一种杨干象特异性SS-COⅠ引物对及快速分子检测方法

技术领域

本发明涉及分子检测领域，特别涉及一种杨干象特异性SS-CO Ⅰ引物对及快速分子检测方法。 

背景技术

杨干象Cryptorrhynchus lapathi(Linnaeus)，属鞘翅目Coleoptera 象甲科Curculionidae、隐喙象亚科Cruptorrhynchinae、隐喙象属Cryptorrhynchus。现为全国林业检疫性有害生物。该虫主要以幼虫蛀食杨树和旱柳等杨柳科树木的干部危害，成虫取食幼树的嫩枝和叶片作为营养补充，常导致受害树木长势衰弱，受害部位枯死，最后导致整株死亡。同时，由于幼虫在木材中蛀食所形成的蛀道，严重影响了其使用价值(艾云艳,2007；李亚杰等,1981)。随着我国杨树引种和造林事业的发展，目前该虫的分布与危害有与日俱增的趋势，严重威胁着杨树人工林和三北防护林生态系统工程和建设和巩固。因此，有效控制该虫的发生和蔓延，对于保障我国三北地区的生态环境建设和经济发展具有非常重要的意义。 

据1999-2001年全国森林植物检疫对象普查资料结果，杨干象国内分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、内蒙古、甘肃、新疆。全国发生面积14.18万hm²。该虫本身不传带其它有害生物，自然扩散靠成虫爬行，远距离传播主要是靠人为调运携带有该虫的苗木和无性系株或新采伐的带皮原木。所以传播扩散的可能很大。资料显示,杨干象被朝鲜、德国、法国、加拿大、捷克、美国、俄罗斯、日本、斯洛伐克、意大利、英国等国家列为检疫性及危险性病虫名单,我国进境植 物检疫将其列为《寄主和检疫性或危险性病虫名单》。在我国极具潜在的经济危害性。 

2009年，国家林业局森林病虫害防治总站颁布了《杨干象检疫技术规程》，规定对于杨树国际贸易或国内调运，应尽量在非疫区进行；对于从杨干象发生地区外运的杨树苗木和无性系株或新采伐的带皮原木要严格检查是否带虫；根据外部症状进行鉴定，确认无疫情发生时，签发植物检疫证书后调运。并对杨干象的形态特征和危害状进行了描述。 

然而，为了将杨干象与我国同域发生的近缘种象甲区分开来，需要大量形态学鉴别工作，这些工作大多费时、费力且需要专业的昆虫分类学知识。同时，处于卵、幼虫、蛹这三个虫态的象甲类昆虫在形态上非常相似，目前还没有可靠的鉴定特征。 

现有技术主要依靠杨干象成虫的形态学特征进行鉴定，而卵、幼虫和蛹这三个虫态则很难进行准确鉴定。因此，在实际工作中需要将非成虫虫态的杨干象饲养至成虫才能进行鉴定，而杨干象饲养难度大且耗时长；同时，与杨干象同科的其它象甲种类，特别是近缘种在卵、幼虫、蛹和成虫的形态特征上非常相似，难以用形态学方法进行分类鉴别。另外，在实际鉴定中，通常由专门从事象甲分类的专业人员进行鉴定，而基层的检验人员大都不具备这方面的能力，无法满足实际检疫工作需要。 

近些年，越来越多的研究已证明分子生物学手段能够为昆虫鉴定提供有力依据。线粒体DNA严格母性遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(COI)具有高度保守，结构稳定，无内含子的特点(Simon等，1994)。因此，经常被用于物种分类、鉴定和亲缘关系的研究 (Caterino等，2000；Herbert等，2003)。 

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种杨干象特异性SS-COⅠ引物对及快速分子检测方法，基于COI基因设计杨干象的种特异性引物，构建杨干象的快速分子鉴定体系。是一种快速稳定、不受虫态限制、简单易行的杨干象检测技术，可广泛应用于基层检验检疫及相关部门对杨干象的鉴定。 

为达到上述目的，本发明的技术方案为： 

一种杨干象特异性SS-CO Ⅰ引物1对(CLSSF1/CLSSR1)： 

CLSSF1：5’-CTT GGG ATT TGC AGT ATG AGC-3’ 

CLSSR1：5’-TTT GGA GTT TAG GGT GAG AC A-3’ 

一种杨干象快速分子检测的方法，包括如下步骤： 

步骤一、昆虫基因组DNA的提取； 

步骤二、象甲COⅠ基因序列的扩增； 

步骤三、近缘种多重序列对比及种特异性引物设计 

将PCR产物送诺赛生物(北京)公司进行双向测序，得到CO Ⅰ序列。使用DNAstar对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GeneBank中进行Blast序列比对。根据9种象甲的测序结果以及数据库中已公开的4种象甲的碱基序列进行对比分析，运用软件Primer Primer5.0软件设计杨干象特异性SS-CO Ⅰ引物1对(CLSSF1/CLSSR1)： 

CLSSF1：5’-CTT GGG ATT TGC AGT ATG AGC-3’ 

CLSSR1：5’-TTT GGA GTT TAG GGT GAG AC A-3’ 

步骤四、杨干象SS-CO Ⅰ引物的种特异性引物扩增体系的建立优化 

PCR扩增反应使用GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，反应体系与CO Ⅰ基因序列扩增体系相同(见表1)。扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃复性45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上；经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。 

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明鉴定方法快速稳定，对操作人员的专业技术能力要求较低，无需掌握杨干象的形态鉴别特征，同时，不受其虫态限制。可广泛应用于基层的检验检疫及相关部门。 

附图说明

图1琼脂糖凝胶电泳检测九种象甲PCR扩增产物的检测图：a.CO Ⅰ通用引物扩增产物电泳图；b.杨干象特异性SS-CO Ⅰ引物扩增产物电泳图。 

图注：M：DL2000 DNA marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-杨干象Cryptorrhynchus lapathi，2-红棕象甲Rhynchophorus.ferrugineus，3-沟眶象Eucryptorrhynchus.chinensis，4-臭椿沟眶象Eucryptorrhynchus brandti，5-芒果果核象甲Odoiporus. longicollis，6-香蕉球茎象甲Cryptorrhynchus.lapathi,7-马尾松角胫象Shirahoshizo patruelis，8-玉米象Sitophilus zeamais，9-松瘤象Hyposipalus gigas，10-阴性对照。 

图2琼脂糖凝胶电泳检测杨干象种特异性引物的灵敏度 

图注：M：DL2000 DNA marker(从上至下2,000,1000,750,500,250,100bp)；泳道1-6分别代表：20ng,2ng,200pg,20pg,2pg和200fg的杨干象基因组DNA，泳道7-阴性对照。 

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明方案做进一步详细描述： 

试验例1 

1.昆虫基因组DNA的提取 

基因组DNA提取都采用BIOMIGA公司的EZgene^TM Insect gDNA Kit(GD2413-02)试剂盒。 

具体操作步骤： 

(1)将在纯酒精中浸泡的标本用超声波仪器清洗干净晾干后，成虫去头和鞘翅，幼虫取其腹部组织。取＜50mg的组织于研钵中充分研磨，置于1.5ml的离心管中。 

(2)向离心管中加入350ul的Buffer ITL与25ul的蛋白酶K(25mg/ml)，充分混匀后置于60℃恒温水浴锅两个小时直到组织完全被消化。 

(3)在离心管中加入350μl的氯仿：异戊醇(24:1)缓慢混匀，在室温，10,000转速下离心2min，并小心的将上清液转移到新的干净的1.5ml离心管中。 

(4)加入1倍体积的的BufferBL与5μl的RNaseA,缓慢混匀，70℃水浴半小时。 

(5)加入1倍体积的无水乙醇(室温)，缓慢混匀。 

(6)将前一步的溶液和絮状沉淀700μ加入吸附柱内(吸附柱安放于收集管内)，10,000xg室温下离心1min，移除废液，吸附柱重新置于收集管内。如此时仍有剩余混合液则重复第6步。 

(7)将吸附柱重新置于新的收集管内，加入500μl的BufferKB，10,000xg室温下离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内。 

(8)加入600μl的DNAWashBuffer，10,000xg离心30s，移除废液，吸附柱重新置于收集管内。 

(9)重复第8步，将吸附柱置于新的收集管内，在吸附柱的盖子打开的条件下，13,000sg室温离心2min，后置于室温下数分钟，使酒精充分挥发。 

(10)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入30μl的Elution Buffer，Elution Buffer在60℃—70℃条件下预热，室温放置2分钟，在13,000xg下离心2min。 

(11)重复第10步，以便提高产量。 

2.象甲CO Ⅰ基因序列的扩增 

根据文献报道，合成象甲类昆虫CO Ⅰ基因序列扩增通用引物： 

C1-J-2183:5’-CAA CAT TTA TTT TGA TTT TTT GG-3’， 

TL-2-N-3014：5’-TCC ATT GCA CTA TAC TGC CAT ATT A-3’ 

PCR扩增反应使用GreenMaster Mix试剂盒(Promega)， 总体系为25μl，各成分如表1所示： 

表1 PCR反应体系 

混匀后放入PCR仪中进行扩增，扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，49℃复性45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。 

3.近缘种多重序列对比及种特异性引物设计 

将PCR产物送诺赛生物(北京)公司进行双向测序，得到CO Ⅰ序列。使用DNAstar对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GeneBank中进行Blast序列比对。根据9种象甲的测序结果以及数据库中已公开的4种象甲的碱基序列进行对比分析，运用软件Primer Primer 5.0软件设计杨干象特异性SS-CO Ⅰ引物1对(CLSSF1/CLSSR1)： 

CLSSF1：5’-CTT GGG ATT TGC AGT ATG AGC-3’ 

CLSSR1：5’-TTT GGA GTT TAG GGT GAG AC A-3’ 

4.杨干象SS-CO Ⅰ引物的种特异性引物扩增体系的建立优化 

PCR扩增反应使用GreenMaster Mix试剂盒(Promega)，反应体系与COⅠ基因序列扩增体系相同(见表1)。扩增的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃复性45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。每次反应用无菌蒸馏水做一个空白对照，用以排除系统误差。取3μl产物上样到1.5％TAE琼脂糖凝胶上。经130V电泳20min后，将胶块浸泡于EB染料中3min，在紫外分光光度计下检测拍照。 

试验例2 

1.杨干象SS-CO Ⅰ引物的种特异性检验 

以国内与杨干象同域发生和其他常见的8种象甲类昆虫DNA为模板，以杨干象DNA为阳性对照(检测DNA均为10ng/μl浓度的母液)。检验杨干象SS-CO Ⅰ引物CLSSF1/CLSSR1的种特异性。 

利用COⅠ通用引物，9种象甲均扩增约830bp的产物，而利用本发明设计的杨干象特异性SS-CO Ⅰ引物CLSSF1/CLSSR1进行PCR，仅有杨干象成功扩增，产物为396bp，对其它8种象甲和阴性对照均不具有扩增能力(见图1)，表明该对引物为杨干象的种特异性引物。 

2.杨干象SS-CO Ⅰ引物的灵敏度检验 

将杨干象DNA样本按照(1:10)的比例依次稀释成10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl的标准液。利用不同浓度梯度的杨干象DNA标准品进行特异性引物灵敏度检验(见图2)。 PCR检验的最小检测限度为200pg的基因组DNA。 

综合上述研究，杨干象种特异性引物(SSF1/SSR1)只对杨干象具有扩增效果，对同域发生和其他国内常见的象甲类昆虫不具有扩增能力；特异性引物灵敏度高，能够检测最低为200pg的基因组DNA；对靶标序列的Blast结果显示，该片段与已报道杨干象序列一致性为100％。结果表明该发明可用于出入境检验检疫过程中杨干象的快速鉴定。 

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。