梅尔克松-罗森塔尔综合征新的致病基因及其编码蛋白质和应用

技术领域

本发明涉及一种人体变异基因，尤其涉及一种梅尔克松-罗森塔尔综合 征新的致病基因-FATP1基因。本发明还涉及突变的FATP1基因及其编码蛋 白质和应用，包含突变的FATP1基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。

背景技术

梅尔克松-罗森塔尔综合征(Melkersson-Rosenthal Syndrome，MRS) (OMIM 155900)是家族性的遗传性疾病，呈常染色体显性遗传特征(可 参见：Meisel-Stosiek M,Hornstein OP,Stosiek N.Family study on  Melkersson-Rosenthal syndrome.Some hereditary aspects of the disease and  review of literature.Acta dermato-venereologica.1990；70(3):221-6.PubMed  PMID:1972835.)。该病特征性的临床表现包括肉芽肿性唇炎、面神经麻痹 和皱襞舌，又称巨唇-面瘫-皱襞舌综合征(可参见：Elias MK,Mateen FJ, Weiler CR.The Melkersson-Rosenthal syndrome:a retrospective study of  biopsied cases.Journal of neurology.2013Jan；260(1):138-43.PubMed PMID: 22836908；Talabi OA.Melkerssons-Rosenthal syndrome:a case report and  review of the literature.Nigerian journal of clinical practice.2011 Oct-Dec；14(4):477-8.PubMed PMID:22248954.)。本病首先于1928年由 Melkersson描述，他当时仅注意到复发性唇部水肿和面瘫。直到1930年 Rosenthal把皱襞舌也作为本病的症状之后，才使本病认识完全。Kunstadter 在1965年报道了1例5岁半时发病的病例，其姥姥68岁时出现单侧面神 经麻痹和面部水肿，其姨10岁时出现单侧面神经麻痹及可疑面部水肿，最 终完全恢复(可参见：Kunstadter RH.Melkersson's syndrome.A case report of  multiple recurrences of Bell's palsy and episodic facial edema.American journal  of diseases of children.1965Nov；110(5):559-61.PubMed PMID:5846695.)。 Carr等报道了至少4个有两代受累和1个有三代受累的MRS家系(可参见： Carr RD.Is the Melkersson-Rosenthal syndrome hereditary？Archives of  dermatology.1966Apr；93(4):426-7.PubMed PMID:5862634.)。Lygidakis等 1979年报道了1家系四代7人受累，其中1例为父-子遗传，1例为隔代遗 传(可参见：Lygidakis C,Tsakanikas C,Ilias A,Vassilopoulos D. Melkersson-Rosenthal's syndrome in four generations.Clinical genetics.1979 Feb；15(2):189-92.PubMed PMID:761419.)。Smeets等1994年报道了一26 岁女性有MRS典型临床表现，染色体核型分析有t(9；21)(p11；p11)变异，其 母亲染色体核型正常(可参见：Smeets E,Fryns JP,Van den Berghe H. Melkersson-Rosenthal syndrome and de novo autosomal t(9；21)(p11；p11) translocation.Clinical genetics.1994 Jun；45(6):323-4.PubMed PMID: 7923865.)。近年也有数个MRS家系及病例报告(可参见：Liu R,Yu S. Melkersson-Rosenthal syndrome:a review of seven patients.Journal of clinical  neuroscience:official journal of the Neurosurgical Society of Australasia.2013 Jul；20(7):993-5.PubMed PMID:23664134.)。

目前关于MRS的病因及发病机制未完全明了，可能与遗传、感染、免 疫功能紊乱、过敏反应及自主神经系统调节的血管舒缩功能紊乱等多重因 素有关。

本病世界各地均有报道，两性发病率大致相等，在儿童或青年时出现 症状。巨唇范围及程度不等，有的仅有轻度肥厚，有的可达正常组织的1 至数倍。唇部肿胀可以是突发性的，很快消退或反复发作，持续数小时或 数周，抗组胺药无效。MRS的复发性面瘫呈单侧或双侧，为部分性或完全 性面瘫。30％～80％MRS患者有皱襞舌，舌背面有深和纵横交错的沟隙。本 病的典型病理学表现为淋巴水肿，非干酪样上皮细胞肉芽肿。上唇活检的 组织病理学检查显示淋巴细胞浸润和粘膜下层水肿，在周围血管和淋巴组 织中有明显淋巴细胞浸润(可参见：Elias MK,Mateen FJ,Weiler CR.The  Melkersson-Rosenthal syndrome:a retrospective study of biopsied cases. Journal of neurology.2013Jan；260(1):138-43.PubMed PMID:22836908.)。

MRS尚无有效治疗办法，容易复发。虽然可以出现自发性症状消退， 但完全缓解率低。上唇肿胀由于反复发作可致永久性肥厚。面瘫为周围性， 反复出现，多可完全恢复，但长期反复发作可遗留咬肌和额肌萎缩及难治 性面瘫等。对于唇部明显肿胀者可采用局部糖皮质激素皮损内注射，有一 定疗效但容易复发。口服氨苯砜、沙利度胺或雷公藤有一定疗效，口服糖 皮质激素有效但一般不推荐应用。对于唇部肿胀明显不能完全消退者，可 试用糖皮质激素(倍他米松等)局部注射，通常可获部分缓解(可参见： Oudrhiri L,Chiheb S,Marnissi F,Zamiati S,Benchikhi H.Successful treatment  of Miescher's cheilitis in Melkersson-Rosenthal syndrome with betamethasone  injections and doxycycline.The Pan African medical journal.2012；13:75. PubMed PMID:23397029.Pubmed Central PMCID:3567407.)。Dai C等报道 8例有复发性面神经麻痹的MRS患者，采用经乳突面神经部分松解术并平 均观察3.3年，其中有7例面神经麻痹分级恢复到Ⅰ级或Ⅱ级，无复发(可 参见：Dai C,Li J,Yang S,Zhao L,Feng S,Li Y,et al.Subtotal facial nerve  decompression for recurrent facial palsy in Melkersson Rosenthal syndrome. Acta oto-laryngologica.2014Apr；134(4):425-8.PubMed PMID:24512460.)。 Stein J等报道采用阿达姆单抗(肿瘤坏死因子α阻断剂)治疗MRS患者有 效(可参见：Stein J,Paulke A,Schacher B,Noehte M.An extraordinary form of  the Melkersson-Rosenthal syndrome successfully treated with the tumour  necrosis factor-alpha blocker adalimumab.BMJ case reports.2014；2014. PubMed PMID:24827666.)。综上，对MRS正确的诊断和治疗，是临床医生 面临的巨大挑战，需要多学科临床医师的共同努力。关于其确切病因和发 病机制的探寻有待于进一步工作，从本质上揭示MRS的病因和形成机制是 找到MRS治疗的关键。

全基因组外显子测序(靶向外显子组捕获)是一种经济的测序方法， 其主要是对人类基因组的编码区进行测序从而探测罕见和常见疾病相关的 新基因。因为只测序全部基因组的1％，故此比较经济并伴有较高的覆盖效 率和深度(可参见：Choi M,Scholl UI,Ji W,Liu T,Tikhonova IR,Zumbo P,et  al.Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA  sequencing.Proc Natl Acad Sci U S A.2009Nov 10；106(45):19096-101. PubMed PMID:19861545；Cooper GM,Goode DL,Ng SB,Sidow A,Bamshad  MJ,Shendure J,et al.Single-nucleotide evolutionary constraint scores highlight  disease-causing mutations.Nat Methods.2010Apr；7(4):250-1.PubMed PMID: 20354513.Pubmed Central PMCID:3145250.Epub 2010/04/01.eng.)。目前已 知的大多数单基因疾病的功能变异发生于致病基因的外显子(可参见： Stenson PD,Ball EV,Mort M,Phillips AD,Shiel JA,Thomas NS,et al.Human  Gene Mutation Database(HGMD):2003update.Hum Mutat.2003 Jun；21(6):577-81.PubMed PMID:12754702.Epub 2003/05/20.eng；Ng SB, Turner EH,Robertson PD,Flygare SD,Bigham AW,Lee C,et al.Targeted  capture and massively parallel sequencing of 12human exomes.Nature.2009 Sep 10；461(7261):272-6.PubMed PMID:19684571.)，因此全基因组外显子测 序被认为是弥补定位克隆技术的重要技术。2009年以来，国内外已经成功 利用外显子捕获系统和测序系统发现或验证了一些单基因疾病 (Freeman–Sheldon综合症、Miller综合征、Kabuki综合征、BVVL综合 征、逆向性痤疮、脊髓小脑共济失调、Schinzel-Giedion综合征、非综合征 性耳聋)的致病基因(可参见：Ng SB,Buckingham KJ,Lee C,Bigham AW, Tabor HK,Dent KM,et al.Exome sequencing identifies the cause of a  mendelian disorder.Nat Genet.2009Jan；42(1):30-5.PubMed PMID:19915526； Ng SB,Bigham AW,Buckingham KJ,Hannibal MC,McMillin MJ, Gildersleeve HI,et al.Exome sequencing identifies MLL2mutations as a cause  of Kabuki syndrome.Nat Genet.2010Sep；42(9):790-3.PubMed PMID: 20711175.Epub 2010/08/17.eng；Johnson JO,Gibbs JR,Van Maldergem L, Houlden H,Singleton AB.Exome sequencing in brown-vialetto-van laere  syndrome.Am J Hum Genet.2010Oct 8；87(4):567-9.PubMed PMID: 20920669.Epub 2010/10/06.eng；Liu Y,Gao M,Lv YM,Yang X,Ren YQ, Jiang T,et al.Confirmation by Exome Sequencing of the Pathogenic Role of  NCSTN Mutations in Acne Inversa(Hidradenitis Suppurativa).J Invest  Dermatol.2011Mar 24；131(7):1570-2.PubMed PMID:21430701.Epub 2011/03/25.Eng；Wang JL,Yang X,Xia K,Hu ZM,Weng L,Jin X,et al. TGM6identified as a novel causative gene of spinocerebellar ataxias using  exome sequencing.Brain.2010Dec；133(Pt 12):3510-8.PubMed PMID: 21106500.Hoischen A,van Bon BW,Gilissen C,Arts P,van Lier B, Steehouwer M,et al.De novo mutations of SETBP1cause Schinzel-Giedion  syndrome.Nat Genet.2010May 2.PubMed PMID:20436468；Walsh.Whole  Exome Sequencing and Homozygosity Mapping Identify Mutation in the Cell  Polarity Protein GPSM2as the Cause of Nonsyndromic Hearing Loss DFNB82. Ame J Hum Gene.2010.)。其中有一些是用全基因组外显子测序与连锁定位 方法相结合发现单基因病的致病基因(可参见：Alvarado DM,Buchan JG, Gurnett CA,Dobbs MB.Exome sequencing identifies an MYH3mutation in a  family with distal arthrogryposis type 1.J Bone Joint Surg Am.2011Jun 1；93(11):1045-50.PubMed PMID:21531865.Epub 2011/05/03.eng；Zuchner  S,Dallman J,Wen R,Beecham G,Naj A,Farooq A,et al.Whole-Exome  Sequencing Links a Variant in DHDDS to Retinitis Pigmentosa.Am J Hum  Genet.2011Feb 2；88(2):201-6.PubMed PMID:21295283.Epub 2011/02/08. Eng；Otto EA,Hurd TW,Airik R,Chaki M,Zhou W,Stoetzel C,et al. Candidate exome capture identifies mutation of SDCCAG8as the cause of a  retinal-renal ciliopathy.Nat Genet.2010Sep 12；42(10):840-50.PubMed PMID: 20835237；Ostergaard P,Simpson MA,Brice G,Mansour S,Connell FC, Onoufriadis A,et al.Rapid identification of mutations in GJC2in primary  lymphoedema using whole exome sequencing combined with linkage analysis  with delineation of the phenotype.J Med Genet.2011Jan 25；48(4):251-5. PubMed PMID:21266381.Epub 2011/01/27.Eng；Bolze A,Byun M, McDonald D,Morgan NV,Abhyankar A,Premkumar L,et al. Whole-Exome-Sequencing-Based Discovery of Human FADD Deficiency.Am J  Hum Genet.2010Dec 10；87(6):873-81.PubMed PMID:21109225.)。全外显子 测序技术仅通过对几个很少的个体(包括患者及正常对照)的全外显子进 行测序来筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。

因此，本研究利用外显子组测序技术区寻找梅尔克松-罗森塔尔综合征 (MRS)的致病基因，以期为MRS的患者治疗提供全新的理论依据，丰富和 完善MRS疾病的诊断流程，从而对MRS患者的临床诊断提供更多的支持 和参考。

发明内容

本发明的主要目的在于鉴别梅尔克松-罗森塔尔综合征(MRS)的新的 致病基因，定位出该疾病的基因突变位点。在此基础上，提供MRS致病基 因及其编码蛋白质和应用，包含MRS致病基因的载体、宿主细胞以及试剂 盒，以对梅尔克松-罗森塔尔综合征进行分子诊断和患病风险评价，为进一 步治疗该病提供设计药物的靶点，同时为阐明该病的致病机制提供理论基 础。

因此，一方面，本发明提供了突变的FATP1基因，所述突变的FATP1 基因序列与SEQ ID NO:1相比具有至少1个非沉默突变，且所述突变的 FATP1基因导致梅尔克松-罗森塔尔综合征的发生；所述非沉默突变选自插 入、缺失和置换中的一种或多种。

在一个优选的实施方案中，所述非沉默突变为SEQ ID NO:1的第68位 的C突变为G，其序列如SEQ ID NO:2所示。该突变属于错义突变，使得 FATP1基因编码的氨基酸序列第23位的脯氨酸变成了精氨酸。

第二方面，本发明还提供了SEQ ID NO:2序列编码的蛋白质，该序列 从第23位发生变化，所述蛋白质有646个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID  NO:3所示。

在本发明的第三方面，提供了含有上述突变FATP1基因的载体。

在本发明的第四方面，提供了被上述载体转化或转导的宿主细胞或者 被上述突变的FATP1基因直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第五方面，提供了上述的突变的FATP1基因在作为治疗梅 尔克松-罗森塔尔综合征的药物靶点或制备梅尔克松-罗森塔尔综合征疾病 诊断试剂盒中的应用。

在本发明的第六方面，提供了一种用于诊断梅尔克松-罗森塔尔综合征 的试剂盒，所述试剂盒包含能够特异性扩增FATP1基因的引物，或能够特 异性检测FATP1基因突变的探针。

在一个优选的实施方案中，所述引物或探针序列为SEQ ID NO:1或2 所示的序列中第68位前后15～30bp长的序列。

在本发明的第七方面，提供了一种抗体，所述抗体与权利要求3所述 的蛋白质特异性结合，且不作用于正常的FATP1基因所编码的蛋白质。

在本发明的第八方面，提供了一种梅尔克松-罗森塔尔综合征治疗剂， 所述治疗剂包含上述所述的抗体。

本发明通过外显子组测序技术首次发现了FATP1基因突变可以导致梅 尔克松-罗森塔尔综合征的发病。一方面，通过检测受试者是否携带有FATP1 基因致病突变，可以早期筛查梅尔克松-罗森塔尔综合征突变基因携带者， 提供优生优育指导；也可为梅尔克松-罗森塔尔综合征患者提供分子诊断依 据。特别地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断 梅尔克松-罗森塔尔综合征。另一方面，FATP1基因为深入研究以明确MRS 的发病机制，并探索有效的治疗手段，从根本上解决MRS无有效治疗手段 的现状提供了全新的通路；第三方面，本发明可以为治疗梅尔克松-罗森塔 尔综合征提供可能的药物靶点。

附图说明

图1为某四代常染色体显性遗传MRS家系图，其中正方形表示男性， 圆圈表示女性，带斜线为死亡，实心为患病个体，空心为正常个体。

图2为图1中MRS家系图内患者的临床表现，其中A,B为Ⅲ3患者的 临床表现，C为Ⅱ5的临床表现，D为Ⅱ3的临床表现。

图3为MRS患者唇部组织病理表现(光镜HE×200)。

图4为图1中MRS家系图内部分个体的测序结果，其中，A为患者Ⅱ3 的测序结果，B为患者Ⅱ5的测序结果，C为患者Ⅲ3的测序结果，D为正 常个体Ⅱ4的测序结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于 对本发明进行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，本 发明的保护范围以权利要求书限定的范围为准。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有 本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核 酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用 的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的 定义和解释。

在本发明中，“FATP1基因”为脂肪酸转运蛋白1(fatty acid transport  protein 1)基因，人的FATP1基因位于人体的19号染色体上，编码646个 氨基酸，其中保守列区编码有311个氨基酸。FATP1基因编码的蛋白质为 脂肪酸转运蛋白1，是整合的跨膜蛋白，属于脂肪酸转运蛋白家族(FATPs) 成员，参与脂肪酸跨膜转运及脂肪酸代谢，是影响脂肪含量的关键基因之 一，该蛋白主要在脂肪组织中表达，在心脏和骨骼肌也有发现。

在本发明中，术语“外显子”是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即 成熟mRNA对应于基因中的部分。内含子是在mRNA加工过程中被剪切 掉的部分，在成熟mRNA中不存在。外显子和内含子都是对于基因而言的， 编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没有遗传效应。

在本发明中，术语“外显子捕获”与“芯片杂交”可互换使用，指的是探针 对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。DNA分 子正常情况下是双链，因此捕获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通 过加热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分子被迅速冷却，即保持单 链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的 DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳 地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过 变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。

在本发明中，“高通量测序”是指采用三种第二代测序平台进行高通量测 序：454FLX(Roche公司)、Solexa Genome Analyzer(Illumina公司)和 Applied Biosystems公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序 通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取 40万到400万条序列，根据平台的不同，读取长度从25bp到450bp不等， 因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数。

在本发明中，术语“DNA文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获 得一组具有一定大小的DNA片段混合物。DNA文库的制备方法为本领域 技术人员所熟知。在一个优选例中，还可以对打断产物、末端修复产物、 接头产物和富集产物进行纯化。对反应的条件进行一定的变化或优化也在 本领域技术人员能力范围之内。

在本发明中，术语“突变”是指野生型的FATP1多核苷酸序列发生改变， 成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。变异体包括取代 变异体、缺失变异体和插入变异体。在本发明中，某一种变异体可以通过 多种方式实现，例如，要得到野生型基因编码不完全的变异体，可以通过 在野生型基因序列中插入碱基，使某个密码子变为终止密码子，或者直接 缺失部分序列的方式实现。在本发明中，术语“非沉默突变”是指除了沉默突 变以外的基因突变，包括但不限于错义突变、无义突变和移码突变等。

本发明还涉及与所述的FATP1核苷酸杂交且两个序列之间具有至少 80％，较佳地至少90％，更佳地至少95％，至少99％同源性的多核苷酸。 本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明野生型或突变型FATP1核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本 发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用 市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作 为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来 大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通 过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明中，“载体”包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实 施方案中，所述载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在一个 优选的实施方案中，所述载体是商购可得的。在一个优选的实施方案中， 所述载体包含与上述突变的FATP1基因可操作地连接的表达控制序列，例 如但不限于启动子，增强子和终止子。在一个优选的实施方案中，所述载 体任选地还包含选择标记。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以 用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。此类宿主细胞包括但 不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫 细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。 本发明的宿主细胞还可以是细胞系。

本发明还涉及到FATP1突变蛋白质，由于在SEQ ID NO:l所示核苷 酸序列中第68位的C突变为G，使得FATP1基因编码的氨基酸序列第23 位的脯氨酸变成了精氨酸，本发明的FATP1突变蛋白质具有SEQ ID NO:3 所示的序列，该位点氨基酸的置换使得突变后的FATP1蛋白质不具有野生 型FATP1蛋白质的正常功能。本发明的FATP1突变蛋白质可以是重组蛋白 质、天然蛋白质、合成蛋白质，优选重组蛋白质，即使用重组技术从原核 或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

在本发明中，FATP1突变蛋白质还涉及具有与FATP1突变蛋白质相同 功能的、SEQ ID NO：3序列的变异形式。变异形式包括:同源序列、保守 性变异体、诱导突变体等。发明还涉及FATP1突变蛋白质类似物。这些类 似物与FATP1突变蛋白质的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不 影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。

本领域技术人员公知，致病基因具有多方面的用途。因此，本发明提 供的突变FATP1基因的用途包括但不限于：用作治疗梅尔克松-罗森塔尔综 合征的药物靶点；制备梅尔克松-罗森塔尔综合征的诊断试剂盒中；用于产 生疾病动物模型；为治疗梅尔克松-罗森塔尔综合征提供新的药物作用途径。

本发明所述的“试剂盒”是指本领域技术人员以FATP1野生型或突变型 核苷酸为基因探针，根据基因杂交的原理，可以检测生物样本中是否存在 与该探针序列互补的核苷酸序列，因此使用这种试剂盒可以检测出样本中 是否存在着本发明的基因突变位点。试剂盒一般包括：引物、探针、核酸 芯片、说明书等，还可能包括与活性成分相容的缓冲液、载体或媒介等。

在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片 段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩 增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如 本文中所使用的，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的 基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增FATP1基因是指，在PCR反 应中引物只扩增FATP1基因，而不扩增其他基因，此类引物的设计是本领 域技术人员公知的。

在本发明中，术语“特异性检测FATP1基因突变的探针”是指探针能够 区分出含有突变的FATP1基因与不含有突变的FATP1基因。一般而言，可 以通过控制杂交条件的严紧性，使得探针能够区分出含有突变的基因与不 含有突变的基因。例如，在高度严紧条件下，与FATP1基因精确互补的探 针可以与不含有突变的FATP1基因杂交，而不与甚至只包含一个点突变的 突变的FATP1基因杂交，从而将二者区分开。同样，还可以设计与突变的 FATP1基因基因精确互补的探针，从而其在高度严紧条件下与突变的FATP1 基因杂交，而不与不含有突变的FATP1基因杂交。在分子生物学领域中， 探针的设计和杂交技术是熟知的。

本发明涉及对突变的FATP1蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克 隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于突变的FATP1 蛋白质。较佳地，指那些能与突变的FATP1蛋白质产物或片段结合但不识 别和结合于野生型的FATP1蛋白质相关抗原分子的抗体。本发明不仅包括 完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab， 或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子或嵌合抗体。 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

本发明的突变的FATP1蛋白质抗体可以用来鉴定突变的FATP1蛋白 质。例如，可以用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸(FITC)来标记突变 的FATP1蛋白质特异抗体，然后让突变的FATP1蛋白质特异抗体与样品接 触，再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与突变的FATP1蛋白质特异抗体 结合的样品，从而为预测或诊断患者是否存在特发性梅尔克松-罗森塔尔综 合征提供依据和指导。

本发明的突变的FATP1蛋白质抗体还可以用来中和突变的FATP1蛋白 质。如果有足够的数据表明某个体的MRS与本发明突变FATP1蛋白质的存 在相关，可以考虑用突变的FATP1蛋白质特异性抗体中和这些致病突变 FATP1蛋白质分子，从而缓解患者的病症。

实施例1：样本获取

发明人发现并鉴定了一个常染色体显形遗传的梅尔克松-罗森塔尔综合 征家系(如图1所示)，共4代20人，其中3人为患者(图1中黑色实心 所示个体)。先证者为30岁女性(Ⅲ3)，从12岁开始左侧面部出现两次面 瘫，经过治疗完全恢复，后又复发过；唇部从10年前开始出现不明原因肿 胀，以后又反复出现尤其在有外界刺激等时容易出现(如图2A所示)；舌 自幼即有交错的裂隙，偶有疼痛感(如图2B所示)；唇部组织病理有慢性 非干酪样坏死的肉芽肿样改变(如图3所示)，上述表型符合MRS。经追问 家族史，发现Ⅱ3(如图2D所示)和Ⅱ5(如图2C所示)均有皱襞舌改 变。

发明人以2名患者(Ⅱ5和Ⅲ3)及1名家系内表型正常者(Ⅱ7)作为 研究样本，并采集每位研究对象的外周血作为研究样品，加入EDTA抗凝， -80℃保存。所有血样均签属知情同意书，并获得伦理委员会批准。

实施例2：样本DNA制备

采集梅尔克松-罗森塔尔综合征患者(Ⅱ5和Ⅲ3)及其家系内表型正常 者(Ⅱ7)的外周血，采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试 剂盒从外周血样品中提取DNA,提取步骤如下：

(1)取2ml全血样本，加入150ul OB Protease，2.1ml Buffer BL和20ul  RNase A，最大速度漩涡1分钟，彻底混匀。

(2)65℃水浴15-20分钟，并在水浴过程中漩涡5次。

(3)加入2.2ml无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀。

(4)将3.5ml裂解液移入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分 钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心 5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(6)加入3ml HB Buffer，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过 滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(7)加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱， 倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(8)再次加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤 柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(9)4000转离心15分钟，甩干过滤柱。

(10)将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的Elution  Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

(11)再次将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的 Elution Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过 滤液。

(12)利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因 组DNA的OD260/OD280均位于1.7～2.0之间，浓度不少于200ng/ul，总 量不少于30μg。

实施例3：外显子捕获与测序

发明人用NimbleGen SeqCap EZ Exome(44M)结合Solexa高通量测序技 术对选取的实施例1的患者的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1)将基因组DNA随机打断成200-300bp左右的片段，随后在片段两 端分别连接上接头制备杂交文库(参见http://www.illumina.com/提供的 Illumina/Solexa标准建库说明书)。

2)文库经纯化后经过连接介导PCR(ligation-mediated PCR(LM-PCR)) 的线性扩增与Biotinylated DNA Library进行杂交富集，再经过LM-PCR的 线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq 2000，读取长度为 90bp，每个样本的平均测序深度达到100×(即每个样品中，比对上参考基因 组的clean data去duplication之后落在目标区域的数据量是探针覆盖到的 目标区域大小的100倍，目标区域及其大小取决于捕获建库的方式)。

3)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1.7进行处理， 经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.20#比对参考基因组(可参考Li R,Li Y, KristiansenK,et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,et al,SOAP2:an  improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics 2009， 25(15):1966-1967，通过参考的方式将其全文并入本文)，以便获得比对到基 因组上的唯一比对序列。然后利用SOAP snp(可参见:Li R,Li Y,Fang X, Yang H,et al,SNP detection for massively parallel whole-genome  resequencing.Genome Res 2009,19(6):1124-1132，通过参考的方式将其全文 并入本文)确定靶区域的基因型。Indel(insertion-deletion，插入/缺失标记) 采用BWA(通过Burrows-Wheeler变换比对)(version 0.5.9-r16)比对到参考 基因组Hg19(snp132)，然后利用GATK(Genome Analysis Toolkit)(version  v1.0.4705)确定indel的类型。(可参见Li H,Durbin R.Fast and accurate  long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.Bioinformatics 2010； 26(5):589-595；McKenna,A,Hanna M,Banks E,et al.The genome analysis  toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA  sequencing data.Genome Research 2010；20(9):1297-1303)。

随后对结果通过四个公共数据库(dbSNP(v137):http://hgdownload.cse. ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp137.txt.gz.；千人数据库：ftp://ftp. 1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp或ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov//1000genomes/ftp； hapmap:ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap；YH数据库:http://yh.genomics.org. cn的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。 通过比对正常样本,去掉所有已知变异，同义变异以及非编码区的变异，并 利用SIFT软件进行SNP功能预测，最终得到3个可能具有致病意义的基因 突变(FATP1c.68C>G,p.Pro23Arg；FLI1c.74C>T,p.Ala25Val；CACNA1H  c.4819C>T,p.Arg1607Cys)。

实施例4：Sanger法测序验证

由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，因此我们进一步对上述3 个具有致病意义的基因突变进行验证，在此选择MRS家系内和MRS家系 外的正常人群验证，具体步骤如下：

1.DNA提取

分别采集实施例1中的MRS患者(Ⅱ5和Ⅲ3)、其家系内所有表型正 常者和200位无关正常个体的外周血，按照实施例2的方法提取基因组DNA， 之后测量提取DNA纯度和浓度，DNA的OD260/280在1.8-2.0之间的可以 用于PCR检测。

2.引物设计及PCR反应

引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3，具体见下。

PCR检测采用TaKaRa公司的SapphireAmp Fast PCR Master Mix检测 试剂盒。PCR反应体系如下表：

反应条件：

其中，退火温度根据每对引物分别进行设定，FATP1引物的退火温度 设为62.9℃，FLI1引物的退火温度设为57.6℃，CACNA1H引物的退火温 度设为61.7℃。

3.DNA测序

将PCR反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察有清晰明 亮条带并且条带大小符合目标产物大小的进行Sanger测序，测序结果与基 因库中的正常基因序列进行比对，观察有无基因突变。

PCR反应测序结果发现：FATP1c.68C>G,p.Pro23Arg在家系内所有患 者都出现，在家系内所有表型正常者均无此突变(如图4所示)；FLI1 c.74C>T,p.Ala25Val除了在家系内患者出现还在Ⅰ3和Ⅳ1中出现； CACNA1H c.4819C>T,p.Arg1607Cys除了在家系内患者出现还在Ⅱ9中出 现。综上只有FATP1的变异点在MRS家系内所有的患者中表现为与疾病共 分离。同时我们检测了200名正常对照，未发现该突变。

此外，发明人设计了针对FATP1所有外显子区域的引物，并进行PCR 检测，以确定FATP1有无其他突变位点，引物如下表：

PCR反应体系配制和反应条件设定同上。在该MRS家系和正常对照人 群中未发现其他突变位点。由此发明人在国际上首次确定MRS致病基因为 FATP1。

实施例5：体外检测MRS患者的FATP1基因的试剂盒

为了检测其它MRS家系该基因的致病突变，可以设计该基因编码区 所有外显子和外显子与内含子交界处的引物序列。在该实施例中，试剂盒 引物和扩增测序条件如实施例4。

1、试剂盒组成：

引物：如实施例4所示；

Taq酶

缓冲液

dNTP

从待检测的生物体样本中提取和纯化基因材料(DNA样本)

2、使用方法：

(1)基因组DNA提取：使用美国Promega公司的Wizard Genomic  DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

(2)先采用上述PCR引物、Taq酶、样本基因组DNA、缓冲液、dNTP 等进行PCR扩增反应；

(3)对PCR扩增产物进行纯化；

(4)对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

(5)对BiyDye反应产物纯化；

(6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。