对抗肾上腺皮质激素不良反应的中药及其复方制剂

本发明涉及临床医学中对抗长期应用肾上腺皮质激素所致的不良反应的中药及其复方制剂。

肾上腺糖皮质激素是临床上应用十分广泛的药物，但长期超生量量应用可引起柯兴氏综合征(满月脸、水牛背、向心性肥胖、皮肤变薄、痤疮、多毛、浮肿、低血钾、高血压、糖尿等)、骨质疏松、肌肉萎缩、伤口愈合迟缓、抑制生长发育、消化道出血等不良反应或毒副作用，撤药或减量过快亦会引起病情反跳、肾上腺危象及恶心、呕吐、肌痛等撤药症群。近年来，祖国医学专家们一直在积极致力于对抗肾上腺皮质激素的不良反应及毒副反应的研究，曾发现补肾中药有较好的作用，其中附子、生熟地、山药、补骨脂、仙灵脾、菟丝子、知母、五味子、肉苁蓉等中药复方制剂已有一定的研究和报道，但要解决这一临床治疗学的难题，目前尚未有十分理想的方案。

本发明的任务是从中药中提取出一些具有活性成份的天然物质，使其单独或相互配合可以使长期应用肾上腺皮质激素所产生的不良反应得以减轻甚至消除，同时，亦有增强激素抗炎等药理作用的功能。

解决这一任务的途径是使这类制剂含有中药黄芪、白术、淫羊藿及其提取物。

本发明证明了豆料植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fi-sch)Bge.Var.mongholicus(Beg) Hsiao、或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Be8的干燥根经用水或醇提取后获得的提取液，对长期应用肾上腺皮质激素所致的肾上腺萎缩、骨质疏松、免疫抑制、高血压、糖尿病、消化系统不良反应及生长抑制等毒副反应有非常显著的对抗作用，同时，该制剂还在抗炎和血液系统方面与肾上腺皮质激素有明显的协同作用，两者合用，可增强激素的抗炎作用及减轻或消除其不良反应。

本研究还发现了小檗科植物淫羊藿Epimedium brcvicornumMa-rim也有上述的对抗长期应用肾上腺皮质激素所致的肾上腺萎缩和骨质疏松等不良反应，淫羊藿煎剂效果较佳。而淫羊藿总黄酮、淫羊藿甙、淫羊藿次甙被证明是其中的主要有效成份。淫羊藿煎剂及其有效成份对肾上腺上质激素的其他不良反应如免疫抑制等也有显著的对抗作用，但对激素抑制生长发育等不良反应则效果不佳，如与黄芪或白术合用，则可对抗肾上腺皮质激素的生长抑制的作用。

本研究还发明了菊科植物白术Artactylodes macroephalaKoidz也有上述的对抗长期应用肾上腺皮质激素所致的肾上腺萎缩和骨质疏松等不良反应的作用。白术水提液及白术内脂及白术挥发油的主要成份苍术醇、苍术酮、芹子烯等被证明是其中的有效成份，白术单独应用时疗效较好，但与黄芪和淫羊藿合用后其作用更佳。

本研究证明了由黄芪、白术、淫羊藿三种中药组成的复方制剂，对长期应用肾上腺皮素所致的不良反应有极佳的预防作用，特别是当这三种中药以1∶1∶1的比例组成时，可使激素所致的肾上腺萎缩、骨质疏松、免疫抑制、生长发育抑制、高血糖、高血压等不良反应不再出现，且与激素合用尚有增强其抗炎作用等良好的协同作用。在上述配方中，三药中减少白术，也有一定的疗效，但不及三药合用效果更佳。

本研究还证实了，在上述三种中药组成的复方制剂中，再增加延胡索，对肾上腺皮质激素所致的骨质疏松症状效果更佳。

本研究还证实了由淫羊藿、延胡索和蛇床子三种中药按1∶1∶1的比例组成的中药复方制剂，对长期应用肾上腺皮质激素所致的骨质疏松症也有更佳的疗效。

本发明的另一目的是提供能对抗长期应用肾上腺皮质激素所致的肾上腺萎缩和骨质疏松等不良反应的中药制剂及其制备方法。

本发明的中药制剂的制作工艺如下：

一，取下述处方量的中药洗净切碎，用蒸馏水浸泡2小时，反复煎煮三次，每次加水10~20倍，蒸煮1~2h，收集药液浓缩，干燥成粉，再经药剂学工艺制成口服液，胶囊或冲剂。

处方如下：

1号方：黄芪(单味)。

2号方：淫羊藿(单味)。

3号方：白术(单味)

4号方：黄芪(1份)、淫羊藿(1份)。

5号方：黄芪(1份)、白术(1份)、淫羊藿(1份)。

6号方：淫羊藿(1份)、蛇床子(1份)、延胡索(1份)。

二，中药有成分的提取：

1、黄芪多糖的提取：

将黄芪切成饮片，水煎煮二次，每次1.5小时，提取水液减压浓缩，浓缩液加95％乙醇使最后醇浓度达60％，滤取析出物，加水溶解，离心除去不溶物，滤液又减压浓缩至小体积，加95％乙醇使醇浓度达80％，低温静置过夜，倾出上清液，沉淀部份加高浓度乙醇搅伴，过滤，乙醇洗涤，真空干燥，得粗黄芪多糖(得率约2.5％)，备用。

2、黄芪聚糖的提取：

将按1、法提取的黄芪多糖得新溶于水，过滤，滤液通过EDAE-Sephadex25A阴离子交换柱，水洗，收集，电泳检查(缓冲液：0.1M硼砂液，300伏特)一个斑点的APS流份，合并浓缩，用透析膜逆向流水透析24小时，取出过滤除去少量析出物，滤液减压浓缩，用95％乙醇沉淀，过滤，用无水乙醇洗涤，于五氧化二磷真空干燥器中干燥，得白色粉末，化学上主要是葡萄糖的聚合体，为黄芪聚糖。

3、黄芪甙、黄芪甲甙、黄芪总皂甙、黄芪总黄酮的提取均参照文献工艺进行。

4、淫羊藿总黄酮的提取和淫羊藿甙、淫羊藿总皂甙的提取均参照文献工艺进行。

经药理学研究证实上述六个处方、黄芪和淫羊藿的上述提取成分均有预防长期应用肾上腺皮质激素所致的不良反应的作用。

本发明的最佳实施例如下：

实施例一

黄芪水提液对大鼠的类固醇性骨质疏松的防治作用研究

1材料和方法

动物：3月龄雄性SD大鼠(广东省实验动物中心)，平均体重为269g。

药物：黄芪水提液由广东医学院医药科技开发中心从膜荚黄芪Astragalus membranaceus中按工艺一提得，制备成相当1g/ml生药材。氢化可的松注射液(江苏扬州制药厂)。

荧光标记物：四环素(上海新亚制药厂)。Calein(美国)。

实验方法：24只大鼠随机分3组，每组8只。一组：正常对照组(用生理盐水灌胃)。二组：氢化可的松组(氢化可的松注射液3.6mg/kg，每周灌胃6次，30天后改为每周给药2次)。三组：氢化可的松加黄芪组(黄芪水提液5g/kg，每周灌胃6次，氢化可的松用量及次数同二组)。3组动物在同一环境下饲养60天(饲料均由本院实验动物中心配制)，每周称动物体重一次，在处死动物的前10d和2d分别给大鼠皮下注射盐酸四环素25mg/kg和Calein溶液5mg/kg，它们在骨表面形成荧光双标记，反映两次注射期间内骨形成的动态情况。

2个月后，处死大白鼠取其胫骨。用合金骨锯(美国产)把胫骨横断为三段，然后胫骨近端1/3再矢状锯开，置70％乙醇中固定一周，villanneva染色，乙醇和丙酮脱水，甲基丙烯酸甲脂包埋不脱钙骨，包埋块在骨锯下锯成厚度为300μm的骨片，再经人工磨至20~25μm，脱水，透明，封片。

使用美国尤他大学赠送，由Nikon萤光显微镜、Mactablet测量板，Macintoshse电子计算机组成的数字图象分析仪(日本产)，及体视学电脑程序(KSS Computer Engneers，Magna，UT U.S.A)，对胫骨近端骨片(从距骺线1mm处至远端3mm范围内)进行骨计量学测量及计算。实验的数值采用poms软件，经IBM微机作统计学处理，各组的参数以X±SD表示，差异的显著性用t检验，P＜0.05。百分率(％)用X₂÷X₁×100-100公式计算。

2.结果

2.1大鼠体重。大鼠在处死时，对照组为350.71±49.70g，氢化可的松组为285.00土18.89g，黄芪治疗组为306.42±26.10g。与对照组比较，氢化可的松组大鼠体重减轻较明显(P＜0.05)，而黄芪治疗组大鼠体重下降无显著性差异(P＜0.05)。

2.2各组大鼠胫骨近端骨小梁计量学的具体参数见表。

    表1：黄芪水提液对氢化可的松组大鼠胫骨近端骨小梁的作用

        骨小梁    骨小梁    骨小梁    荧光    骨吸收    矿化沉    骨  形组别        面  积    周  长    间  隙    周长    周  长    积  率    成  率

        (％)      (mm)      (μ)      (％)     (％)     (μ/d)    (μ/d)对照组 X    14.29     68.70     363.76    6.43     0.74      1.91     12.21

   SD   3.12      16.40     76.81     1.34     0.13      0.17     2.67氢化可 X    11.07     48.23     524.71    3.28     2.67      1.37     4.49的松组 SD   1.99      11.99     135.74    0.95     0.30      0.12     1.54

   ％-1 -23*      -30*      +44*      -49**    +261**    -28**    -63**氢化可 X    14.09     66.72     373.37    5.29     0.83      1.75     8.98的松+  SD   3.02      18.98     71.40     1.47     0.12      0.20     2.19黄芪组 ％-1 -1        -3        +3        -18      +12       -8       -26*

   ％   +27*      +38*      -29*      +61*     -69**     +28**    +100**

注：％-1：与对照组比较我的百分率；％：与氢化可的松组比较的百分率

    *P＜0.05；**P＜0.01

3.讨论

实验结果表明：氢化可的松使大鼠体重减轻，同时造成大鼠胫骨近端骨小梁骨形成减少(荧光周长-49％，矿化觉积速率-28％，骨形成率-63％)，骨吸收增加(吸收陷窝周长+261％)，骨质丢失(骨小梁面积-23％，骨小梁间隙+44％)。与文献结果相符。这是由于糖皮质激素可抑制蛋白质合成，尤其抑制胶原合成以及抑制成骨细胞前身向成骨细胞的转变，使骨形成减少。此外，还通过减少性激素的分泌，直接刺激破骨细胞，抑制肠道对钙的吸收，增加肾对钙、磷的排泄，继发甲状旁腺功能亢进等因素，进一步增加骨的吸收，减少骨形成，最终导致骨质丢失。而黄芪水提液治疗组与氢化可的松组比较，前者的骨吸收减少-69％，骨形成增加(矿化沉积率+28％，骨形成率+100％)，骨量增加(骨小梁面积+27％，间隙-29％)。与正常对照组比较，除了骨形成率尚低于正常水平外(可能与实验的时间不够长有关)，其他指标均无显著性差异。提示黄芪有防治氢化可的松所引起的骨质疏松症的作用。

黄芪为补气中药，现代研究证明：黄芪对氢化可的松抑制的网状内皮系统吞噬功能有明显提高。增强机体细胞的生理代谢，对在试管内培养中的鸡胚股骨生长有明显的促进作用。本文通过骨组织形态计量学的方法，所观测的骨代谢中的静、动态指标能比较全面的反映黄芪对使用氢化可的松大鼠骨骼的影响，实验证明黄芪有抑制破骨细胞的功能，使骨吸收率降低，同时也有促进骨形成的补骨功效，以抵抗氢化可的松对骨骼的不良影响，有效地防治类固醇性的骨质疏松症。

实施例二

淫羊藿对抗肾上腺皮质激素不良反应的实验研究

淫羊藿是常用的补虚壮阳中药，始载于《神农本草经》。我们研究曾证明淫羊藿提取液对去睾丸大鼠所致的骨质疏松症有显著的防治作用(李青南等，中草药1993；24(12)：639)。本研究进一步探讨淫羊藿提取液对肾上腺皮质激素所致的骨质疏松症及其他不良反应的防治作用，现简报于下：

1.材料与方法

1.1材料

药物：淫羊藿提取液，由本院从箭叶淫羊藿(EpinediumSagitta-tum Maxim)中提取(水煎煮两次，过滤浓缩至100％备用)。醋酸泼尼松：广东医学院附属医院提供，5mg/片，批号930907，使用前用生理盐水配成4.5mg/ml的混悬液。

动物：三月龄雄性大白鼠Sprague Dawley(SD)，广东省实验动物中心提供。

饲料：由本院动物实验中心提供。

1.2方法

取上述SD大鼠24只，随机分为对照组(I组)、激素组(II组)和淫羊藿防治组(III组)，每组8只，I组ig生理盐水0.2ml/(100g.d)；II组ig醋酸泼尼松(0.45mg/100g)，每周二次(周三和周六)；III组除以II组同法ig泼尼松外，还ig100％淫羊藿水提液0.2ml/(100g.d)，所有动物均在同等条件下饲养90d，自由摄水和摄食，处死动物前第10d和第2d，分别sc四环素(25mg/kg)和Calciein(5mg/kg)，因其能鳌合钙并主要沉积在新形成骨基质钙的起点，这样在骨表面形成双层荧光，表明了分两次注射标记物期间骨形成情况。饲养90d(3个月)后，用2％戊巴比妥钠(4~5mg/100g)麻醉并用注射器穿右心室抽血取材，测定血常规、肝肾功能、血液生化指标及微量元素，并取软组织(重要器官)称重及病检，取股骨头按文献作骨组织形态计量学测定。

实验观察指标包括：

(1).对动物体重的影响；

(2).对重要器官的影响及病理检查；

(3).对胫骨上段骨组织计量学的影响；

(4).对血液学指标的影响；

(5).对血糖的影响；

(6).对血钙、血磷、血钾、血氯以及硷性磷酸酶的影响。

2实验结果

2.1、动物实验前后体重增长状况：动物实验前后体重增长状况见表2。   表2     淫羊藿对抗激素性大鼠实验前后体重变化表组别      实验前     实验后    增长率(％)    P值对照组    341±41    394±47    15.5激素组    337±31    371±53    10.1        ＞0.05防治组    335±26    334±21    -2.0        ＜0.01

从表2结果可见，应用GC后，对大鼠体重及生长发育没有显著影响，与对照组比较没有差异，而与淫羊藿提取液合用后，动物体重明显下降，实验前后体重增长率为-2.0％，与对照组比较差异非常显著(P＜0.001)，但与应用激素组比较，差异没有显著性意义。

2.2、对重要器官及免疫器官重量的影响及病理检查：

给药三月后分别取三组大鼠的心脏、肝脏、肾脏、肺脏、肾上腺、胸腺、睾丸分别称重，作病理切片及镜检，胃和肠粘膜用解剖微镜观察并作病理切片及镜检，结果三组动物的肾上腺重量有显著差异，对照组平均重量为65±4.0mg，而激素组为57.0±1.6mg，与对照组比较差异非常显著，而用淫羊藿防治组的肾上腺平均重量为74±16.8mg，与正常组相近而与激素组相比，差异非常显著(P＜0.01)，病检观察，用激素组大鼠束状带变薄，脂质减少，而用淫羊藿防治组则束状带与正常组相似，较厚且脂质丰富。其他器官的重量及病检均无发现异常的改变。

2.3、对胫骨上段骨组织的影响：

用骨组织计量学方法测量各组动物胫骨上段骨量变化见表3。

         表3  淫羊藿对大鼠胫骨上段骨组织形态学参数测量比较(X±SD)组别        骨小梁面积    骨小梁密度   骨小梁间隙      标记周长    骨吸收周长   骨形成率    比值

           (％)         (*/mm)       (μm)         L.Pm(mm)    E.Pm(％)     BFR(％)    L.Pm/E.Pm对照组        17.3±6.0    2.7±0.9     342±150       2.8±1.2    0.1±0.07    6.5±2.2   80.7±66.5激素组        10.8±3.2    1.7±0.5     583±265       1.3±0.4    0.39±0.16   4.6±3.2   12.8±4.4变化率1(％)   -38*         -37*         70*            -56*        265***       -29        -84**淫羊藿        17.2±4.5    3.0±0.6     290±93        2.7±0.72   0.12±0.08   6.2±2.6   49.9±21.7变化率1(％)   0            11           -15            -4          9            -4         -38变化率2(％)   60**         75***        50**           117***      70***        35         292***注：1、变化率1(％)是指对照组与激素组之比较；变化率2(％)是指激

   素组与防治组之比较。

2、*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。

从表3结果可见，用肾上腺皮质激素组鼠骨小梁面积减少38％(P＜0.05)；骨小梁密度减少37％(P＜0.05)；骨小梁间隙增加70％(P＜0.05)，出现了显著的骨量减少，即骨质疏松症，而应用淫羊藿防治组，骨小梁面积增加60％(P＜0.01)；骨小梁密度增加75％(P＜0.01)；骨小梁间隙则减少50％(P＜0.001)。各组参数与正常对照组相近。动态观察用激素组四环素标记周长减少56％(P＜0.05)；骨吸收周长增加265(P＜0.001)；标记周长与骨吸收周长比值下降84％(P＜0.01)，而应用淫羊藿防治组，与应用激素组相比，四环素标记周长增加117％(P＜0.01)；骨形成率增加35％；骨吸收周长下降70％(P＜0.01)，而标记周长与骨吸收周长之比增加292％(P＜0.001)。

2.4、对动物血液学指标的影响：

对动物血液学指标的影响见表4。

             表4淫羊藿对动物血液学指标的影响组别    白细胞计数        白细胞分类           嗜酸性白    红细胞计数   血小板计数

     (×10⁹/L)   中性(％)    淋巴(％)     细胞(％)    (×10¹²/L)  (×10⁹/L)对照组   6.4±3.8    30.3±9.8    67.4±10.5   2.4±1.6    420±34      243±116激素组   8.4±4.1    28.0±7.3    67.7±5.3    4.3±4.6    410±47      340±121淫羊藿   6.1±1.8    29.4±8.8    66.1±9.4    4.5±2.8    388±38      329±97注：**P＜0.01

从表4结果可见，应用GC后，血液中白细胞计数和血小板计数有增高的趋向，但与对照组比较没有显著性差别，淫羊藿防治组与激素组相比，白细胞计数下降27％，中性粒细胞和淋巴细胞无明显变化，红细胞计数和血小板计数也无显著改变。

2.5、对糖代谢的影响：

实验测得三组动物血糖分别为5.34±0.71；6.63±3.41和4.79±1.65(mmol/L)，经统计学检测三组动物血糖差异没有显著性。

2.6、对血钙、血磷、血钾、血氯及硷性磷酸酶的影响：

对血钙、血磷、血钾、血氯及硷性磷酸酶的影响见表5。

表5  淫羊藿对大鼠血钙、磷、钾、氯及硷性磷酸酶的影响组别     Ca(mmol/L)    P(mmol/L)     K(mmol/L)     Cl(mmol/L)   AKP(μ)对照组   2.49±0.09    2.67±0.91    6.10±0.80    99.1±2.85   129±54激素组   2.42±0.06    2.52±0.26    6.66±0.77    100±0.71    128±46防治组   2.39±0.06    2.62±0.48    6.50±1.08    103±2.70    124±25

从表5可见，以上三组实验数据经t检验，均无显著性差异，说明了激素组和淫羊藿防治组对实验动物的血钙、血钾、血磷、血氯及硷性磷酸酶均无显著的影响。

3讨论

实验大鼠按4.5mg/kg给予醋酸泼尼松，每周两次，连用三个月，大鼠出现了非常显著的骨质疏松症和肾上腺皮质萎缩。此外，动物的生长发育(体重)也受到一定的影响，但与对照组比较差异并不十分显著，实验动物的血糖、血钾、血钙、血氯及硷性磷酸酶等均在正常范围，胃粘膜及其他重要器官均未发现明显的病理性损害。文献认为GC引起骨质疏松的原因主要是其抑制了肠钙的吸收和其本身负氮平衡的作用，使蛋白质分解加速，骨基质合成减少所致，长期应用GC导致的肾上腺皮质萎缩，主要与GC反馈性抑制垂体前叶ACTH的分泌有关。本实验结果也证实了长期用GC可致骨质疏松及肾上腺皮质萎缩。

淫羊藿水提液有良好的防治GC所致的骨质疏松症的发生，与GC合用，可完全对抗GC对骨吸收的作用，也有显著促进骨形成的作用。骨小梁面积、密度均和对照组相似，提示了本品有显著防治GC所致的骨质疏松的作用。应用本品后，GC所致的肾上腺萎缩现象也受到抑制，肾上腺重量、皮质厚度及脂质含量均与对照组数值相当，表明本品有防止GC所致的肾上腺萎缩现象。但本品对激素抑制生长发育的现象没有对抗作用，激素合用本品后，动物体重低于正常对照组，差异非常显著，机制有待进一涉探讨。其他指标观察未显示本品对激素所致不良反应有协同或减弱作用。

淫羊藿提取液能防治长期应用肾上腺皮质激素所致的肾上腺萎缩及骨质疏松症的产生，可能与其本身具有的促进蛋白质合成和增强下丘脑-垂体-性腺轴及肾上腺皮质轴，胸腺轴等内分泌系统的功能有关。文献也报道了淫羊藿对蛋白质合成与核酸代谢有显著的促进作用。因此，淫羊藿可能通过促进骨组织蛋白质的合成及促进成骨细胞的生长等作用，从而对抗肾上腺皮质激素的蛋白质分解加速，骨基质合成减少作用，导致骨质疏松等不良反应。文献还报道淫羊藿具有显著的免疫增强作用，这些作用可对抗长期应用GC所致的免疫抑制的不良反应。淫羊藿具有的抗炎和抗病原微生物的作用，可能会增强GC的抗炎作用，从而使GC的抗炎作用增加而不良反应下降。

在对淫羊藿抗GC不良反应的研究中，我们发现本品有一个重要缺点是对GC所致的生长发育抑制没有对抗作用，我们曾用小白鼠进行同样研究也得出相同结果，即本品合用GC后可使动物明显消瘦，体重下降，其机制不明。我们采用黄芪、白术等组成复方后，淫羊藿的这种抑制生长发育的不良反应可得到很好的改善，而其对抗皮质激素的不良反应作用并不减弱(见实施例三)，对该复方我们正在作深入研究。

实施例三

芪藿肾宝对抗泼尼松不良反应的实验研究

肾上腺皮质激素(GC)在临床上对很多难治性疾病是不可缺少的药物，但长期应用有严重的不良反应，包括全身及精神症状，且在停药后容易发生反跳现象等，因此，用防治GC的不良反应是人们所殷切期望的，我们在研究用中药防治骨质疏松，特别是在类固醇性(肾阳虚)骨质疏松症的基础上，初步观察了由中药黄芪、白术、淫羊藿组成的中药复方制剂芪藿肾宝(QHSB)对GC的不良反应的影响。现报告如下：

1、材料与方法

1.1药物：芪藿肾宝：由本院制剂室按工艺一从箭叶淫羊藿(Epinedium Sagittatum Maxim)、黄芪(AstragalusMimbranaceus)和白术(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)中提取(药材由湛江市药材公司提供)的浸膏，浓度为2.6g生药/1g。醋酸泼尼松：广东医学院附属医院提供，5mg/片，批号930907，使用前用生理盐水配成4.5mg/ml的混悬液。

动物：三月龄雄性大白鼠Sprague Dawley(SD)，广东省实验动物中心提供。

饲料：由本院动物实验中心提供。

1.2实验方法

取上述SD大鼠24只，随机分为对照组(I组)、泼尼松组(II组)和防治组(III组)，每组8只，I组用生理盐水0.2ml/(100g.d)灌胃；II组用醋酸泼尼松灌胃(0.45mg/100g)，每周二次(周三和周六)，III组除以II组同法喂泼尼松外，还同时灌胃给予芪藿肾宝0.2ml/(100g.d)，所有动物均在同等条件下自由摄水和摄食，饲养90天处死，处死动物前第10天和第2天，分别皮下注射四环素(25mg/kg)和Calciein(5mg/kg)两次，因其能鳌合钙并主要沉积在新形成骨基质钙的起点，这样在骨表面形成双层荧光，表明了分两次注射标记物期间骨形成情况。饲养90天(3个月)后，用2％戊巴比妥钠(4~5mg/100g)麻醉并用注射器穿右心室抽血取材，测定血常规、肝肾功能、血液生化指标及微量元素，并取软组织(重要器官)称重及病检，取股骨头作骨组织形态计量学测定。

实验观察指标包括：

(1).对动物体重的影响；

(2).对重要器官的影响及病理检查；

(3).对胫骨上段骨组织计量学的影响；

(4).对血液学指标的影响；

(5).对血糖的影响；

(6).对血钙、血磷、血钾、血氯以及硷性磷酸酶的影响。

2、实验结果

2.1对动物体重的影响

动物实验前后体重增长状况见表6。

表6  芪藿肾宝对抗激素性大鼠实验前后体重变化表组别      实验前     实验后     增长率(％)  P值对照组    341±41    394±47    15.5激素组    337±31    371±53    10.2        ＞0.05防治组    332±24    409±24    23.2        ＞0.05

从表6结果可见，应用GC后，对大鼠体重及生长发育没有显著影响，与对照组比较没有差异，而与芪藿肾宝合用，动物体重有增加趋向，实验后体重增加了23.3％，但经统计学检验，差异没有显著性意义。

2.2对重要器官的影响及病理检查

给药三月后分别取三组大鼠的心、肝、肾、肺、肠、胃、肾上腺、胸腺、睾丸分别称重，并作病理切片及镜检，胃和肠粘膜用解剖显微镜观察，结果三组动物的肾上腺重量有显著差异，分别为对照组平均重量为65±4.0mg，激素组为57.0±1.6mg，与对照组比较差异非常显著(p＜0.01)，用芪藿肾宝组的肾上腺平均重量为66±5.0mg，与正常组相近而与激素组相比，差异非常显著(P＜0.01)，病检观察，用激素组大鼠束状带变薄，脂质减少，而用芪藿肾宝组则束状带与正常组相似，较厚且脂质丰富。其他器官的重量及病检均无发现异常的改变。

2.3对胫骨上段骨组织的影响：

用骨组织计量学方法测量各组动物胫骨上段骨量变化见表7。

   表7  芪藿肾宝对大鼠胫骨上段骨组织形态学参数测量比较(X±SD)组别        骨小梁面积    骨小梁密度    骨小梁间隙    标记周长     骨吸收周长   L/E比值

          (％)         (#/mm)        (μm)        LPm(mm)      E.Pm(％)     L.Pm/E.Pm对照组      17.3±6.0      2.7±0.9     342±150      2.8±1.2     0.1±0.1     80.7±66.5激素组      10.8±3.2      1.7±0.5     583±265      1.3±0.4     0.4±0.2     12.8±4.4变化率1(％) -38*           -37*         70*           -56*         300***       -84**防治组      19.9±2.8      3.1±0.5     267±47       3.3±0.7     0.1±0.03    61.0±23.7变化率1(％) 15             15           -22           18           -15          -24变化率2(％) 84**           82**         -54*          154**        -75**        377***注：1、变化率1(％)是指对照组与激素组或防治组之比较；变化率2

(％)是指激素组与防治组之比较。

2、*：P＜0.05；**：P＜0.01：***：P＜0.001。

从表7结果可见，用肾上腺皮质激素组骨小梁面积减少38％(P＜0.05)；骨小梁密度减少37％(P＜0.05)；骨小梁间隙增加70％(P＜0.05)，出现了显著的骨量减少，即骨质疏松症，而应用芪藿肾宝防治组，骨小梁面积增加84％(P＜0.01)；骨小梁密度增加82％(P＜0.01)；骨小梁间隙则减少54％。各组参数与对照组相近并有略超过正常对照组之趋向；动态观察用激素组四环素标记周长减少56％(P＜0.05)；骨吸收周长增加300(P＜0.001)；标记周长与骨吸收周长比值下降84％(P＜0.01)，而应用芪藿肾宝防治组，与应用激素组相比，四环素标记周长增加154％(P＜0.01)；骨形成率增加30％；骨吸收周长下降75％(P＜0.01)，而标记周长与骨吸收周长之比增加377％(P＜0.001)。

2.4对动物血液学指标的影响

对动物血液学指标的影响见表8。

              表8  实验药物对动物血液学指标的影响组别    白细胞计数         白细胞分类            嗜酸性白     红细胞计数  血小板计数

    (×10⁹/L)   中性(％)       淋巴(％)      细胞(％)    (×10¹²/L) (×10⁹/L)对照组  6.4±3.8     30.3±9.8     67.4±10.5     2.4±1.6     420±34    243±116激素组  8.4±4.1     28.0±7.3     67.7±5.3      4.3±4.6     410±47    340±121防治组  5.6±2.8     20.1±7.9     75.7±8.8      4.1±2.2     380±61    471±94**

注：**P＜0.01

从表8结果可见，应用GC后，血液中白细胞计数和血小板计数有增高的趋向，但与对照组比较没有显著性差别，防治组与激素组相比，白细胞计数下降33％，中性粒细胞下降29％，淋巴细胞增加12％，红细胞计数下降7％，但差异无显著性意义，血小板计数上升39％，差异非常显著。

2.5对糖代谢的影响

实验测得三组动物血糖分别为5.34±0.71；6.63±3.41和7.06±2.39(mmol/L)，经统计学检测三组动物血糖差异没有显著性。

2.6对血钙、血磷、血钾、血氯及硷性磷酸酶的影响

对血钙、血磷、血钾、血氯及硷性磷酸酶的影响见表9。

表9实验药物对大鼠血钙、磷、钾、氯及硷性磷酸酶的影响组别    Ca(mmol/L)     P(mmol/L)      K(mmol/L)      Cl(mmol/L)    AKP(μ)对照组  2.49±0.09     2.67±0.91     6.10±0.80     99.1±2.85    129±54激素组  2.42±0.06     2.52±0.26     6.66±0.77     100±0.71     128±46防治组  2.40±0.09     2.55±0.21     6.57±0.83     102±2.23     118±61

从表9可见，以上三组实验数据经t检验，均无显著性差异，说明了激素组和防治组对实验动物血钙，血钾、血磷、血氯及硷性磷酸酶均无显著的影响。

3、讨论与结论

实验大鼠按4.5mg/kg给予醋酸泼尼松，每周两次，连用三个月，大鼠出现了非常显著的骨质疏松症和肾上腺皮质萎缩。此外，动物的生长发育(体重)也受到一定的影响，但与对照组比较差异并不十分显著，血糖、血钾、血钙、血氯及硷性磷酸酶等均在正常范围，胃粘膜及其他重要器官亦均未发现明显的病理性损害，这可能由于用药剂量及疗程尚不够有关，但此剂量已引起动物明显的骨质疏松症。现代医学研究认为，GC引起骨质疏松的原因主要是由于其抑制了肠钙的吸收和其本身负氮平衡，使蛋白质分解加速，骨基质合成减少所致，长期应用GC导致的肾上腺皮质萎缩，主要与GC反馈性抑制垂体前叶ACTH的分泌有关。本实验结果也证实了长期用GC可致骨质疏松及肾上腺皮质萎缩。

芪藿肾宝有良好的防治GC所致的不良反应的作用，该复方可防止GC所致的骨质疏松症的发生，与GC合用，可完全对抗GC对骨吸收的作用，也有显著促进骨形成的作用。骨小梁面积、密度均和对照组相似，甚至似有超过对照组的趋向，证明了本品有显著防治GC所致的骨质疏松的作用。应用本品后，可使GC所致的肾上腺萎缩现象也受到抑制，肾上腺重量、皮质厚度及脂质含量均与对照组数值相当，表明本品有防止GC所致的肾上腺萎缩现象。其他指标初步显示本品对激素所致的中性粒细胞增加，淋巴细胞减少等有一定的对抗作用，而对血小板计数则与GC有协同作用，可使血小板形成率明显增加，这对一些血小板减少所致的疾病可能有较好的治疗作用。

芪藿肾宝由黄芪、淫羊藿、白术三种中药按一定比例组成，淫羊藿温补肾阳在本方中为主药，黄芪补气固表、利尿；白术健脾益气、燥湿利水为辅药。现代医学研究表明，此三药均有促进蛋白质合成及促进免疫功能的作用，我们曾证明了淫羊藿有显著抗骨质疏松的作用。三药合用可加强蛋白质的合成作用，增强其抗骨质疏松效应，并能对抗肾上腺皮质激素的免疫抑制作用。黄芪、白术均有显著的降血糖作用，可对抗GC的升高血糖，诱发或加重糖尿病的不良反应。黄芪、白术均有护肝作用及防治胃、十二指肠溃疡的作用对GC所致的消化道症状及胃、十二指肠溃疡等不良反应可能也有良好的防治作用。黄芪、白术有一定的中枢镇静作用，这些作用可能对GC的中枢兴奋作用有一定的减轻反应。淫羊藿具有的抗菌作用；黄芪具有的抗应激作用、激素样作用及抗菌抗病毒作用；白术具有的抗菌作用以及此三药的免疫增强作用，可明显增强GC的抗炎作用。因此，本方有可能是一组能增强GC的抗炎疗效，并降低其不良反应的复方制剂。

研究表明，本方的另一重要特点是防止了长期应用GC导致的肾上腺皮质萎缩的不良反应，这一发现为中西医结合治疗各种必须应用激素的难治性疾病提供了重要的治疗手段。

寻找能增强肾上腺皮质激素的抗炎作用并降低其不良反应的中药是我国中西医学工作者长期的愿望，芪藿肾宝是我们的一个有益的尝试。该方以促进蛋白质的生物合成，防治GC所致的骨质疏松症为思路，试图系统地对抗GC所致的各系统的不良反应，从而迈开了研究的第一步，对本方的其他作用我们将作进一步研究。

实施例四

本研究组按实施例一的方法对菊科植物白术Artactylodesmacroephala Koidz进行了研究，证明了白术也有上述的对抗长期应用肾上腺皮质激素所致的肾上腺萎缩和骨质疏松等不良反应的作用。白术水提液及白术内脂及白术挥发油的主要成份苍术醇、苍术酮、芹子烯是其中的有效成份，白术单独应用时疗效较好，但与黄芪和淫羊藿合用后其作用更佳。

实施例五

本研究组按实施例三的方法对由黄芪、淫羊藿二种中药组成的复方制剂进行了研究，证明对长期应用肾上腺皮质激素所致的不良反应也有预防作用

实施例六

本研究组按实施例三的方法对由淫羊藿、延胡索和蛇床子三种中药按1∶1∶1的比例组成的中药复方制剂进行了研究，证明对长期应用肾上腺皮质激素所致的骨质疏松症也有很好的疗效。

实施例七

本研究组按实施例三的方法黄芪多糖、黄芪聚糖、黄芪甙、黄芪甲甙、黄芪总皂甙、黄芪总黄酮进行了研究，证明这些提取物均有防治长期应用肾上腺皮质激素所致的不良反应的作用。

实施例八

本研究组对淫羊藿总黄酮、淫羊藿甙、淫羊藿次甙进行了研究，证明这些提取物是其中防治长期应用肾上腺皮质激素所致的不良反应的的主要有效成份。

综上所述，根据本研究的结果，防治长期应用肾上腺皮质激素所致的不良反应，可通过上述几种中药或其复方制剂加以解决。这些中药制剂可制成任何一种药剂学上所说的剂型，如口服液、冲剂、胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂及外用制剂等。