尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体及其编码基因，和在制备维生素B₁₂中的应用。

背景技术

维生素 B₁₂>12)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基（R基团）种类不同，维生素B₁₂可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B₁₂参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。

由于维生素B₁₂分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B₁₂的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。

目前，国内外针对维生素B₁₂生产菌生物合成维生素B₁₂的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb>12的能力（程立芳等,>

本发明人前期筛选出了一株高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC>12。而在苜蓿中华根瘤菌中，ALA（5-氨基乙酰丙酸）和尿卟啉原Ⅲ是维生素B₁₂合成途径的关键前体物质。ALA在ALA脱水酶(HemB，由基因hemB编码)的催化下生成胆色素原，然后胆色素原在羟甲基胆素合成酶(HemC，由基因hemC>hemD编码)催化生成含有四吡咯环的尿卟啉原Ⅲ（Huan>12:>Microbial Cell Factories.2017>hemD用于维生素B₁₂合成的报道。

发明内容

本发明人对前期筛选出的高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC>12能力提高的诱变菌株。本发明作了进一步研究以发现对产维生素B₁₂能力有影响的基因。经过研究发现尿卟啉原Ⅲ合成酶基因hemD和突变基因导入苜蓿中华根瘤菌中过表达，能够提高所述菌的产维生素B₁₂的能力。

首先，本发明提供一种尿卟啉原Ⅲ合成酶基因的突变体，其特征在于，其氨基酸序列相对于如SEQ ID NO：4所示的多肽具有下述突变：第53位氨基酸替换为V，和第173位氨基酸替换为S。更优选，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

其次，本发明提供编码如上述的尿卟啉原Ⅲ合成酶的突变体的编码基因。更优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

第三方面，本发明提供尿卟啉原Ⅲ合成酶编码基因或其突变体的编码基因在在制备维生素B₁₂中的应用。

在具体实施方式中，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。更优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。

其中优选地，所述尿卟啉原Ⅲ合成酶编码基因编码具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽；所述尿卟啉原Ⅲ合成酶的突变体编码基因编码具有SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6所示氨基酸序列的多肽，优选地所述尿卟啉原Ⅲ合成酶编码基因具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。其中，所述导入的编码基因位于质粒或染色体中。

经研究证实，本发明中，过表达尿卟啉原Ⅲ合成酶基因hemD和突变基因的工程菌生物安全，可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B₁₂的能力。经过实验，数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，可以提高产维生素B₁₂的能力达12.5%，而突变基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达能进一步提高产维生素B₁₂的能力即提高20%以上。

附图说明

图1：质粒载体pBBR-P21-hemD的结构图。

图2：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的VB₁₂产量。

图3：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的生物量。

图4：维生素B₁₂的标准曲线图。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

培养基配方：

LB 培养基（g/L）：氯化钠 10 ，胰蛋白胨10 ，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。

种子培养基（g/L）：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH₄)₂SO₄>4)₂HPO₄>4·H₂O>2·6H₂O>4·7H₂O>3>

发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(NH₄)₂SO₄>4 1.5,>2HPO₄0.75，CoCl₂·6H₂O>4·7H₂O>3>

维生素B₁₂的检测方法

（1） 样品预处理

取1 mL发酵液，加入8%的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25mL摇匀，置于95～100℃水浴中30-40 min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜(⌀= 0.22µm)过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl 2%的NaCN (w / v)至1mL的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。

（2）标准品的制备

配置梯度维生素B₁₂标准品(20>

（3）HPLC检测条件

C18-250A柱（Agilent，4.6 mmid 9×250 mm，5µm）。流动相为70%有机相（乙腈）和 30%无机相（乙酸钠水溶液），吸收波长为361 nm，柱温为35℃，流速0.8 mL/min，进样量20 µL。

（4）维生素B₁₂标准曲线的绘制

将不同浓度的标准品按上述条件进行HPLC检测，绘制峰面积A-VB₁₂浓度标准曲线。以测得的峰面积A为纵坐标，维生素B₁₂质量浓度C（mg/L）记为横坐标，绘制维生素B₁₂标准曲线。见图4，得回归方程y=19.846x-80.857，R²=0.>12标准曲线计算样品产量。

实施例1：常压室温等离子体（ARTP）诱变时间的确定、突变体库的构建及高产菌种的获得

（1）致死率的测定

为了获得一个比较广的突变体库，对底盘细胞苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638进行了常压室温等离子体（ARTP）诱变。首先，对等离子诱变条件下CGMCCNO.9638的致死率进行测定。将种子用LB培养基培养至对数中期的CGMCCNO.9638细胞(OD₆₀₀=1)>8个细胞/mL的悬液。取10uL悬液均匀的涂布在铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间分别为0>-3，取稀释后的细胞悬液100>

从表1中可知，诱变10s时的致死率为82.2％，诱变15s时的致死率达到95％以上，致死率为80％-90％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择10s作为最终构建突变体库的诱变时间。

（2）突变体库的构建及筛选

取浓度为10⁸个/mL的细胞悬液10>-3，取稀释后的细胞悬液100>

（3）突变株96深孔板发酵初筛

分别挑取平板上的所有单菌落接种于含有500uL的种子培养基的96深孔板中（每个孔板上包含6株对照菌株CGMCC NO.9638），30℃、800rpm、80%湿度振荡培养36h后，按10%（v/v）接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80%湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

（4）突变株96深孔板发酵复筛

将步骤（3）中产量排前30的株菌的单菌落（包含一个对照菌株CGMCC NO.9638）接种于含有500uL种子培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80%湿度振荡培养36h后，按10%（v/v）接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中（每株菌3个平行），30℃、800rpm、80%湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

重复步骤（3）和（4）三次，最后获得一株高产维生素B₁₂的菌种SM*，96孔板中产量从50>

实施例2：突变菌株与出发菌株进行比较基因组分析

将菌种SM*和出发菌株CGMCC NO.9638送金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序。通过比较两个菌株的全基因组序列发现尿卟啉原Ⅲ合成酶基因hemD发生了点突变，其第158位和第517位核苷酸均由T置换了C。为了验证突变位点对维生素B₁₂产量的影响，我们将突变前和突变后的hemD基因在出发菌种CGMCC>

实施例3：pBBR-P21-hemD质粒载体的构建

分别利用表2的引物对P21-XbaI-F和P21-R，以Ensifer> Casida A（黏着剑菌）基因组为模板，通过PCR 扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI（NEB公司）在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21片段。P21启动子序列如SEQ>

分别利用表2的引物对hemD-F和hemD-EcoRI-R，以CGMCC NO.9638基因组为模板，通过PCR 扩增，引入EcoRI酶切位点，得到hemD片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的hemD片段。hemD基因核苷酸序列如SEQ>

然后，利用引物对P21-XbaI-F和hemD-EcoRI-R，以纯化的P21片段和hemD片段为模板，通过融合PCR，得到P21-hemD片段（含XbaI和EcoRI酶切位点），经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-hemD片段。

将上述纯化的P21-hemD片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和EcoRI进行双酶切，将P21-hemD片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-P21-hemD。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-hemD备用，质粒图谱如图1所示。

实施例4：pBBR-P21-hemD（C158T）质粒载体的构建

以质粒pBBR-P21-hemD为模板，用引物对>DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的产物。取30ng纯化后的产物加入2>E.coli/pBBR-P21-hemD（C158T），其中含有突变基因的核苷酸序列如SEQ>hemD（C158T）备用。

实施例5：pBBR-P21-hemD（C158T，C517T）质粒载体的构建

以质粒pBBR-P21-hemD（C158T）为模板，用引物对>DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的产物。取30ng纯化后的产物加入2>E.coli/pBBR-P21-hemD（C158T，C517T）其中含有突变基因的核苷酸序列如SEQ>hemD（C158T，C517T）备用。

实施例6：含质粒载体菌株的构建

将实施例3至5中的4个质粒pBBR1MCS2、pBBR-P21-hemD、pBBR-P21-hemD（C158T）和pBBR-P21-hemD（C158T，C517T）按照如下方法转入苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638中：

（1）接种新活化的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638、大肠杆菌（含有相应的质粒）以及辅助载体MT616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到OD值为1.0左右；

（2）无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638的菌液、MT616和大肠杆菌的菌液各500 μL转移至1.5mL无菌EP管中并在4 ℃，12,000 rpm条件下离心1 min。

（3）在无菌条件下弃掉上清液，并用1mL 0.85%的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。

（4）再次在4℃，12,000 rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。

（5）分别采用500μL新鲜的LB液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和MT616的沉淀进行悬浮。

（6）分别取各2μL的三种菌液，滴在不添加抗性的LB固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。

（7）待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。

（8）挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。

（9）从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落PCR验证。得到阳性苜蓿中华根瘤菌:SM/pBBR (对照菌)、SM/pBBR-P21-hemD（简写为SM1）、SM/>hemD（C158T）（简写为SM2）、SM/>hemD（C158T，C517T）（简写为SM3）。

实施例7：不同菌株评价

1、苜蓿中华根瘤菌的培养条件：

将对照菌、SM1、SM2和SM3菌株在无菌条件下用接种针在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，30℃恒温静置48 h培养，获得单菌落。用接种针挑取单菌落于装有5 mL含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基的试管中，30℃，200 rpm培养36h。将种子培养基按照10%比例接种至含有100mg/L卡那霉素的30mL发酵培养基中（250ml摇瓶）。30℃震荡（220 r/min）培养144 h后收集菌体并检测产量。摇瓶发酵每个实验做3个平行。

、不同苜蓿中华根瘤菌菌株产维生素B₁₂能力和生物量的比较

SM1、SM2和SM3三个菌株与对照菌相比生产维生素B₁₂的能力均得到提高。结果如表3所示。

其中SM1提高12.5%,，SM2提高20%，SM3提高 28.8%（见表3和图2）。结果说明本发明中的点突变基因hemD编码的尿卟啉原Ⅲ合成酶的活性得到了增强，进而提高了菌株生产维生素B₁₂的能力。四个菌株生物量变化不大，说明hemD基因的过表达未对菌体的生长造成影响（见表3和图3）。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>尿卟啉原Ⅲ合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用

<160>15

<170> PatentIn Version 3.1

<210>1

<211> 714

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 1

atgcgcgtgc tcgtcacccg gccgcttccc gccgccgagg cgacggtacg ccggctggaa 60

gccgccggcc accggccgat cctgctgccg ctgatgcagg cgacacatct tgctgccgtc 120

tctgttgccg cgcttgaagt gccgcatgcg gcgatcgcgc tcaccagcgc cgaagccatt 180

cgggtgctcg tatcgtcaga tgcagacctg tcacagcatc tggcgacccc gtgcttctgc 240

gtgggcgccg ccacggcgca agcagcagcc gggctcggtt tctccgatct gcgcatagcg 300

gagggtaccg gccagtccct ggcggaactg atcggtgcga ccatcgacac gctgccgcca 360

cttcccctgc tctatctggc aggaacgccg cgctccgaag ggctggaaaa gggactgaga 420

caccgcggca tcgaacaccg gacggtcgag tgctaccgca tggagccgat cgcccattcg 480

cgcgccgcga tcgaagatct gcggcgaagc agccgtcccg acgccgtgct tttatactcg 540

cgagagaccg cgcgacagtt cgttcgcctg ctttccgaag ccggtgtcga tgctgcttcc 600

tttgcgccgc gctacctctg cctcagcccc gtggtggccg aggcactgcc gggtaacgtc 660

gtggcggaga ccgccgcaag caccgatgaa gacagccttt tcagtcttct ctaa 714

<210>2

<211> 714

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 2

atgcgcgtgc tcgtcacccg gccgcttccc gccgccgagg cgacggtacg ccggctggaa 60

gccgccggcc accggccgat cctgctgccg ctgatgcagg cgacacatct tgctgccgtc 120

tctgttgccg cgcttgaagt gccgcatgcg gcgatcgtgc tcaccagcgc cgaagccatt 180

cgggtgctcg tatcgtcaga tgcagacctg tcacagcatc tggcgacccc gtgcttctgc 240

gtgggcgccg ccacggcgca agcagcagcc gggctcggtt tctccgatct gcgcatagcg 300

gagggtaccg gccagtccct ggcggaactg atcggtgcga ccatcgacac gctgccgcca 360

cttcccctgc tctatctggc aggaacgccg cgctccgaag ggctggaaaa gggactgaga 420

caccgcggca tcgaacaccg gacggtcgag tgctaccgca tggagccgat cgcccattcg 480

cgcgccgcga tcgaagatct gcggcgaagc agccgtcccg acgccgtgct tttatactcg 540

cgagagaccg cgcgacagtt cgttcgcctg ctttccgaag ccggtgtcga tgctgcttcc 600

tttgcgccgc gctacctctg cctcagcccc gtggtggccg aggcactgcc gggtaacgtc 660

gtggcggaga ccgccgcaag caccgatgaa gacagccttt tcagtcttct ctaa 714

<210>3

<211> 714

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 3

atgcgcgtgc tcgtcacccg gccgcttccc gccgccgagg cgacggtacg ccggctggaa 60

gccgccggcc accggccgat cctgctgccg ctgatgcagg cgacacatct tgctgccgtc 120

tctgttgccg cgcttgaagt gccgcatgcg gcgatcgtgc tcaccagcgc cgaagccatt 180

cgggtgctcg tatcgtcaga tgcagacctg tcacagcatc tggcgacccc gtgcttctgc 240

gtgggcgccg ccacggcgca agcagcagcc gggctcggtt tctccgatct gcgcatagcg 300

gagggtaccg gccagtccct ggcggaactg atcggtgcga ccatcgacac gctgccgcca 360

cttcccctgc tctatctggc aggaacgccg cgctccgaag ggctggaaaa gggactgaga 420

caccgcggca tcgaacaccg gacggtcgag tgctaccgca tggagccgat cgcccattcg 480

cgcgccgcga tcgaagatct gcggcgaagc agccgttccg acgccgtgct tttatactcg 540

cgagagaccg cgcgacagtt cgttcgcctg ctttccgaag ccggtgtcga tgctgcttcc 600

tttgcgccgc gctacctctg cctcagcccc gtggtggccg aggcactgcc gggtaacgtc 660

gtggcggaga ccgccgcaag caccgatgaa gacagccttt tcagtcttct ctaa 714

<210>4

<211> 237

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 4

MRVLVTRPLP AAEATVRRLE AAGHRPILLP LMQATHLAAV SVAALEVPHA AIALTSAEAI 60

RVLVSSDADL SQHLATPCFC VGAATAQAAA GLGFSDLRIA EGTGQSLAEL IGATIDTLPP 120

LPLLYLAGTP RSEGLEKGLR HRGIEHRTVE CYRMEPIAHS RAAIEDLRRS SRPDAVLLYS 180

RETARQFVRL LSEAGVDAAS FAPRYLCLSP VVAEALPGNV VAETAASTDE DSLFSLL 237

<210>5

<211>237

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400>5

MRVLVTRPLP AAEATVRRLE AAGHRPILLP LMQATHLAAV SVAALEVPHA AIVLTSAEAI 60

RVLVSSDADL SQHLATPCFC VGAATAQAAA GLGFSDLRIA EGTGQSLAEL IGATIDTLPP 120

LPLLYLAGTP RSEGLEKGLR HRGIEHRTVE CYRMEPIAHS RAAIEDLRRS SRPDAVLLYS 180

RETARQFVRL LSEAGVDAAS FAPRYLCLSP VVAEALPGNV VAETAASTDE DSLFSLL 237

<210>6

<211>237

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 6

MRVLVTRPLP AAEATVRRLE AAGHRPILLP LMQATHLAAV SVAALEVPHA AIVLTSAEAI 60

RVLVSSDADL SQHLATPCFC VGAATAQAAA GLGFSDLRIA EGTGQSLAEL IGATIDTLPP 120

LPLLYLAGTP RSEGLEKGLR HRGIEHRTVE CYRMEPIAHS RAAIEDLRRS SRSDAVLLYS 180

RETARQFVRL LSEAGVDAAS FAPRYLCLSP VVAEALPGNV VAETAASTDE DSLFSLL 237

<210>7

<211> 1000

<212>DNA

<213>Ensifer adhaerens Casida A

<400> 7

caaacagacc gggatatgcg ggtattcttc cgccgcgccg aggatgaggt ggcgcaggaa 60

cgcgtcaccg gcataggagc gggcgccacg gcttgcctga aggatgaccg ggctgtcggt 120

cgcatcggcg gcgcgcatga cggcctgaat gtattccaga ttgttcacat tgaacgccgg 180

cagcgcgtaa tcgttctccg ccgcatggtc gagcagttgc cgcaatgtga tcaatgccat 240

tcgctatctc cctttggata ctcggtgcaa cctatgcggc gcaccacaaa aacaatccgg 300

ccgttgaacc gcacgaaatg catcgatggc aaagtcgatg gccggctttt tcgtgcggcg 360

tgacggcgcg cgcgaattgg tcgcgcccac cgaagtcagg cgcacaatag ttcatcgaag 420

tggtttgaca accgggcaaa aggcaggttg ccagaggtcg aaactcgctt caatcgattt 480

tactgtggac tggatgcaac accttcagtg tgaagtgttt tcactttctg gtggtgcctg 540

agaggagggg gagtcgaggg cagtggatgc aaccattggg cgctgatttt gtctgttaca 600

ccatcgtggt ggatgccctg tcggaaacag tctgtcgaca ggaggtgaac gtcccgcaag 660

aagattgcgg caacgcccct ctttctttgc gcagattacg taaactgccg ctaaaattca 720

caaactttgc atcgcggatg attcgaggct caatccggcc gacaaaaagc gcggacctaa 780

aacgttgcag tagatttcgc aaaaatgccc tgttcacgtc atatgcccgt cgcaaaggcg 840

acgaaaagaa tcgcaaacaa aatacaacct atgggatagg ccgattcccc tcctatagat 900

aaagatgcag acagccgcag aatccgcctt gcgttcgcga acgatttgcg cttctctcct 960

gcgatcacaa acccaaaaca aggggaagga gagaaacaaa 1000

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 8

ctagtctaga caaacagacc gggatatgcg gg 32

<210>9

<211> 42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cgggtgacga gcacgcgcat tttgtttctc tccttcccct tg 42

<210>10

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 10

aaggggaagg agagaaacaa aatgcgcgtg ctcgtcaccc ggcc 44

<210>11

<211> 31

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 11

ccggaattct tagagaagac tgaaaaggct g 31

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 12

agtgccgcat gcggcgatcg tgctcaccag cgccgaagcc a 41

<210>13

<211> 41

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 13

tggcttcggc gctggtgagc acgatcgccg catgcggcac t 41

<210>14

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 14

atctgcggcg gagcagccgt tccgacgccg tgcttttata c 41

<210>15

<211> 41

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 15

gtataaaagc acggcgtcgg aacggctgct ccgccgcaga t 41