106个/mL)直径为9cm的灭菌培养皿中，在每个培养皿中放一 个回形针并置于紫外诱变箱内的磁力搅拌器上，边搅拌边进行紫外线照射处理。紫外线 照射时间分别设定为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、240s。紫外线 照射处理后，取1mL原生质体液涂布于平板再生培养基上，每组样品涂5-10个平板， 避光条件下30℃培养48h，测定菌落数(即活细胞数)。紫外诱变中的细胞存活率由式 (1)计算。

2、定向驯化

将通过紫外照射处理得到的突变株用无菌生理盐水(0.9％)洗脱菌落，稀释适当的 倍数，按照10％的接种量全部转接至种子培养基中30℃、180rpm振荡培养12h。将种 子培养基中的突变株转接至平板YPD培养基上，30℃培养48h，编号保存。将各菌株 转接至50mL种子培养基中，30℃、180rpm振荡培养至稳定期，然后按照10％的接种 量接种到含木质素成分(紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛)的液体YPD培养基中， 30℃、180rpm培养至稳定期前期，作为一次驯化。每个木质素浓度条件下的驯化重复 三次。驯化中，菌液OD值采用紫外分光光度计(752S型，上海棱光技术有限公司)测 定。驯化全部结束后，将菌液涂布在平板YPD培养基上，分离单菌落。

(1)木质素耐受能力测定

将驯化后的突变株分别接种至各木质素成分的浓度为1.44g/L的液体YPD培养基 中，30℃、180rpm振荡培养24h。采用血小板计数法计出试样中的活细胞数，计算细 胞死亡率。测定前，取酵母菌液0.1ml和美蓝液0.9ml于试管中，染色10min。

(2)乙醇发酵能力测定

将驯化后的突变株分别接入50mL种子培养基，30℃、180rpm条件下培养至对数期， 按照10％接种量将种子液加入到发酵培养基中进行36h发酵。发酵结束后，采用生物传 感器(SBA-40C，山东省科学院生物研究所)测定发酵液的乙醇和残糖浓度，计算糖向 乙醇的转化率。每组实验设置三个平行，取平均值。

图1表示紫外诱变中的细胞存活率曲线。全细胞存活率在照射时间小于160s时随 照射时间的延长而逐渐降低，在160～280s范围内基本稳定在10％，在280s以后进一 步下降。原生质体细胞存活率随照射时间的变化曲线呈马鞍形，在160s时出现了马鞍 的峰值。由此可见，全细胞和原生质体都在160s时发生了突变。取照射时间160s的全 细胞和原生质体突变株，分别命名为MS-W，MS-P。

图2和图3分别表示突变株MS-W、MS-P驯化过程中的菌液OD值变化。如图2 所示，对于突变株MS-W来说，在各木质素成分(紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛) 的浓度为0.25g/L时，到达稳定期需要的时间为20h，最大菌液OD值为7.8；当各木质 素成分浓度为1.0g/L时，达到稳定期所需要的时间变长，最大菌液OD值减小到4.1； 当各木质素成分的浓度上升到1.0～1.5g/L范围时，最大菌液OD值逐渐升高，其最大 值达到10.1。如图3所示，对于突变株MS-P来说，在各木质素成分的浓度为0.25g/L 时，达到稳定期的时间为24h，最大菌液OD值为8.1；当各木质素成分的浓度为1.0g/L 时，最大菌液OD值减小到4.0；当各木质素成分的浓度上升到1.0～1.5g/L范围时，最 大菌液OD值逐渐升高，其最高值达到9.8。

3、筛选

驯化后的2组突变株MS-W、MS-P分别在平板YPD培养基上划线分离，每组突 变株分离出5株菌，命名为MS-W-D1、MS-W-D2、MS-W-D3、MS-W-D4、MS-W-D5 和MS-P-D1、MS-P-D2、MS-P-D3、MS-P-D4、MS-P-D5。

3.1.2.3突变株的木质素耐受和乙醇发酵能力

表1表示突变株的木质素耐受和乙醇发酵能力比较。突变株MS-W-D1、MS-W-D4、 MS-W-D5和MS-P-D1、MS-P-D2、MS-P-D5的细胞死亡率相对较低，分别为20.7％、 32.7％、24.3％和23.8％、31.3％、25.9％。

表1 突变株的细胞死亡率与乙醇发酵能力比较

在突变株MS-W-D1、MS-W-D4、MS-W-D5和MS-P-D1、MS-P-D2、MS-P-D5的 乙醇发酵实验中，MS-W-D1的糖转化率最高，达到66.7％。该MS-W-D1的糖转化率远 远高于同样发酵条件下原始酵母的糖转化率54.9％。乙醇发酵中的糖转化率与酵母细胞 死亡率存在密切关系，酵母细胞死亡率越低，糖转化率越高。

因此，将突变株MS-W-D1作为木质素耐受性酿酒酵母菌LTY-1，保藏于中国典型 培养物保藏中心保藏(保藏编号：CCTCC M2014184)。

实施例2 本实施例说明酿酒酵母LTY-1在不同初始糖浓度、发酵时间、发酵温度和摇 床转速条件下的乙醇发酵能力。

1)酵母菌种

(1)原始酵母菌种(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.1429：由中国微生物菌种 保藏管理中心提供。

(2)木质素耐受性酿酒酵母菌LTY-1：由本发明人培育。

2)培养基

(1)种子培养基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。

3)酿酒酵母LTY-1的生长曲线测定

用250mL锥形瓶分装50mL种子培养基，将酿酒酵母菌LTY-1从斜面YPD培养基 分别转接至种子培养基中，在30℃、180rpm条件下培养48h。培养过程中，每隔2h 取出锥型瓶一个，取样1mL，稀释一定倍数后，采用紫外分光光度计(752S型，上海 棱光技术有限公司)和石英比色皿测定菌液在600nm处的OD值。

图4表示酿酒酵母LTY-1在种子培养基中的生长曲线。由图可见，该酿酒酵母的生 长在10～30h内处于对数期，30h后为稳定期。

4)乙醇发酵

种子培养：将酿酒酵母菌LTY-1在种子培养基、30℃、180rpm条件下培养至对数 中期，作为种子液。

乙醇发酵：将种子液按10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶 中，在摇床上进行乙醇发酵。乙醇发酵条件：初始糖浓度分别为220、242、260g/L；发 酵时间分别为36、40h；发酵温度分别为30、33℃；摇床转速分别为150、170rpm。

发酵结束后，采用生物传感器(SBA-40C，山东省科学院生物研究所)测定发酵液 的乙醇和糖浓度，计算糖向乙醇的转化率。

乙醇发酵结果如下：

(1)在初始糖浓度260g/L、发酵时间40h、发酵温度30℃、摇床转速150rpm的条 件下，采用酿酒酵母LTY-1得到的糖转化率为69.4％。

(2)在初始糖浓度242g/L、发酵时间36h、发酵温度30℃、摇床转速150rpm的条 件下，采用酿酒酵母LTY-1得到的糖转化率为84.4％。

(3)在初始糖浓度220g/L、发酵时间36h、发酵温度33℃、摇床转速170rpm的条 件下，采用酿酒酵母LTY-1得到的糖转化率为68.5％。

(4)在初始糖浓度242g/L、发酵时间36h、发酵温度30℃、摇床转速150rpm的条 件下，采用原始酵母CGMCC2.1429得到的糖转化率为63.7％。

实施例3 本实施例说明酿酒酵母LTY-I在含木质素成分发酵培养基中的乙醇发酵能力。

1)酵母菌种

(1)原始酵母菌种(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.1429：由中国微生物菌种 保藏管理中心提供。

(2)木质素耐受性酿酒酵母菌LTY-1：由本发明人培育。

2)培养基

(1)种子培养基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。

(2)木质素发酵培养基：酵母浸粉61g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖242g/L、紫丁香醇 1.44g/L、对羟基苯甲醛1.44g/L、香草醛1.44g/L，pH5.5。

3)乙醇发酵

种子培养：将酿酒酵母菌LTY-1在种子培养基、30℃、180rpm条件下培养至对数 中期，作为种子液。

乙醇发酵：将种子液按10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶 中，在30℃、150rpm条件下乙醇发酵36h。

发酵过程中，每隔5h取发酵液，采用紫外分光光度计(752S型，上海棱光技术有 限公司)测定发酵液在600nm处的OD值，采用生物传感器(SBA-40C，山东省科学院 生物研究所)测定发酵液的乙醇和糖浓度，计算糖向乙醇的转化率。

图5、图6分别表示木质素发酵培养基乙醇发酵过程中酿酒酵母LTY-1和原始酵母 的发酵液OD值、糖转化率、残糖浓度变化。由图5可知，酿酒酵母LTY-1和原始酵母 的最大发酵液OD值分别为21.2、14.4，达到最大发酵液OD值的时间分别为10、21h。 这表明，酿酒酵母LTY-1的生长远远快于原始酵母。由图6可知，在发酵过程中，酿酒 酵母LTY-1和原始酵母的糖转化率随时间的延长在逐渐升高，残糖浓度逐渐降低。发酵 液中的糖基本消耗完毕(36h)时，酿酒酵母LTY-1的糖转化率为77.4％，远远高于原 始酵母的45.2％。

此外，在发酵培养基不含木质素成分的条件下，酿酒酵母LTY-1和原始酵母的糖转 化率分别为84.4％和63.7％(见实施例2)。与此相比，酿酒酵母LTY-1在木质素发酵 培养基乙醇发酵中的糖转化率仅仅降低了7.0％，而原始酵母则降低了18.5％。由此可见， 酿酒酵母LTY-1不但具有较强的乙醇发酵能力，而且具有较强的木质素耐受能力。

实施例4 本实施例说明酿酒酵母LTY-I在木质素发酵培养基中的乙醇发酵能力。

1)酵母菌种

(1)原始酵母菌种(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.1429：由中国微生物菌种 保藏管理中心提供。

(2)木质素耐受性酿酒酵母菌LTY-1：由本发明人培育。

2)培养基

(1)种子培养基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。

(2)木质素发酵培养基：酵母浸粉61g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖242g/L、木质素 4.3g/L。

3)乙醇发酵

种子培养：将酿酒酵母菌LTY-1在种子培养基、30℃、180 rpm条件下培养至对数 中期，作为种子液。

乙醇发酵：将种子液按10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶 中，在30℃、150rpm条件下乙醇发酵36h。

发酵过程中，每隔5h取发酵液，采用紫外分光光度计(752S型，上海棱光技术有限公 司)测定发酵液在600nm处的OD值，采用生物传感器(SBA-40C，山东省科学院生物 研究所)测定发酵液的乙醇和糖浓度，计算糖向乙醇的转化率。

发酵液中的糖基本消耗完毕(36h)时，酿酒酵母LTY-1的糖转化率为81.0％，远 远高于原始酵母的56.3％。