一种白念珠菌WIP1基因的用途及缺失WIP1基因的白念珠菌减毒株

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白念珠菌白灰形态转换调控因子Wip1的用途及缺失WIP1基因的白念珠菌减毒株。

背景技术

白念珠菌（Candida albicans）是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，特别在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液而到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡（Odds,F.C.1994.J.Am.Acad,Dermatol.31:S2-S5.）。白念珠菌在不同的生长条件下，有不同的生长形态，这些不同形态之间可以在一定条件下进行转换。包括酵母态（yeast form），和菌丝态（hyphae），以及白菌（white phase）和灰菌（opaque phase）之间的转换。这种形态转化能力直接影响白念珠菌的致病能力（Odds,F.C.1985.Crit Rev Microbiol.12:45-93;Brown,A.J.P.et al.1999.Trends Microbiol.7:334-338.），形态转换能力缺陷的菌株其系统感染能力大大下降或消失（Lo,H.J.et al,Cell90:939-949.）。白-灰转换首先在临床上分离的WO-1菌株中发现。这两种形态的菌也具有不同的致病性，白菌在系统感染中具有较强的致病能力，而灰菌在表皮感染中具有较强的致病能力。因而白灰转换是念珠菌为了适应不同的微环境而产生的两种形态，这两种形态对于念珠菌的致病能力有重要作用。同时，白灰转换对于白色念珠菌实现其交配也是必要的。与酿酒酵母类似，白色念珠菌为了实现同源重组，需要经过一个交配的过程，有研究表明白念珠菌灰菌形态交配效率大约是白菌形态的10⁶倍，因此，白色念珠菌要实现交配，首先要进行白灰转换，由白菌转换为灰菌形态，才可以实现交配。

现有技术已通过功能互补的方法找到了调控白色念珠菌白灰转换的关键性因子，Wor1（White-Opaque Regulator1），Wor1在念珠菌白灰形态转换中起着关键性的调控作.。Northern杂交显示，Wor1的表达呈现“全或无”的形式，根据这一结果，我们提出了Wor1以自激活的方式调控白灰转换的正反馈模型。

同时，有研究表明，Wor1蛋白可以结合在一系列灰菌特异性表达的基因的启动子区域，从而调控灰菌特异性基因的转录，此外，Wor1还可以结合在其自身的启动子区域，这点也支持了我们上面提到的正反馈调控模型。

在证实了Wor1调控白灰转换的功能以后，我们想对其调控的具体机制做出研究，例如上述“全或无”的正反馈途径是如何实现的。为此，我们利用酵母双杂交系统在白色念珠菌的基因组文库中筛选了与Wor1有相互作用的蛋白。筛库结果是得出一系列与Wor1有相互作用的蛋白，其中就包含具有特征性的SP-RING结构的Wip1，Wip1的基因全长为1524bp,之前有报导其转座突变影响白念珠菌的丝状生长，推断含有MIZ锌指结构域，在酿酒酵母尚未发现同源基因。

发明内容

本发明的目的在于研究白念珠菌白灰转换关键性调控因子Wor1的相互作用蛋白Wip1在白灰转换及毒性表现中的功能及作用。

本发明首先公开了白念珠菌WIP1基因的用途，为用于制备WIP1基因不表达的白念珠菌wip1/wip1缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。

本发明的WIP1基因含有如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列，其在白念珠菌中表达SUMO E3连接酶。

WIP1所表达的SUMO E3连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示。

较优的，本发明所述wip1/wip1缺失株为白念珠菌的减毒株。在所述白念珠菌wip1/wip1缺失株中WIP1基因不表达。

本发明所述白念珠菌治疗药物为以WIP1基因为治疗靶基因，使WIP1基因不表达或过表达的药物、或者以WIP1基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以WIP1基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以WIP1基因为靶点，筛选或制备使该基因不表达或过表达的药物，用于使白念珠菌毒性减弱，从而治疗白念珠菌感染。例如，该白念珠菌治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使WIP1基因不表达；或者通过制备Wip1蛋白拮抗剂，使WIP1基因表达的SUMO不发挥作用；或者通过外源导入WIP1基因，使WIP1基因过表达。

本发明第二方面公开了一种白念珠菌减毒株，为白念珠菌wip1/wip1缺失株，所述减毒株中WIP1基因不表达。

进一步的，本发明的白念珠菌减毒株属于SUMO E3连接酶基因缺失株。

较优的，本发明所述白念珠菌WIP1/WIP1缺失株中，WIP1基因通过同源重组的方法敲除。

本发明第三方面公开了前述白念珠菌减毒株的构建方法，为通过同源重组的方法对白念珠菌中WIP1基因的两个拷贝进行了敲除，具体步骤如下：

1）敲除质粒的构建：分别用SEQ ID NO：1-2所示引物和SEQ ID NO：3-4所示引物从白念珠菌基因组DNA中扩增WIP1上游和下游序列片段，分别反向和顺向连接入pMD18-T的TA克隆位点得到质粒pT-FU和pT-FD；用BamHI-KpnI将包含WOR1下游序列的片段从pT-FD上切下插入pT-FU的相应位点得到质粒pT-FUD；将来源于pCUB6的带有BamHI-BglII黏性末端的HisG-URA3-HisG片段反向插入pT-FUD的相应位点得到白念珠菌WIP1基因敲除质粒pT-WIP1KO；

2）将前述敲除质粒pT-WIP1KO经HindIII酶切后转化白念珠菌，经细胞内同源重组得到第一拷贝WIP1敲除的单敲除菌株；

3）用线性化的前述敲除质粒pT-WIP1KO再次转入步骤2）中第一拷贝WIP1敲除的单敲除菌株，经细胞内同源重组得到第二拷贝WIP1敲除的wip1/wip1双缺失株。

优选的，所述wip1/wip1双缺失株为MTLα型菌株。

本发明第四方面公开了前述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌白灰形态转换及毒性功能中的应用，或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。

本发明第五方面公开了含有SEQ ID NO：33所示序列的基因片段在白念珠菌形态转换中的调控作用。

所述白念珠菌形态转换为白灰形态转换。

优选的，所述含有SEQ ID NO：31所示序列的基因片段为WIP1基因，其基因序列如SEQ ID NO：31所示。

优选的，SEQ ID NO：33所示序列编码SUMO E3连接酶的SP-RING结构域。所述SUMOE3连接酶的SP-RING结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示。

含有SP-RING结构域的SUMO E3连接酶通过催化对关键性调控因子Wor1的SUMO化修饰，从而调控其功能。进一步的，Wor1的第385位赖氨酸是发生SUMO化修饰的位点。

本发明最后还公开了一种制备白念珠菌治疗药物的方法，为以白念珠菌中的WIP1基因为靶标，沉默WIP1基因的表达；或者，使WIP1基因过表达。

有益效果：本发明研究了白念珠菌基因WIP1对白念珠菌形态转换的调控和菌株毒性的影响，并成功构建了一种白念珠菌减毒株，在本发明的减毒株中WIP1基因不表达。本发明的白念珠菌菌丝生长和毒性相关因子基因WIP1和白念珠菌减毒株均可用于制备或筛选白念珠菌治疗药物。

附图说明

图1：WIP1基因的敲除策略

图2：WIP1基因敲除的Southern Blot鉴定结果。

图3：Wip1表达的缺失对于白灰转换的影响

图4：Wip1表达的缺失对白灰转换的影响A）显示了WIP1基因过表达能够在空气培养条件下提高白念珠菌的白灰转换效率；B）显示了WIP1基因过表达促进白灰转换的效率，以及SP-RING结构对于这一功能的重要性

图5：Wip与Wor1的相互作用

图6：Wip1介导了Wor1的SUMO化修饰，该修饰发生在Wor1的第385位赖氨酸

图7：Wor1第385位赖氨酸的SUMO化修饰对于其功能的重要性

图8：WIP1基因的过表达和WIP1基因的缺失都减弱白念珠菌的毒性（A.低注射浓度；B.高注射浓度）

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

白念珠菌（Candida albicans）是一种人体机会性致病真菌，可以引起广泛的感染，但是其真正的致病因子和致病机理还没有完全研究清楚。已有研究表明，白念珠菌存在与其致病性密切相关的两种形态转换方式：酵母-菌丝发育以及白灰形态转换。我们在研究白灰转换时，发现了一个与白灰转换关键性调控因子Wor1相互作用的蛋白，并且证明该蛋白通过对Wor1的SUMO化修饰来参与对白灰转换的调控。鉴于其与Wor1的相互作用，我们把编码该蛋白的基因命名为WIP1（Wor1Interacting Protein1）。外源表达WIP1在空气培养条件下能够促进白灰转换，而wip1/wip1缺失株则在外源WOR1诱导的白灰转换方面有明显的滞后。功能实验证明Wip1是白念珠菌白灰形态转换的一个新的调控因子。后续的生化研究表明，Wip1是一个SUMO E3连接酶，负责催化对关键性调控因子Wor1的SUMO化修饰，从而调控其功能。毒理实验表明Wip1参与白念珠菌致病过程和毒性表现。

通过酵母双杂交筛选，我们得到一个编码产物能与Wor1相互作用的基因，我们把它命名为Wip1。搜索白念珠菌基因文库发现，该基因编码一个全长507aa的蛋白，其N端有一个特征性的SP-RING结构域，该基因在酿酒酵母中未发现通源基因。先前的研究表明，SP-RING结构域是SUMO E3连接酶中的一类，Wip1的RING结构域与酵母中已鉴定的SUMO E3连接酶中的相应结构域同源性较高。

基本实验方法：

方法1：白念珠菌基因组DNA抽提

白念珠菌培养过夜用ddH₂O洗1次，悬浮在500μl溶液A中（1M山梨醇,100mM EDTApH8.0），加入5μl20mg/ml的Zymolase，37℃放置1小时后，高速离心去上清，细胞用500μlof TE buffer（20mM Tris·HCl pH7.5,1mM EDTA）洗一次，悬浮在350μl of TE buffer中，并加入90μl of溶液B（250mM EDTA pH8.0,400mM Tris·HCl pH8.0,2%SDS）,65℃放置30分钟，加入80μl of5M KAc，冰上放置1小时，高速离心5分钟，吸取上清并加入1ml的无水乙醇，-20℃放置20分钟，高速离心5分钟，沉淀用70％乙醇洗一次，离心后烘干。

方法2：白念珠菌的转化

准备PEG／LiAc溶液（pH7.5）10m1；在1.5mI Eppendof管中依次加入质粒5μg，10μl10mg/ml鱼精DNA，混匀；加入0．1ml感受态细胞和0．6m1PEG／LiAc，votex混匀；30℃200rpm培养30min；加入70μl DMSO，轻轻混匀；42℃热冲击15min，期间不时轻轻摇匀；冰浴2min：高速离心15s，吸掉上清，用0．2m1TE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD平板上。

方法3：小鼠系统感染

以体重在16-18g ICR雄性小鼠为实验对象，通过尾静脉注射100μl白念珠菌各种菌株，并培养观测25天。各个菌株分高低两个浓度注射，注射浓度分别为5x 10⁷细胞／毫升和5x10⁶细胞／毫升。

实施例4：免疫共沉淀与Western杂交

白念珠菌表达菌株在YPD培养基中于30℃培养至饱和，按A₆₀₀0.05转接于YPD培养基中于25℃培养6h，至A₆₀₀为0.6-1.0或在YPD+10％Serum培养基中于37℃培养3.5h，50ml培养物离心收集，10ml无菌水洗一次。以下步骤均在4℃进行。细胞重悬于0.5ml酵母细胞裂解液（200mM Tris-HCl pH8.0,400mM(NH₄)₂SO₄,10mM MgCl₂,1mM EDTA,10%Glycerol,7mMβ-mercaptoethanol,2mM benzamidine,1mM PMSF,2μg/ml pepstatin A,2μg/ml leupeptin,4μg/ml antipain），加入0.4g酸洗玻璃珠（425-600μm，Sigma）。在振荡器FP120上振3次，每次30s，间隔冰浴5min。裂解液12,000rpm离心5min，上清再离心5min，收集上清并测定蛋白浓度，-70℃保存。

取500μl细胞抽提物，与等体积的IP Buffer混合，加入10μl床体积的protein G agarosebeads，在4℃旋转混合1小时后低速离心，吸取上清加入5μg的FLAG单抗，在4℃旋转混合1小时，然后加入30μl床体积的protein G agarose beads，继续混合2小时。用IP Buffer洗免疫共沉淀物五次，然后重悬在2×蛋白质电泳上样缓冲液中，进行SDS-PAGE电泳。用湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液封闭膜2-3小时，一抗4℃结合过夜。用TBS-T室温洗膜1次，5分钟。用相应的二抗于室温结合1小时，再用TBS-T洗膜四次，每次5分钟，用ECL试剂显色。

实施例1 wip1/wip1双敲除菌株的构建

1.第一条染色体WIP1基因的敲除

分别用引物WIP1-UF(SEQ ID NO：1)、WIP1-UR(SEQ ID NO：2)和引物WIP1-DF(SEQID NO：3)、WIP1-DR(SEQ ID NO：4)从野生型菌株SC5314基因组DNA中扩增WIP1上游和下游序列片段，分别反向和顺向连接入pMD18-T的TA克隆位点得到质粒pT-FU和pT-FD。用BamHI-KpnI将包含WOR1下游序列的片段从pT-FD上切下插入pT-FU的相应位点得到质粒pT-FUD。来源于pCUB6的带有BamHI-BglII黏性末端的HisG-URA3-HisG片段反向插入pT-FUD的相应位点得到白念珠菌WIP1基因敲除质粒pT-WIP1KO。

引物序列如下：

WIP1-UF：5’-CTATTAGTATTCCAATTTATGCTCTCGG-3’(SEQ ID NO：1)

WIP1-UR：5’-CTAGATCTTTAATTTCAAAGAGAGTCTTGGTTGTGG-3’(SEQ ID NO：2)

WIP1-DF：5’-ATGAAGAGGATGAAGATGACCGAAATC-3’(SEQ ID NO：3)

WIP1-DR：5’-CGGGTACCAACAACAACAACAACAACAACTCATTC-3’(SEQ ID NO：4)

将该敲除质粒由HindIII酶切线性化后转化入野生型白念珠菌CAI4，经营养缺陷筛选及PCR鉴定后的阳性菌株CNX23在YPD平板上培养2-3天，再在含5-FOA和尿苷的SD平板上培养3-5天使hisG-URA3-hisG片段中的URA3以一定比例环出，筛选得到ura-菌株CNX24以用于第二拷贝WIP1的敲除。

2.WIP1基因第二个拷贝的敲除

用线性化的pT-WIP1KO再次转入CNX24，转化子用Southern杂交确证后得到CNX25。再用含5-FOA和尿苷的SD平板筛选得到（MTLa/alpha wip1/wip1）ura-菌株CNX26。利用含山梨糖的平板培养CNX25，筛选丢失掉一条5号染色体的菌株，得到MTLa wip1/wip1双缺失株CNX27。

3.双拷贝缺失菌株的鉴定

抽提各菌株的基因组DNA，用BglII和HindIII酶切消化，以WIP1上游400-bp的DNA片段作为探针检测敲除情况，探针序列如下：

WIP1proF：5’-CTCATCTACAGATGGACTGTCTGG-3’(SEQ ID NO：5)

WIP1proR：5’-ATGGCAAGGTTAAGACGTGTACGG-3’(SEQ ID NO：6)

以引物WIP1proF和引物WIP1proR从白念珠菌基因组DNA中扩增WIP1上游约400bp的DNA片段并且纯化，取获得的DNA片段约25ng于100℃加热变性5min，置于冰浴中，再依次加入Random Primers Buffer Mixture,2μl dATP,2μl dGTP,2μl dTTP,3μl[α-³²P]-dCTP(10μCi/μl),混匀后加入1μl Klenow酶，于25℃保温1h，以Sephadex G-25柱以3000rpm离心4min，收集离心液，即为纯化后的探针溶液。探针于100℃变性5min后加入杂交体系中，实验结果见图2A。

图2A的Southern杂交结果显示，WIP1野生型菌株中两个WIP1拷贝都给出2.4-kb的杂交条带；而WIP1/wip1中的一条2.4-kb杂交带由于hisG-URA3-hisG的插入而变成5.0-kb；当URA3环出后，5.0-kb条带变为2.1-kb；同样当第二拷贝WIP1因插入hisG-URA3-hisG而被敲除时也会从2.4-kb变为5.0-kb；最后当URA3环出后WIP1双拷贝敲除株就给出两条重合的2.1-kb杂交条带。

图2B为山梨糖平板培养筛选的Southern杂交结果，分别以PCR扩增a1和alpha2片段来检测5号染色体丢失的情况（第一条泳道为CNX25的扩增结果，第二条泳道为负对照，紧接其后的数条泳道是MTLa型菌株，最后四条是筛选到的MTLα型菌株）。鉴定引物序列如下，MTLa_F和MTLa_R为扩增a1片段的引物，MTLα_F和MTLα_R为扩增α2片段所用的引物。

MTLa_F：TTGAAGCGTGAGAGGCTAGGAG(SEQ ID NO：7)

MTLa_R：ATCAATTCCCTTTCTCTTCGATTAGG(SEQ ID NO：8)

MTLα_F：TTCGAGTACATTCTGGTCGCG(SEQ ID NO：9)

MTLα_R：TGTAAACATCCTCAATTGTACCCGA(SEQ ID NO：10)

实施例2 Wip1在白灰转换中的功能分析

1.实验对象

1）过表达质粒ACT1p-WIP1及菌株的构建

以引物WIP1F(SEQ ID NO：11)和引物WIP1R(SEQ ID NO：12)从白念珠菌基因组中扩增得到WIP1片段，经EcoR V和Cla I酶切后链接入pACT1载体（该载体由本实验室构建，构建方法见文献Proc Natl Acad Sci USA103(34):12813–12818），获得过表达质粒ACT1p-WIP1。

WIP1F：5’-GAAGATATCGCAAGGTTAAGACGTGTACGGGG-3’(SEQ ID NO：11)

WIP1R：5’-CCATCGATGAGAAAAGAAAGTGGTGTTGTTAG-3’(SEQ ID NO：12)

dSP-RF1R：5’-GTTGTACAAGATTTCTTCTGGTTATCTCTTTTTCAATAGAATGTAG

CTCGTTTCTCAC-3’(SEQ ID NO：13)

dSP-RF2F：5’-AAAGAGATAACCAGAAGAAATCTTGTACAAC-3’(SEQ ID NO：14)

将构建的过表达质粒ACT1p-WIP1用AscI线性化后导入MTLa的野生型菌株JYC5中，在SD ura-平板上筛选Ura+菌株，抽取染色体DNA并用PCR鉴定，得到重组整合到ADE2基因座表达ACT1启动子控制的WIP1基因的菌株CNX20。

2）缺少WIP1中SP-RING锌指结构域的菌株的构建

使用同样的策略还构建了表达缺少SP-RING锌指结构域的WIP1的菌株CNX21。构建步骤如下：分别以引物WIP1F和引物dSP-RF1R，以及引物dSP-RF2F和引物WIP1R从白念珠菌基因组DNA中扩增出WIP1开放阅读框的1-567位碱基以及724-1524位碱基（中间去除的片段为编码SP-RING结构域的片段），两片段经纯化后按物质的量1：1混合入PCR体系，利用dSP-RF1R带有的30bp同源序列经退火后重组获得模板，并采用引物WIP1F（SEQID NO：11）和引物WIP1R（SEQ ID NO：12）进行扩增，得到去除SP-RING结构域的片段，该片段经EcoR V和Cla I酶切后链接如pACT1载体，得到pACT1-WIP1_RING质粒，经AscI酶切线性化后转化入JYC5，得到表达缺少SP-RING锌指结构域的WIP1的菌株。

3）空白质粒对照组（WT＋V）：以导入了pACT1的野生型菌株JYC5为对照。

4）外源的诱导型野生菌株的构建（WT+MAL2p-WOR1）

将外源的诱导型、并且带有Myc标签的MAL2p-WOR1-MYC质粒（来自加州大学欧文分校刘浩平教授实验室，该质粒使用的是MAL2p诱导型启动子，可以通过在培养基中加入蔗糖来启动WOR1基因的转录，从而考察外源WOR1诱导白灰转换的过程）导入野生型菌（JYC5）中，得到诱导型野生菌株。

5)外源的诱导型wip1缺失菌株的构建（wip1+MAL2p-WOR1）

将外源的诱导型、并且带有Myc标签的MAL2p-WOR1-MYC质粒（来自加州大学欧文分校刘浩平教授实验室，该质粒使用的是MAL2p诱导型启动子，可以通过在培养基中加入蔗糖来启动WOR1基因的转录，从而考察外源WOR1诱导白灰转换的过程）导入实施例1构建的MTLa wip1/wip1双缺失株中，得到诱导型wip1缺失菌株。

2.实验方法-白灰转换实验

根据Slutsky报道的方法（1987,169(1):189.J.Bacteriol.Soll B Slutsky,M Staebell,JAnderson,L Risen,M Pfaller and D R）。Lee’s和SD培养基用于White和opaque筛选和培养，Lee’s以2％甘露醇作为碳源，并补加适当的精氨酸和锌离子。固体培养基中加入5μg/ml的Phloxine B，以便于分辨White和opaque菌落。取White或opaque菌落划线于Lee’s平板，23℃培养2-4天后，重悬划线后的菌于除菌的双蒸水。再铺Lee’s或SD板，23℃培养6-8天后取出平板拍照或统计White（白）和opaque（灰）菌落数。

3.实验结果

本实施例分别通过过表达和基因敲除实验证实了Wip1在白灰转换中的功能：

由见图3-A可知，敲除了WIP1导致白灰转换效率明显降低，同时灰-白的转换效率升高，提示缺失了WIP1的灰菌状态不稳定。

通过对诱导过程中不同诱导时间的取样，发现wip1/wip1的白灰转换相比野生型明显地滞后了。经过30小时的诱导处理，野生型有约50％的细胞发生wip1/wip1中这一比率则降低到不到5％（见图3-B）。

在野生型菌中导入ADH1p-WIP1能显著地提升白灰转换效率，在室温及空气培养条件下，相比野生型低于5％的转换效率，高表达WIP1的菌株能够以将近30％的效率进行白灰转换。

由见图4-B可知，外源导入的ACT1p-WIP1能显著地促进白灰转换，而导入ACT1p-WIP1_RING的菌株中这一促进作用就大大降低，因此我们认为WIP1对于白灰转换的促进作用很大程度上依赖于WIP1的SP-RING结构域。

同时在白灰转换的关键性调控因子WOR1的缺失株中，导入ACT1p-WIP1则不能行使白灰转换的功能。因此，WIP1对于白灰转换的促进作用是依赖于WOR1的。

实施例3 Wip1调控白灰转换的机制研究

一、Wip1与Wor1的相互作用

在研究了WIP1在白灰转换中的功能以后，本实施例进一步研究了其调控的具体机制。

1.实验材料

1）表达内源性HA-WOR1融合蛋白的菌株

设计包含WOR1orf末端60bp以及包含WOR1下游60bp的两条引物（Wor1-up59-3HA-F，Wor1-up59-3HA-R），以pJI HA-CaURA3-HA为模版（来自Jinmi Kim实验室，K.-H.Lee et al.Biochemical and Biophysical Research Communications337,2005），PCR扩增HA-URA3-HA片段。PCR产物经浓缩后转化入亲本菌，经鉴定为阳性的转化子划至含有5′-FOA的平板，促使URA3基因环出，以便后续转化。在WOR1开放阅读框的3’端整合了一段编码HA标签的序列，从而获得Wor1-HA融合蛋白。

表1整合WOR1-HA菌株构建所用引物

2）带有MYC标签的WIP1质粒的构建

以引物WIP1MF(SEQ ID NO：17)和引物WIP1DMR(SEQ ID NO：18)从白念珠菌基因组中扩增出WIP1片段，经NotI和SmaI酶切后连接入p673载体，得到带有MYC标签的WIP1质粒：WIP1-p673。所得质粒以Stu I酶切线性化后可转化入白念珠菌中。

WIP1MF：5’-GCAGCGGCCGCATGGCAAGGTTAAGACGTG-3’(SEQ ID NO：17)

WIP1DMR：5’-GCACCCGGGATCGAGAACTATTGGATCATCC-3’(SEQ ID NO：18)

3)带有MYC标签的WIP1_RING质粒的构建

以实施例2构建的pACT1-WIP1_RING质粒为模板，采用引物WIP1MF(SEQ ID NO：17)和引物WIP1DMR(SEQ ID NO：18)扩增出WIP1_RING片段，经NotI和SmaI酶切后连接入p673载体，得到带有MYC标签的WIP1_RING质粒：WIP1_RING-p673。所得质粒以Stu I酶切线性化后可转化入白念珠菌中。

2.实验方法

首先，从Wip1蛋白与已证实的关键性调控因子Wor1的联系入手。为此，我们在已经构建的WOR1末端整合了HA标签的菌中导入带有MYC标签的WIP1质粒。同时，为了考察Wip1的SP-RING结构域是否参与其与Wor1的相互作用，我们构建了WIP1_RING-p673质粒。

将上述质粒导入WOR1末端整合了HA标签的菌中，所获得的转化子经CO2诱导处理得到灰菌培养物，扩大培养体系，收取菌体，经振荡裂解后，取裂解液以Myc（Santa cruz，SC-40）抗体进行免疫沉淀，并以HA-probe（Santa cruz，SC-7392）抗体进行Western blot，结果如图5B所示，由Co-IP结果可知，Wip1能与Wor1发生相互作用，该相互作用依赖于其SP-RING结构域。

其次，为了确证这一结果，我们在酵母双杂交系统中检测了Wip1与Wor1的相互作用情况。具体操作如下：

AD-Wip1：使用引物WIP1ADF和引物WIPADR从白念珠菌野生型菌株SC5314的基因组DNA中扩增WIP1全长基因，以XhoI酶切处理后连接入载体pB42-AD（酵母双杂交中的商业化载体，来自Cloneget）中，得到表达AD-Wip1的质粒pB42-AD-WIP1。

BD-WOR1：使用引物WOR1BDF和引物WOR1BDR从白念珠菌野生型菌株SC5314基因组DNA中扩增WOR1全长基因，以NcoI和XhoI酶切处理后连接入载体pB42-BD载体（酵母双杂交中的商业化载体，来自Cloneget）中，得到表达BD-WOR1的质粒pB42-BD-WOR1。

表2酵母双杂交系统扩增引物

将表达AD-Wip1的质粒pB42-AD-WIP1与pB42-BD-WOR1共转到酵母受体菌HLY819中，用β-半乳糖苷酶活力测试实验检测报告基因LacZ的表达。结果如图5A所示。在反应过程中，阳性对照在0.5h开始显蓝色；共转AD-Wip1与BD-WOR1的酵母转化子在2.5h时开始显蓝色；共转AD与BD-WOR1的酵母转化子4.5h显浅蓝色；共转AD-Wip1与BD的酵母转化子不显色，与阴性对照一样，说明在酵母双杂交系统中Wor1能与Wip1相互作用。

用β-半乳糖苷酶活力测试实验检测报告基因LacZ的表达：取一张whatman滤纸，覆盖于相应的选择性培养基上（碳源为半乳糖），用灭菌牙签从选择性培养基平板上挑取酵母转化子菌落（直径1～2mm）点到滤纸上，30℃培养2天，然后取出小心浸入液氮中（菌落面朝上），约半分钟后取出，置室温几分钟，将滤纸（菌落面朝上）放于用Z buffer/X-gal溶液（100ml Z buffer中加入1.67ml20g/L的X-gal，0.27mlβ-巯基乙醇；Z buffer含60mMNa₂HPO₄，40mM NaH₂PO₄，10mM KCl，1mM MgSO₄）预湿的滤纸上，30℃培养0.5～8h，检验菌落是否显蓝色，8h内显蓝色的菌落β-半乳糖苷酶活性为阳性。

二、Wip1调控白灰转换机制的初步研究

1.实验方法

我们将外源的诱导型、并且带有Myc标签的WOR1外源表达质粒MAL2p-WOR1-MYC（MAL2p-WOR1-MYC质粒来自加州大学欧文分校刘浩平教授实验室）导入野生型菌（JYC5）中，通过在YPSucrose中培养来诱导外源WOR1的转录，从而获得外源的Wor1蛋白，对菌体总蛋白中的Wor1进行Western blot检测，以野生型菌株SC5314为对照，实验结果见图6B。

2.实验结果

通过Western blot检测总蛋白中的Wor1，在Wor1自身条带的上方～12KDa的位置检测到一条带，将其定义为HMW（Higher Molecular Weight）条带，从条带大小推测其为Wor1的SUMO化修饰条带；而在wip1/wip1中并未检测到这一HMW条带。

三、Wip1调控白灰转换机制的进一步研究

为验证实验一的结论，本实验在内源WOR1的末端整合了一个可供检测的HA标签，然后通过CO₂刺激得到灰菌培养物，对灰菌培养物的总蛋白进行Western blot检测，具体方法如下：

参考本实施例第一部分中，表达内源性HA-WOR1融合蛋白的菌株的构建方法，分别构建野生型及wip1/wip1中WOR1整合了HA标签的菌株（采用不同的亲本菌，构建野生型WOR1整合了HA标签的菌株所采用的亲本株为MTLa的野生型菌株JYC5，构建wip1/wip1中WOR1整合了HA标签的菌株所采用的亲本株为实施例1构建的MTLawip1/wip1双缺失株）。

上述菌株通过CO₂刺激得到灰菌菌落，对灰菌菌落进行扩大培养，收取菌体并提取总蛋白用于Western blot检测及免疫沉淀分析。

2.实验结果

通过Western blot检测总蛋白中的Wor1，在Wor1自身条带的上方～12KDa的位置检测到一条带，将其定义为HMW（Higher Molecular Weight）条带，从条带大小推测其为Wor1的SUMO化修饰条带；而在wip1/wip1中并未检测到这一HMW条带。

2.实验结果

实验结果如图6A所示，在Wor1自身条带上方～12KDa的位置检测到HMW条带，该条带在wip1/wip1中则消失。

通过对Wip1蛋白的序列分析，得到一个特征性的SP-RING结构域，这提示我们，Wip1可能是一个SUMO E3连接酶，而其与Wor1的相互作用则可能是参与了Wor1的SUMO化修饰。

四、Wor1的SUMO化位点分析

1.实验方法

在确证了Wor1的HMW条带为SUMO化修饰的Wor1以后，我们想通过点突变的策略确定其具体的修饰位点。通过SUMOplot软件分析，在Wor1蛋白序列上预测到了4个潜在的修饰位点，我们在MAL2p-WOR1-MYC质粒的基础上，分别对这4个位点进行了点突变，得到质粒MAL2p-WOR1K104R-MYC，MAL2p-WOR1K223R-MYC，MAL2p-WOR1K274R-MYC和MAL2p-WOR1K385R-MYC。质粒的构建引物如下：

表3点突变质粒的引物序列

将带有点突变WOR1的质粒导入野生型菌，通过在培养基中加入蔗糖诱导其表达，收集菌体、对总蛋白进行Western Blot分析，结果如图6B所示。

2.实验结果分析

由图6B可知，相比野生型及其他3个突变体，WOR1K385R失去了HMW条带。因此我们认为K385是Wor1发生修饰的位点。

同时，我们将上述菌株经蔗糖诱导过的培养物铺板，在室温条件下培养，检测其白-灰转换效率，结果如图7所示。与K385R点突变失去SUMO化修饰的结果对应，其诱导白灰转换的功能也显著降低。因此我们认为，Wor1K385位的SUMO化修饰对于其行使白灰转换的功能是必需的。图7B为白灰转换效率统计结果，图7A为对应的细胞形态图。

因此，Wor的第385位赖氨酸是发生SUMO化修饰的位点，这一位点的修饰对于其调控白灰转换的功能是必需的。

实施例4 WIP1基因的过表达和缺失对白念珠菌毒力的影响

为了进一步阐述WIP1对于形态转换的影响以及在白念珠菌致病性中扮演的角色，本实施对缺失株wip1/wip1进行了小鼠实验。

1.实验对象：

体重在16～18g ICR雄性小鼠；

实施例1制备的wip1/wip1双敲除白念珠菌株，实施例2构建的过表达质粒ACT1p-WIP1菌株（WT+ACT1p-WIP1)，野生型白念珠菌株（WT，SC5314)。

2.实验方法

以体重在16～18g ICR雄性小鼠作为实验对象，分为实验组（wip1/wip1）、对照组（WT+WIP1），以及空白对照组（Wildtype），每组6只小鼠，通过尾静脉注射100μl白念珠菌菌株：缺失表达组注射wip1/wip1双敲除白念珠菌株（实施例1构建的重组菌株CNX27），过表达组注射WT+WIP1（实施例2构建的重组菌株CNX20），对照组注射野生型白念珠菌株（SC5314），培养观测25天。各个菌株分高低两个浓度注射，注射浓度分别为5×10⁷细胞／毫升和5×10⁶细胞／毫升。图8所示为高浓度组的实验结果

3.实验结果

实验结果见图8，由图8可知，wip1/wip1和WT+ACT1p-WIP1均出现显著的毒力缺陷，在观察统计的时间范围内，注射野生型的小鼠在7天内全部死亡，注射WT+ACT1p-WIP1和wip1/wip1的小鼠存活率均高于注射野生型菌的小鼠。