一种端粒酶永生化牛甲状腺细胞系及其用途

技术领域

本发明涉及一种牛甲状腺细胞系及其用途和制备方法，确切讲本发明涉及一种端粒酶永生化牛甲状腺细胞系。 

背景技术

口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）是属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的单股正链RNA病毒，可感染偶蹄类动物并导致以口部、鼻子和蹄部等部位出现水泡为特征的急性、热性、高度传染性疾病。FMD被OIE列为法定必报病，在我国属于一类病，是危害畜牧业健康发展的“头号疫病”。 

目前，口蹄疫病毒分离、检测、培养以及研究最为成功的实验模型体系主要是乳鼠和仓鼠肾细胞系（BHK-21），其次是猪肾细胞系IBRS-2和PK-15。这些体系对不同毒株的敏感度各不相同，而且因为跨种分离培养，会引起病毒变异。有研究人员在牛源口蹄疫病毒分离检测时发现，病毒在原代牛甲状腺细胞（BTY）上的滴度比在上述其他体系中滴度更高，原代牛甲状腺细胞对口蹄疫病毒的敏感程度也比其他细胞高100-1000倍,参见：W.A.Snowdon,1966.Growth of Foot-and-mouth Disease Virus in Monolayer Culture of Calf Thyroid Cells.目前牛甲状腺细胞已经被用于口蹄疫查毒实验以及恶性卡他热等病毒的分离和研究。然而，原代BTY细胞可传至6-10代，随着增殖或冻存会使其敏感程度降低，在诊断和科学研究过程中，每次制备原代BTY细胞要宰杀胎牛来获取取甲状腺组织，不仅违背“动物福利”的初衷，而且是一项非常费时费力的工作，且批次之间往往差异较大。因此，以原代BTY细胞为基础，构建一个与原代BTY细胞特性一致的细胞系则能够为FMDV的分离培养、检测诊断以及基础研究提供极大的便利。 

对FMDV的致病性研究主要针对牛和猪。牛FMD通常是通过呼吸道传播途径传播病毒而感染，病毒感染复制的初始部位是肺部或咽部，随即病毒快速分散到口腔、蹄上皮部位。反刍动物感染FMDV后，经过严重感染阶段有些动物可转归为持续感染状态。免疫动物在感染病毒后，也有可能转变为持续性感染动物。反刍动物的咽喉部(包括软颚)是FMDV持续感染部位，从FMD康复期的牛的食道-咽喉部(esophageal/pharyngeal，O/P)刮取液中可以分离到活的FMDV。猪通常通过饲喂被FMDV污染的饲料或直接接触FMD感染动物或圈养过病畜的动物舍等而受感染。通过空气传播途径牛比猪更为易感，但猪感染后排毒量比牛或羊感染后排出的病毒量多。FMDV的不断进化造成其宿主嗜性、毒力以及抗原性等多种表型发生变异，形成大量表型各异的毒株，部分毒株出现与传统毒株不同的致病特性，不仅对牛羊具有严重的致病性，而且还具有对猪有很强的感染和致病性。若要深入比较阐明病毒的复制动力学、感染致病性以及调控和信号转导机制，除了动物本体实验，一个良好的体外研究模型是必不可少的，然而目前没有一种能够感染FMDV的牛源细胞系，因此构建一株能够感染FMDV的牛体细胞系是非常有必要的。 

发明内容

本发明提供一种能够感染FMDV的牛源细胞系，该细胞系可作为FMDV对牛的致病性研究的一个优良模型，并可用于分离、检测和培养口蹄疫病毒，或者制备口蹄疫病毒检测试剂。 

本发明的牛甲状腺细胞系被命名为hTERT-BTY，并于2014年6月19日在中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏号为CCTCC No：C2014109。 

本发明的细胞系可用于分离、检测和培养口蹄疫病毒。 

本发明的细胞系也可用作口蹄疫病毒的牛源体外研究模型，或者用于制备口蹄疫病毒检测试剂。 

本发明的细胞系的构建方法包括以下步骤： 

（1）分离并培养原代犊牛甲状腺细胞；

（2）在原代犊牛甲状腺细胞中转染pCIneo-hTERT质粒；

（3）抗生素筛选获得能够稳定传代的犊牛甲状腺细胞并扩大培养。

在本发明的端粒酶永生化的犊牛甲状腺细胞的构建方法中，其步骤（1）中的原代犊牛甲状腺细胞是从0-24h龄健康犊牛甲状腺组织上分离培养的细胞。原代细胞培养取材对组织类型、分化程度、年龄等均有要求，一般胚胎组织较个体组织容易培养，分化低的较分化高的容易培养。由于牛的活胚胎很难获得，因此我们选用组织细胞分化程度较低的0-24h龄犊牛进行甲状腺细胞分离培养。 

本发明的端粒酶永生化的犊牛甲状腺细胞系的构建方法中其步骤（2）中转染的质粒为pCIneo-hTERT。该质粒是将人端粒酶反转录酶基因连接到pCIneo载体（一种哺乳动物细胞稳定表达载体，为G418抗性）上构建而成，转染哺乳动物细胞能够使该细胞稳定表达端粒酶。细胞缺乏端粒酶导致分裂过程中端粒长度不断丢失是细胞衰老的主要机制之一，而导入外源性端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）基因可诱导细胞内端粒酶的活性，这样就可以使端粒长度保持稳定，延长细胞生存期并增强细胞增殖能力。激活端粒酶诱导细胞永生化类似于胚胎干细胞内存在的生理途径，最终能够获得与原代甲状腺细胞生物学行为接近、性状相对稳定的永生化细胞系。 

本发明的端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞系的构建方法中其步骤（3）中筛选阳性克隆是采用G418药物进行筛选，转染24h后加压筛选抗生素浓度为400μg/mL，筛选时间为15天；挑取单克隆后筛选抗生素浓度为200μg/mL。加压筛选浓度是通过BTY细胞的G418 杀伤曲线确定的，具体方法是未经转染的正常BTY细胞达到80%融合时加入含有G418的培养基，使用的G418浓度分别为50、100、200、400、800μg/mL，每隔3天换含相应浓度G418的新鲜培养基。连续培养两周时细胞全部死亡所需的最低G418浓度为筛查阳性克隆所用的浓度。本实验中确定的筛选浓度为400μg/mL，这样就能保证在不杀死阳性细胞的情况下最大程度的杀死阴性细胞。单克隆出现后G418浓度减半继续筛选，直到细胞维持稳定的G418抗性。 

在本发明的端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞系的构建方法中，对犊牛甲状腺细胞系特征基因促甲状腺激素受体基因TSHR以及钠/碘转运子NIS检测方法是通过RT-PCR进行的，所使用的扩增引物分别为：SEQ ID No,1、SEQ ID No,2、SEQ ID No,3和SEQ ID No,4。以上引物是根据牛TSHR和NIS全基因序列设计的，分别检测这两个基因中的其中一段，PCR产物测序后与全基因序列进行比对，比对结果同源性均为95%以上。 

本发明具有以下有益效果： 

（1）细胞缺乏端粒酶导致分裂过程中端粒长度不断变短，这是细胞衰老的主要机制之一，外源性导入端粒酶逆转录酶基因可诱导细胞内表达端粒酶，从而使端粒长度保持稳定不变，延长细胞的生存期并增强细胞的增殖能力。端粒酶诱导细胞永生化的方法是一种类似于胚胎干细胞原理的接近生理过程的途径，使细胞发生不可预知的突变的可能性较小，这样就为获得理想的FMDV体外研究模型提供了有力的保障。本发明是选取人端粒酶催化亚单位hTERT转染原代牛甲状腺细胞激活端粒酶的方法构建牛甲状腺细胞系，本发明的细胞系仍然保持原代牛甲状腺细胞的特性，能够高水平表达牛甲状腺特异性基因。

（2）染色体核型分析显示本发明的永生化细胞系为正常体细胞，未发生染色体数目和结构的畸变，呈现锚着依赖和接触抑制等安全性。 

（3）口蹄疫病毒可在本发明的细胞上复制增殖，因此该细胞系可用于动物组织或水泡液等样品中的FMDV田间毒株的分离检测。 

（4）研究发现，动物体内实验中一株对猪和牛致病性不同的FMDV毒株在hTERT-BTY细胞系和另外一株猪源细胞系上的复制情况与动物实验一致。因此本发明的细胞系可作为FMDV的体外研究模型；也可以用来大量扩增FMDV病毒作为疫苗或诊断的抗原。 

附图说明

图1为实施例1原代牛甲状腺细胞的形态学观察（普通光镜100×）。 

图2为实施例1 hTERT-BTY细胞形态学观察（普通光镜100×）。图2A为第五代形态；2B为第三十代形态。 

图3为实施例1第30代hTERT-BTY甲状腺特异基因TSHR和NIS检测PCR产物凝胶电泳图。在图3中，M：100-2000bp的DNA marker；TSHR：TSHR片段扩增产物，1.951kb；NIS：NIS片段扩增产物， 333bp。 

图4为实施例1第30代hTERT-BTY细胞的染色体分析（GTG-Band染色）。其中：图4A1为原代BTY细胞染色体核型（对照）；图4A2为原代BTY细胞GTG-Band染色；图4B1为第30代hTERT-BTY细胞的染色体核型；图4B2为 第30代hTERT-BTY细胞GTG-Band染色。 

图5为实施例2 FMDV/O/mya98毒株感染hTERT-BTY细胞形成CPE情况（普通光镜100×）。其中：图5A:正常对照细胞；图5B:感染FMDV/O/mya98毒株细胞。 

图6为实施例2  A、B、C三株不同的FMDV毒株在hTERT-BTY细胞上的复制情况。 

图7为实施例2流式细胞仪检测FMDV/O/mya98毒株诱导hTERT-BTY细胞发生凋亡情况。其中：图7A：正常对照细胞凋亡情况；图7B：感染FMDV/O/mya98毒株细胞凋亡情况。其中横坐标为FITC荧光强度，纵坐标为PI荧光强度。Q1为机械误差；Q2为晚期凋亡细胞；Q3为正常细胞；Q4为早期凋亡细胞。 

图8为实施例2流式细胞仪检测三株不同的FMDV毒株诱导hTERT-BTY细胞发生凋亡情况。其中：图8A：0.015 MOI剂量的A、B、C三株毒株诱导细胞凋亡情况；图8B：0.025 MOI剂量的A、B、C三株毒株诱导细胞凋亡情况。 

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。 

实施例1 犊牛甲状腺原代细胞的分离培养以及端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞系的构建及生物学特性检测 

一 原代培养

中国荷斯坦奶牛，雄性，1日龄，放血处死后取甲状腺连同喉头和一段气管一起取出，低温下送入实验室；将组织清洗后放入75%的酒精中消毒10分钟，剪去外膜及筋腱组织，用加有双抗的PBS清洗两次，称净重，一般为10-15g，剪成小米粒大小，越小越好；按净重每克组织加6~8ml 0. 25%的胰酶溶液，上下翻转使液体与组织充分接触；37℃震荡消化40~60min，弃去第一次的消化液，收集以后每次的消化液，每次消化完毕，再加胰酶溶液继续消化剩余组织，如此重复2- 3次, 至上清液清亮；收集的细胞分装至25mL细胞培养瓶中，向瓶内加入DMEM-F12完全培养液（含10%胎牛血清，0.01IU/mL 促甲状腺激素，5μg/mL牛胰岛素，5μg/mL转铁蛋白，2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素G、100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B）37℃ 5%的二氧化碳温箱培养。

该原代犊牛甲状腺细胞主要呈梭型，见图1。 

二 细胞系建立方法 

具体步骤为：待原代甲状腺细胞生长至80%融合，即可进行转染。采用Lipofectamine 2000转染试剂盒按照说明书进行常规转染，每瓶细胞转染pCIneo-hTERT质粒 8μg，转染6h后换完全培养基（无抗生素）进行培养。转染24h后按照1:10的比例传代培养，完全培养基中加入400μg/mL G418抗生素进行加压筛选，筛选过程中每3天更换含G418的新鲜培养基，并移除死亡的细胞及细胞碎片。筛选15天后，挑取单克隆用含200μg/mL G418抗生素的完全培养基进行培养。待细胞正常生长时换取不含筛选抗生素的正常完全培养基进行培养、传代。

hTERT-BTY细胞系第5代和第30代形态如图2所示。 

三 hTERT-BTY细胞系生物学特性检测（以下生物学特性检测实验所用细胞均为第30代端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞。） 

（一）细胞形态：第30代的hTERT-BTY细胞系的细胞呈梭型，与原代犊牛甲状腺细胞形态相同。

（二）hTERT-BTY细胞系特异性基因鉴定。 

收集新鲜培养的端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞，用Trizol裂解细胞，氯仿和异丙醇提取总RNA。用随机引物逆转录获得cDNA。根据Genebank中牛TSHR（Gene ID 281553）和NIS（Gene ID 505310）全基因序列设计RT-PCR引物（NIS上游引物：5' CCTCCAGGGCCGTGCTCATCAAC3'；NIS下游引物：5' GCCCCTCCCCTCCCCCATAACA 3'；TSHR上游引物：5' ATGGAGGGGCAGGGGATACG 3'；TSHR下游引物：5' ATGCGCTGCTTCTAAGAGGAGTGC 3'），PCR反应条件为：94℃预变性3min；PCR循环：94℃ 30s，59.8℃ 30s，72℃ 80s，共35个循环，最后72℃延伸10min；产物长度分别为TSHR 1.951kb；NIS 333bp。 PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序。凝胶电泳结果（图3）表面该细胞系中TSHR和NIS表达为阳性。说明该细胞系在第30代时仍具有牛甲状腺细胞的典型特征，未分化成其他细胞。 

（三）染色体鉴定。 

将培养的犊牛甲状腺原代细胞和hTERT-BTY细胞系置于4℃ 12h后，加入终浓度为0.4μg/mL的秋水仙素，37℃培养箱中培养10h。采集分裂中期的细胞，用固定液进行固定，然后将细胞悬液滴于遇冷的载玻片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数。结果见图4。可见第30代端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞染色体数目和原代细胞染色体数目一致，均为2n=60，该细胞系染色体数目未发生畸变。并对原代甲状腺细胞和端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞系染色体进行GTG-Band染色，对比观察是否有染色体结构畸变。结果如图5所示，和原代甲状腺核型图比较未发现第30代hTERT-BTY细胞出现明显染色体结构畸变。说明该永生化细胞系未发生癌变，仍保持正常牛体细胞特性。第40代hTERT-BTY保藏于CCTCC。 

实施例2 口蹄疫病毒（FMDV）在hTERT-BTY细胞系上的生物学特性研究。 

一、口蹄疫病毒FMDV/O/mya98毒株感染hTERT-BTY细胞系并形成CPE情况。 

细胞接种于96孔板中，生长至80%~90%融合，用无血清MEM培养基稀释病毒至0.05MOI接种到细胞中，24h后镜下观察拍照。如图5所示，24h后大量细胞变圆脱落，出现明显的CPE。说明该口蹄疫毒株可以感染端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞系并使细胞发生病变。 

二、口蹄疫病毒FMDV毒株在hTERT-BTY细胞系上的复制情况。 

将细胞按照1.5×10⁵个细胞/孔的密度接种到24孔板中，过夜培养至细胞80%~90%融合，将病毒按照200×10⁴ copies/孔接种到细胞中，作用1h后PBS清洗3~5次，然后在孵育0、6、12、24、36h收获病毒，每个样品取200 μL提取RNA，用real-time PCR测定每个时间点的病毒RNA拷贝数并绘制曲线。结果如图6所示，三株不同的FMDV/O/mya98毒株均可在hTERT-BTY细胞系上高水平复制。 

三、hTERT-BTY细胞系在FMDV基础研究中的应用。 

（一）口蹄疫病毒FMDV/O/mya98毒株诱导hTERT-BTY细胞系发生凋亡的情况。 

细胞接种于96孔板中，生长至80%~90%融合，用无血清MEM培养基稀释病毒至0.05 MOI接种到细胞中，24h后用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，预冷的PBS洗涤细胞两次。用含BSA的PBS调整细胞浓度至1×10⁶个细胞/mL，在细胞悬液中加入5μL Annexin V-FITC，混匀后4℃避光孵育15min。加入10μL PI混匀后4℃避光孵育5min，流式细胞仪检测凋亡情况。结果如图7所示，病毒感染24h后，细胞早期凋亡和晚期凋亡总和达到了89.6%。 

（二）三株不同的FMDV毒株诱导hTERT-BTY细胞发生凋亡的情况。 

实验方法同（一），检测0.015MOI以及0.025MOI两个剂量的A、B、C三株不同的FMDV毒株诱导hTERT-BTY细胞凋亡的情况。结果如图8所示，病毒感染24h后，三个毒株诱导hTERT-BTY细胞发生凋亡的程度具有一定的差异，并且两个不同剂量趋势一致。 

综上所述，实施例1成功构建了端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞系，并对该细胞系生物学特性做了检测。结果表明该细胞系可以稳定传代至50代以上，第三十代仍能高水平表达牛甲状腺特异基因TSHR和NIS，说明该细胞系仍保持甲状腺细胞的特性。而且与原代牛甲状腺细胞相比，该细胞系第三十代细胞染色体无数目以及结构畸变，仍为正常牛体细胞。 

实施例二中对该细胞系的应用进行了系列研究，选取不同的FMDV毒株接种到该细胞系上，发现低剂量（0.05MOI）的FMDV即能感染该细胞系并形成明显的CPE，随着感染时间的增加，病毒RNA拷贝数呈增长趋势。这一系列结果表明FMDV能够感染该细胞并在此细胞内复制繁殖，因此该细胞系可以用来分离动物组织或水泡液等样品中的FMDV田间毒株，也可以用来大量培养FMDV作为疫苗或诊断的抗原。实施例二中还对该细胞系在基础研究中的应用作了初步的探索， 以FMDV毒株诱导宿主细胞凋亡的研究为例，发现FMDV毒株能够诱导该细胞系发生凋亡，并且同样剂量的不同毒株诱导凋亡的程度具有一定的差异。这一结果表明不同的毒株由于其致病性、复制能力等特性不同，其诱导宿主细胞凋亡的能力也就有所差异。因此，可借助hTERT-BTY细胞作为细胞模型，研究不同毒株的凋亡机制。同样方式，该细胞还有望作为牛源细胞模型进行FMDV的免疫机制、病毒复制调控、持续感染以及嗜性差异等研究。 

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  一种端粒酶永生化牛甲状腺细胞系及其用途

<160>  4

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列（NIS上游引物）

<400> 

cctccagggc cgtgctcatc aac                                              23

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列（NIS下游引物）

<400> 

gcccctcccc tcccccataa ca                                               22

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列（TSHR上游引物）

<400>

atggaggggc aggggatacg                                                  20

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列（TSHR下游引物）

<400>

atgcgctgct tctaagagga gtgc                                             24