法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-07-03
授权
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2020-02-11
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/6888 申请日:20191024
实质审查的生效
2020-01-14
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种针对塔里木兔的个体识别方法，属于动物的测定和检验技术领域。
背景技术
塔里木兔(Lepus yarkandensis)属兔形目(lagomorphs)兔科(leporidae)兔属(lepus)。英文名为Yarkand hares。其体形较小，毛色沙黄，体长为29—43cm，尾长6—11cm，体重1.2—1.6kg，耳朵较大，耳尖不呈黑色，体毛短而直。分布于新疆塔里木盆地，北起库尔勒、库车；南抵和田、且末；西止阿克苏、喀什，东达罗布洼地，几乎所有的县境内均有发现。塔里木兔是我国特有的一个物种，在世界范围内的分布仅限于新疆的塔里木盆地。但近几年来，由于人类大量捕杀，造成塔里木兔数量急剧下降，1989年被列为国家二级重点保护动物。前人对塔里木兔的研究主要是对其地理分布等资源现状进行分析或利用线粒体DNA(mtDNA)上的部分基因片段，如控制区(D-loop)、细胞色素b(Cytb)基因进行种群遗传多样性分析。迄今，还没有利用核DNA上的STR(short tandem repeat，短片段重复序列)多态性对塔里木兔进行遗传多样性分析的报道。
STR广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，它们一般由2-6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了群体中这些重复序列的多态性。由于人类及哺乳动物基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系，区分不同个体的方法叫做“个体识别”，也被称为“同一认定”。在偷猎、运输、贩卖、食用塔里木兔的野生动物案件中往往只能获得塔里木兔的肢体、毛皮，在某些案件现场甚至只能获得少量血痕、毛发，对塔里木兔的个体识别方法的研发将有助于识别案件中的不同肢体、尸块、皮毛、血痕或毛发样本来自几只塔里木兔。作为国家二级重点保护动物，涉案塔里木兔的个体数量将直接影响量刑，如涉案塔里木兔的个数达到20只及以上即属于非法狩猎“情节严重”的刑事案件。因此，对塔里木兔个体识别方法的研发将解决目前无法识别不同检材是否来自不同个体的问题。而本发明能够很好地解决上述的问题。
发明内容
针对上述现有技术的缺陷，本发明目的在于提出一套可用于塔里木兔个体识别的引物序列，并提出一种针对塔里木兔的个体识别方法，该方法利用STR片段检测及多样性分析所筛选出的12个可用于塔里木兔个体识别的STR位点，并对这12个STR位点进行扩增和毛细管电泳检测，通过分析毛细管电泳检测得到的分型数据和计算个体识别的证据强度，来进行塔里木兔的个体识别。该方法可以有效解决对偷猎塔里木兔案件的准确量刑问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下所述：
一种针对塔里木兔的个体识别方法，包括如下步骤：
(一)筛选用于个体识别的STR位点：通过STR片段检测及多样性分析筛选出12个可用于塔里木兔个体识别的STR位点，扩增这12个STR位点的引物序列如表1所示。其中，这12个STR位点遗传学数据如表2、表3所示。
表1扩增塔里木兔STR位点所用引物序列
表2塔里木兔12个STR位点等位基因频率分布表(群体样本量n＝60)
表3塔里木兔12个STR位点各遗传参数统计结果
注：Na:观测等位基因，Ne:有效等位基因，I：香农指数，PIC：多态信息指数，Ho：观测杂合度，He：期望杂合度
(二)检测样本DNA的提取：针对塔里木兔的不同状态的样本采用不同的取样方法。
肌肉组织剪取约10mg～30mg置于EP管中，骨骼磨取约20mg～30mg骨粉置EP管中，皮毛剪取皮部分(若只有毛发则剪取毛发的毛囊部分)约10mg～30mg置于EP管中、血痕剪取适量置EP管中。样本的基因组总DNA均用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取，提取方法参照试剂盒说明书，骨骼、毛发组织消化时间延长为20～30h。用分光光度法检测样本DNA的纯度和浓度。将提取到的样品总DNA置于-20℃～-70℃保存，待后续试验用。
(三)STR复合扩增
分别将需要进行同一认定(个体识别)的样本DNA作为模板DNA，选取表1中的各STR位点引物分别扩增各STR位点，得到STR扩增产物。
(1)PCR扩增体系配方为下述两种配方中的任意一种：
配方一：
配方二：
(2)PCR扩增条件为：首先在98℃保温2min，然后进行30个保温循环，所述保温循环为在98℃保温10s、在60℃保温10s、在72℃保温10s，最后在72℃保温5min，保温结束后将样品置于4℃保存。
(四)扩增产物的毛细管电泳检测
(1)将甲酰胺(HiDi)与毛细管电泳内标GS500liz按体积比130:1混合，配成mix。
(2)用国产96孔反应板分装mix，每个孔中加入10μl mix。
(3)对应着在96孔板中加入0.5μl STR扩增产物，离心到4000rpm即停。
(4)用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5min，拿出后立即放入-20℃环境中。
(5)冷却后拿出，4000rpm离心，解冻、混匀。
(6)上测序仪进行毛细管电泳分析。
(7)结果图谱用GeneMapper软件进行分析，得到塔里木兔STR分型图谱。
(五)同一认定的统计学计算：塔里木兔STR分型图谱示例如图1所示，当两份样本在所检测的12个基因座的STR分型图谱完全一致时，需计算其个体识别的证据强度，即似然率(likelihood ratio,LR)。
所述个体识别的证据强度的计算方法为：
LR＝1/P(X)
其中P(X)代表表型组合X的组合概率。
P(X)＝P1×P2×P3×…×Pi
Pi为第i个基因座的表型频率。
(六)个体识别的认定：似然率大于或等于1×1012时可认定两份样本的同一性，即两份样本属于不同的塔里木兔个体。若两份样本在所检测的12个基因座存在不一致的STR分型图谱，可排除两份样本的同一性，即两份样本属于不同的塔里木兔个体。
本发明的技术方案具有如下有益效果：
1、所述方法操作简单，结果显著，能快速确认样本间的同一性，进行个体识别。
2、在使用本方法进行个体识别时，准确度高。
3、能够在多份样品中，明确区分来自不同的塔里木兔个体的样品，从而有效解决对偷猎塔里木兔案件的准确量刑问题。
附图说明
图1是本发明实施例中1号塔里木兔样本DNA的STR分型图谱示例图(A—L分别为PVJM-2、PVJM-31、PVJM-58、PVJM-76、PVJM-42、PVJM-5、PVJM-64、PVJM-89、PVJM-11、PVJM-46、PVJM-74、PVJM-93位点的图谱)；
图2是本发明实施例中2号塔里木兔样本DNA的STR分型图谱示例图(A—L分别为PVJM-2、PVJM-31、PVJM-58、PVJM-76、PVJM-42、PVJM-5、PVJM-64、PVJM-89、PVJM-11、PVJM-46、PVJM-74、PVJM-93位点的图谱)；
图3是本发明实施例中3号塔里木兔样本DNA的STR分型图谱示例图(A—L分别为PVJM-2、PVJM-31、PVJM-58、PVJM-76、PVJM-42、PVJM-5、PVJM-64、PVJM-89、PVJM-11、PVJM-46、PVJM-74、PVJM-93位点的图谱)；
图4是本发明实施例中4号塔里木兔样本DNA的STR分型图谱示例图(A—L分别为PVJM-2、PVJM-31、PVJM-58、PVJM-76、PVJM-42、PVJM-5、PVJM-64、PVJM-89、PVJM-11、PVJM-46、PVJM-74、PVJM-93位点的图谱)；
图5是本发明实施例中5号塔里木兔样本DNA的STR分型图谱示例图(A—L分别为PVJM-2、PVJM-31、PVJM-58、PVJM-76、PVJM-42、PVJM-5、PVJM-64、PVJM-89、PVJM-11、PVJM-46、PVJM-74、PVJM-93位点的图谱)；
图6是本发明实施例中6号塔里木兔样本DNA的STR分型图谱示例图(A—L分别为PVJM-2、PVJM-31、PVJM-58、PVJM-76、PVJM-42、PVJM-5、PVJM-64、PVJM-89、PVJM-11、PVJM-46、PVJM-74、PVJM-93位点的图谱)；
图7是本发明实施例中7号塔里木兔样本DNA的STR分型图谱示例图(A—L分别为PVJM-2、PVJM-31、PVJM-58、PVJM-76、PVJM-42、PVJM-5、PVJM-64、PVJM-89、PVJM-11、PVJM-46、PVJM-74、PVJM-93位点的图谱)。
具体实施方式
现结合说明书附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例采用上述塔里木兔的个体识别方法进行样品DNA的个体识别，具体过程包括：
(一)扩增针对塔里木兔个体识别的STR位点：利用STR片段检测及多样性分析所筛选出的12个可用于塔里木兔个体识别的STR位点及扩增这12个STR位点的引物序列如上述表1所示。其中，这12个STR位点遗传学数据如上述表2和表3所示。
(二)检测样本DNA的提取：针对塔里木兔的不同状态的样本采用不同的取样方法。
肌肉组织剪取约10mg～30mg置于EP管中，骨骼磨取约20mg～30mg骨粉置EP管中，皮毛剪取皮部分(若只有毛发则剪取毛发的毛囊部分)约10mg～30mg置于EP管中、血痕剪取适量置EP管中。样本的基因组总DNA均用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取，提取方法参照试剂盒说明书，骨骼、毛发组织消化时间延长为20～30h。用分光光度法检测样本DNA的纯度和浓度。将提取到的样品总DNA置于-20℃～-70℃保存，待后续试验用。
本实施例中共提取了7份样本DNA，分别为肌肉组织3份，编号为1号、2号、3号；骨骼组织2份，编号为4号、5号；血痕1份，编号为6号；皮毛组织1份，编号为7号。
(三)STR扩增
分别将需要进行同一认定(个体识别)的样本DNA作为模板DNA，选取表1中的各STR位点引物分别扩增各STR位点，得到STR扩增产物。
(1)PCR扩增体系配方为下述两种配方中的任意一种：
配方一：
配方二：
(2)PCR扩增条件为：首先在98℃保温2min，然后进行30个保温循环，所述保温循环为在98℃保温10s、在60℃保温10s、在72℃保温10s，最后在72℃保温5min，保温结束后将样品置于4℃保存。
(四)扩增产物的毛细管电泳检测
(1)将甲酰胺(HiDi)与毛细管电泳内标GS500liz按体积比130:1混合，配成mix。
(2)用国产96孔反应板分装mix，每个孔中加入10μl mix。
(3)对应着在96孔板中加入0.5μl STR扩增产物，离心到4000rpm即停。
(4)用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5min，拿出后立即放入-20℃环境中。
(5)冷却后拿出，4000rpm离心，解冻、混匀。
(6)上测序仪进行毛细管电泳分析。
(7)结果图谱用GeneMapper软件进行分析，得到塔里木兔STR分型图谱，结果如图1-图7所示，图中检测峰下方方框中数值为分型数据，各位点分型数据如表4所示。
表4.塔里木兔样本STR分型数据
(五)同一认定的统计学计算：塔里木兔STR分型图谱示例如图1—图7所示，当两份样本在所检测的12个基因座的STR分型完全一致时(如6号样本和7号样本，见图6、图7、表4)，需计算其个体识别的证据强度，即似然率(likelihood ratio,LR)。所述个体识别的证据强度的计算方法为：
LR＝1/P(X)
其中P(X)代表表型组合X的组合概率。
P(X)＝P1×P2×P3×…×Pi
Pi为第i个基因座的表型频率。
如6号样本和7号样本在12个基因位点的STR分型图谱完全一致(如图6、图7所示)，需计算其似然率，计算结果如表5所示，似然率为2.01303×1014。
表5.6号、7号塔里木兔样本基因型频率计算及似然率计算表
(六)个体识别的认定：似然率大于或等于1×1012时可认定两份样本的同一性。若两份样本在所检测的12个基因座存在不一致的STR分型图谱，可排除两份样本的同一性。
从表5中可以看出，编号为6号与编号为7号的样本DNA具有同一性，属于同一塔里木兔个体，其似然率为2.01303×1014；而1号、2号、3号、4号、5号、6号样本之间不具有同一性，属于不同塔里木兔个体。
需要说明的是，以上具体实施方式的描述并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
机译： 用于检测个体血管疾病的方法，检测个体NCER的方法，用于治疗患有疾病血管疾病的个体的方法，用于确定抗高血压治疗血管生成素的有效性的可能性，用于确定在调节血管生成调节剂n ecveis血小板中进行测试的疗法的有效性，用于创建针对疾病或紊乱血管生成血小板的记录或特征并用于监测具有u的个体治疗的疗效。一种疾病或血管疾病
机译： 一种管理生物遗传资源的个体识别装置及使用该方法的个体识别方法
机译： 一种针对病毒性兔出血热的重组疫苗的制备方法，重组抗原在疫苗生产中的应用
