公开/公告号CN1167442A
专利类型发明专利
公开/公告日1997-12-10
原文格式PDF
申请/专利权人 里加研究所;
申请/专利号CN95196540.9
发明设计人 J·M·R·巴勒加里尼;
申请日1995-11-29
分类号A61K45/06;
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人唐伟杰
地址 比利时勒芬
入库时间 2023-12-17 12:56:30
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-12-23
专利权有效期届满 IPC(主分类):A61K45/06 授权公告日:20030409 申请日:19951129
专利权的终止
2003-04-09
授权
授权
1997-12-24
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
1997-12-10
公开
公开
发明领域
本发明涉及预防和治疗HIV-1感染的组合物。更具体讲，本发明涉及预防和/或治疗HIV-1感染的组合物，该组合物包含作为活性组分的HIV-1逆转录酶抑制剂，其为杂环碳(氧杂/硫杂)N-酰苯胺〔carb(ox/thio)anilide〕化合物，第二种逆转录酶(RT)抑制剂化合物，如2′，5′-二-O-(叔丁基二甲硅烷基)-3′-螺-5-(4-氨基-1，2-氧硫杂环戊烯(oxathiole)-2，2-二氧化物)(TSAO)衍生物，其不抑制杂环碳(氨杂/硫杂)N-酰苯胺化合物所抑制的相同HIV-突变菌株，和可有可无的第三种HIV逆转录酶抑制剂。本发明也涉及预防或治疗病人HIV-1感染的方法，它包括给予所述病人有效量的HIV-1RT抑制剂化合物，第二种逆转录酶(RT)抑制剂化合物，它不抑制杂环碳氮杂/硫杂)N-酰苯胺化合物所抑制的同种HIV-1突变菌株，和可有可无的第三种HIV逆转录酶抑制剂。
发明背景
已描述各种化合物作为1型人免疫缺陷病毒体外抑制剂并且这些化合物靶向病毒编码的逆转录酶(RT)，例如，nevirapine，吡啶酮，TIBO，BHAP，TSAO，和喹喔啉这些化合物对HIV-1的选择性是由于它们与HIV-1RT之间的高特异性作用。
在细胞培养和AIDS病人中，对几种HIV-1特异性RT抑制剂具有耐受性的HIV-1菌株的迅速出现，引起人们对进一步在临床开发这些抑制剂的关注。然而，对一种HIV-1特异性TR抑制剂具有耐受性的HIV-1未必对其它HIV-1特异性RT抑制剂具有交叉耐受性。事实上，已证明，HIV-1特异性RT抑制剂对在其RT上含不同的氨基酸取代的HIV-1突变菌株具有不同的活性。例如，在其RT上含100Leu->Ile突变菌株的HIV-1菌株对TIBO R82913和R82150具有耐受性，但对nevirapine和TSAO衍生物TSAO-T和TSAO-mT不具有耐受性。在其RT中含138Glu->Lys突变菌株的HIV-1菌株对TSAO衍生物具有耐受性，但对其它HIV-1特异性RT抑制剂不具有耐受性，如BHAP和nevirapine。相反，在HIV-1菌株RT的181Tyr->Cys突变体使突变病毒对到目前为止所描述的所有HIV-1特异性RT抑制剂都具有耐受性，除了在美国专利5,268,239最终所描述的一些氧硫杂环己二烯碳氧N-酰苯胺(carboxanilide)衍生物外。例如，见Balzarini等人，J.Virology 67(9)：5353-5359(1993)(Balzarini I)和Balzarini等人，Virology 192：246-253(1993)(Balzarini II)。
曾经进行过不成功的尝试，即将各种HIV-1RT抑制剂混合起来以便消除病毒的耐受性。例如，见Balzarini I。
因此，本发明的目的是提供含可抑制抗药HIV-1菌株出现的HIV RT抑制剂化合物的混合物的组合物。
本发明的目的也包括，通过给予本发明-些HIV RT抑制剂化合物的混合物，提供预防或治疗HIV-1感染的方法。
发明简述
本发明涉及预防或治疗HIV-1感染的组合物，它包含治疗有效量的：a)、第一种下式HIV-1RT抑制剂化合物，其中X1和X2独立地为O或S；
Q为-CR3＝NOR4或COYR5；
Y为O或S；
R1为氢，卤素，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C3-C4链烯氧基，C3-C4链炔氧基，一、二或三卤代甲基，三氟甲氧基，C1-C4烷硫基，C3-C4支链烷硫基，硝基或氰基；
R2为氢，C1-C4烷基或卤素；
R3为氢，C1-C4烷基；
R4为C3-C6烷基，C3-C6链烯基，C3-C6链炔基，C1-C8卤代烷基，C1-C8烷氧基烷基，C1-C8烷硫基烷基，C1-C8羟基烷基，C1-C8酰氧基烷基，C1-C8芳酰氧基烷基，C1-C8羧基烷基，C1-C8烷基羧基烷基，C6-C12芳基羧基烷基，C1-C8氨基烷基，C1-C8烷基氨基烷基，C1-C8二烷基氨基烷基，C1-C8三烷基甲硅烷基烷，其中，上述各烷基部分可以是直链或支链的；C3-C8环烷基，苯基，(C1-C6烷基)苯基，C7-C12芳基烷基，C7-C12烷芳基烷基，或杂环基，其中，杂环部分为吗啉基，哌啶基，吡咯烷基，哌嗪基，环氧乙烷基，氧杂环丁烷基，呋喃基，四氢吡喃基或四氢呋喃基；并且
R5为
i)、由一个或多个C1-C4烷基，优选一个或两个甲基取代或未取代的苯基或C3-C7环烷基；或其中R6为氢或直链，支链或环状C1-C6烷基，C1-C6羟基烷基，C2-C6链烯基，C2-C6羟基链烯基，C2-C6链炔基，C2-C6羟基链炔基，C1-C6一、二或三卤代烷基或C1-C6硫代烷基；并且R7和R8独立地为氢或直链，支链或环状C1-C6烷基，C1-C6羟基烷基，C2-C6链烯基，C2-C6羟基链烯基，C2-C6链炔基，C2-C6羟基链炔基，C1-C6一、二或三卤代烷基或C1-C6硫代烷基；
b)、第二种HIV-1RT抑制剂化合物，它不抑制第一种HIV-1RT抑制剂化合物a)所抑制的同种HIV-1突变菌株；及可有可无的
c)、第三种HIV RT抑制剂化合物。
本发明也涉及预防或治疗HIV-1感染病人的方法，它包括分别或联合给予病人上述第一种HIV-1 RT抑制剂化合物a)，第二种HIV-1RT抑制剂化合物，它不抑制第一种HIV-1RT抑制剂化合物a)所抑制的同种HIV-l突变菌株，及可有可无的第三种HIV RT抑制剂化合物。详细说明本发明
术语“HIV-1RT抑制剂化合物”是指通过干扰HIV-1逆转录酶功能来抑制HIV-1复制的任何化合物。
术语“HIV RT抑制剂化合物”是指通过干扰HIV逆转录酶功能来抑制各种HIV，例如HIV-1或HIV-2，复制的任何化合物。
就本发明目的而言，“选择性HIV-1突变菌株”是指对特定HIV-1RT抑制剂化合物具有耐受性的突变HIV-1菌株。
为了测定HIV-1突变菌株，可利用Balzarini I和Balzarini II中所描述的方法选择特定HIV-1RT抑制剂化合物。
在本发明组合物中所使用的用作第二种HIV-1RT抑制剂化合物的化合物可以是任何RT抑制剂化合物，它对第一种HIV-1RT抑制剂化合物(式I)所选择的同种HIV-1突变菌株无选择性。该HIV-1RT抑制剂化合物是已知的并且包括，例如Camarasa等人，J.Med.Chem.35(15)：2721-2727(1992)和Perez-Perez等人，J.Med.Chem.35(16)：2988-2995(1992)在1992年9月3日提交的美国申请号07/939,410中所描述的TSAO衍生物；Merluzzi等人在Science 250：1411-1413(1990)中所描述的联吡啶并二氮杂酮(dipyridodiazepinones)，如nevirapine；Goldman等人在Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 88：6863-6867(1991)中所描述的吡啶酮衍生物，如3-{[(4，7-二氯-l，3-苯并唑-2基)甲基]氨基}-5-乙基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮(L-697，661)；Kleim等人在Antimicrob.Agents Chemother.37，1659-1664(1993)中所描述的喹喔啉，如喹喔啉S-2720；Romero等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8806-8810(1991)中所描述的二(杂芳基)哌嗪(BHAP)衍生物，如N-异丙基-2-〔4-(2-酮基吲哚基)-1-哌嗪基〕-3-吡啶胺(BHAPU-88204)；Pauwels等人在Nature 343：470-474(1990)中所描述的四氢咪唑并〔4，5，1-jk][(1，4)-苯并二氮杂-2-(1H)-酮和-硫酮(TIBO)衍生物，如(+)-S-4，5，6，7-四氢-9-氯-5-甲基-6-(3-甲基-2-丁烯基-咪唑并〔4，5，1-jk〕〔1，4〕-苯并二氮杂-2(1H)-硫酮(R82913)；Kashman等人在J.Med.Chem.35，27 35-2743(1992)中所描述的香豆素衍生物，如calanolide A，McMahon等人在Antimicrob.AgentsChemother.37，754-760(1993)中所描述的二芳基砜。如硝基苯基苯基砜(NPPS)；Pauwels等人在Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90：1711-1715(1993)中所描述的N-酰苯胺并(anilido)苯基乙酰胺(α-APA)，如R89439；Zhang等人在Abstr.2nd Int.Workshop on HIVDrμg Resistance(June 3-5，Noordwisk，The Netherlands)(1993)no.30中所描述的苯乙基噻唑硫脲衍生物(PETT)，如LY300046.HCl；Ba ba等人在Biochem.Biophys.Res.Comm.165，1375-1381(1989)中所描述的1-〔(2-羟基乙氧基)甲基〕-6-(苯硫基)胸腺嘧啶(HEPT)。
可有可无的第三种HIV RT抑制剂化合物c)可以为不同于第一种HIV-1RT抑制剂或第二种HIV-1抑制剂的任何HIV RT抑制剂化合物。该HIV-1RT抑制剂化合物是已知的并且包括这样的化合物，如上述用作第二种HIV-1RT抑制剂化合物或HIV逆转录酶抑制剂的HIV-1RT抑制剂化合物(该抑制剂不区分HIV-1和HIV-2)，例如齐多夫定(AZT)，二脱氧肌肝(ddI)，扎西他宾(ddC)，(-)-2′-脱氧-3′-硫代胞苷(3TC)，D4T，PMEA等等。优选地，可有可无的第三种HIV RT抑制剂化合物c)为不抑制第一种HIV-1RT抑制剂化合物或第二种HIV-1RT抑制剂化合物所抑制的同种HIV-1突变菌株，如不抑制第一种HIV-1RT抑制剂化合物或第二种HIV-1RT抑制剂化合物所抑制的同种HIV-1突变菌株的第三种HIV-1RT抑制剂化合物。
优选地，本发明涉及预防或治疗HIV-1感染的组合物，它包含治疗有效量的：
a)、式(I)的第一种HIV-1RT抑制剂化合物其中
X1为O或S，优选O；
X2为O或S，优选S；
Q为-CR3＝NOR4或者优选COYR5；
Y为O或S，优选O；
R1为氢，卤素，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C3-C4链烯氧基，C3-C4链炔氧基，一、二或三卤代甲基，三氟甲氧基，C1-C4烷硫基，C3-C4支链烷硫基，硝基或氰基，优选氢，卤素或C1-C4烷基，并且更优选卤素；
R2为氢，C1-C4烷基或卤素，优选氢或C1-C4烷基，并且更优选氢，甲基或乙基；
R3为氢，C1-C4烷基；
R4为C3-C6烷基，C3-C6链烯基，C3-C6链炔基，C1-C8卤代烷基，C1-C8烷氧基烷基，C1-C8烷硫基烷基，C1-C8羟基烷基，C1-C8酰氧基烷基，C1-C8芳酰氧基烷基，C1-C8羧基烷基，C1-C8烷基羧基烷基，C6-C12芳基羧基烷基，C1-C8氨基烷基，C1-C8烷基氨基烷基，C1-C8二烷基氨基烷基，C1-C8三烷基甲硅烷基烷，其中，上述各烷基部分可以是直链或支链的；C3-C8环烷基，苯基，(C3-C6烷基)苯基，C7-C12芳基烷基，C7-C12烷芳基烷基，或杂环烷基，其中，杂环部分为吗啉基，哌啶基，吡咯烷基，哌嗪基，环氧乙烷基，氧杂环丁基，呋喃基，四氢吡喃基或四氢呋喃基，优选C3-C6烷基，C3-C6链烯基，C3-C6链炔基，C1-C8卤代烷基，(C1-C8烷基)硫代(C1-C8烷基)，C3-C8环烷基或苯基；并且
R5为
i)、由一个或多个C1-C4烷基，优选一个或两个甲基取代或未取代的苯基或C3-C7环烷基；或其中R6为氢或直链，支链或环状C1-C6烷基，C1-C6羟基烷基，C2-C6链烯基，C2-C6羟基链烯基，C2-C6链炔基，C2-C6羟基链炔基，C1-C6一、二或三卤代烷基或C1-C6硫代烷基，优选C3-C6烷基，C1-C6一、二或三卤代烷基或C1-C6硫代烷基；并且
R7和R8独立地为氢或直链，支链或环状C1-C6烷基，C1-C6羟基烷基，C2-C6链烯基，C2-C6羟基链烯基，C2-C6链炔基，C2-C6羟基链炔基，C1-C6一、二或三卤代烷基或C1-C6硫代烷基，优选氢或C1-C4烷基，并且更优选氢；
b)、下式第二种HIV-1RT抑制剂化合物其中
B为
i)、下式嘧啶优选下式嘧啶其中
X2为氢，C1-C4烷基，C2-C4链烯基，C2-C4链炔基，卤素，氰基，硫代氰基，羟甲基，C1-C2卤代烷基，硝基或氨基，优选氢或C1-C4烷基；
X3为氢，C1-C4烷基，C2-C4链烯基或C2-C4链炔基，优选氢或C1-C4烷基；
X4为OH，SH，NH2，NHCH3，N(CH3)2或NHCOCH3，优选，NH2，NHCH3或N(CH3)2；
ii)、下式嘌呤或优选下式嘌呤其中
X5为H或优选C1-C4烷基；并且
X6为H，OH，卤素，NH2，NHCH3或N(CH3)2；或
iii)、下式三唑其中X7和X8各独立地为氢，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，三甲基甲硅烷基，乙酰基，C1-C6烷氧基羰基，C1-C6烷基羰基，CONH2，CONHCH3，CON(CH3)2，或优选NH2，NHCH3，或N(CH3)2；
R1′为氨基，C1-C4氨基烷基，C2-C4氨基链烯基或C2-C4氨基链炔基，优选氨基或C1-C4氨基烷基；并且
R2′和R3′各独立地为由相同或不同的苯基或C1-C4直链或支链烷基三取代的甲硅基；和
c)、可有可无的第三种HIV RT抑制剂化合物，它不抑制第一种HIV-1RT抑制剂化合物a)或第二种HIV-1RT抑制剂化合物b)所抑制的同种HIV-1突变菌株。
更优选地，本发明涉及预防或治疗HIV-1感染的组合物，它包含治疗有效量的：
a)、下式第一种HIV-1RT抑制剂化合物其中Q为-CR3＝NOR4或COYR5；
Y为O；
R1为氢，卤素或C1-C4烷基；
R2为氢或C1-C4烷基；
R3为氢或C1-C4烷基；
R4为C3-C6烷基，C3-C6链烯基，C3-C6链炔基，C1-C8卤代烷基或(C1-C8烷基)硫代(C1-C8烷基)，其中上述各烷基部分可以是直链或支链的；C3-C8环烷基或苯基；并且
R5为
i)、由一个或两个甲基取代或未取代的苯基或C3-C7环烷基；或
其中R6为氢或直链，支链或环状C1-C6烷基，C1-C6羟基烷基，C2-C6链烯基，C2-C6羟基链烯基，C2-C6链炔基，C2-C6羟基链炔基，C1-C6一、二或三卤代烷基或C1-C6硫代烷基；并且
R7和R8独立地为氢或直链，支链或环状C1-C4烷基；
b)、下式第二种HIV-1RT抑制剂化合物其中
B为
i)、下式嘧啶其中
X2为氢或C1-C4烷基；
X3为氢或C1-C4烷基；
X4为NH2，NHCH3或N(CH3)2；
ii)、下式嘌呤
其中X5为H或优选C1-C4烷基；并且
iii)、下式三唑
其中X7和X8各独立地为氢，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，三甲基甲硅烷基，乙酰基，C1-C6烷氧基羰基，C1-C6烷基羰基，CONH2，CONHCH3，CON(CH3)2，或优选NH2，NHCH3，或N(CH3)2；
R1′为氨基，C1-C4氨基烷基；并且
R2′和R3′各独立地为由相同或不同的苯基或C1-C4直链或支链烷基三取代的甲硅烷基；和
c)、可有可无的第三种HIV RT抑制剂化合物，它不抑制第一种HIV-1RT抑制剂化合物a)或第二种HIV-1RT抑制剂化合物b)所抑制的同种HIV-1突变菌株。
最优选地，本发明涉及预防或治疗HIV-1感染的组合物，它包含治疗有效量的：
a)、下式第一种HIV-1RT抑制剂化合物其中
R2为氢，甲基或乙基；并且
R5为
i)、苯基或C3-C7环烷基；或
其中R6为氢或直链，支链或环状C3-C6烷基，C1-C6一、二或三卤代烷基或C1-C6硫代烷基；并且
R7和R8独立地为氢；
b)、下式第二种HIV-1RT抑制剂化合物其中
B为
i)、下式嘧啶其中
X2为氢或C1-C4烷基；
X3为氢或C1-C4烷基；
ii)、下式嘌呤
其中X5为C1-C4烷基；或者
iii)、下式三唑其中X7和X8各独立地为NH2，NHCH3，或N(CH3)2；
R1′为氨基，C1-C4氨基烷基；并且
R2′和R3′各独立地为由相同或不同的苯基或C1-C4直链或支链烷基三取代的甲硅烷基；和
c)、可有可无的第三种HIV RT抑制剂化合物，它不抑制第一种HIV-1RT抑制剂化合物a)或第二种HIV-1RT抑制剂化合物b)所抑制的同种HIV-1突变菌株。
如美国专利5,268,389所述，可制备本发明组合物中用作第一种HIV-1RT抑制剂化合物的式I化合物。如公开的欧洲专利申请0 530 407所述，可制备本发明组合物中用作第二种HIV-1RT抑制剂化合物TSAO化合物。
可通过下列方式，如口服，非肠道，舌下，吸入喷雾剂，直肠或者局部，以含常规无毒可药用载体，佐剂和溶媒的剂量单位制剂形式给予本发明组合物。在标准的药学课本，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th Edition，Mack Publishing Company，Easton，PA(1980)中可以找到适宜的载体，佐剂和溶媒。
可与载体混合来生产单一剂型的治疗有效量活性组分将根据治疗宿主的年龄和疾病以及特定给药方式变化。通常，以获得抗病毒有效结果而不引起任何毒副作用的浓度水平来给予本发明组合物中的活性组分。
在本发明组合物中的第一种HIV-1RT抑制剂化合物与第二种HIV-1RT抑制剂化合物的比率可根据所选择的第一种HIV-1RT抑制剂化合物与第二种HIV-1RT抑制剂化合物和HIV感染的症状和/或严重性变化，但通常大约为重量比1∶100-100∶1，优选大约为重量比1∶5-5∶1。在包含可有可无的第三种HIV RT抑制剂化合物的本发明组合物中，第三种HIV RT抑制剂化合物的含量将根据HIV-1感染的症状和/或严重性和所选择的第三种HIV RT抑制剂化合物变化，但通常大约为组合物总重量的1％-99％，优选大约为组合物总重量的20％-80％。 当将第一种HIV RT抑制剂化合物，第二种HIV RT抑制剂化合物，和第三种HIV RT抑制剂化合物(如果选择)，以含所有组分的组合物形式给予病人或者可将组分分别给予病人。例如，可首先将第一种HIV-1RT抑制剂化合物给予病人，然后将第二种HIV-1RT抑制剂化合物给予病人，然后将第三种HIV-1RT抑制剂化合物(如果选择)给予病人。或者，例如，可首先将第二种HIV-1RT抑制剂化合物给予病人，然后将将第一种HIV-1RT抑制剂化合物给予病人，然后将第三种HIV-1RT抑制剂化合物(如果选择)给予病人。或者，例如，可首先将第三种HIV-1RT抑制剂化合物(如果选择)给予病人，然后给予第一种HIV-1RT抑制剂化合物和第二种HIV-1RT抑制剂化合物。或者，可将第一种HIV-1RT抑制剂化合物和第二种HIV-1RT抑制剂化合物的组合物给予病人，然后给予第三种HIV-1RT抑制剂化合物。或者，可首先将第二种HIV-1RT抑制剂化合物和第三种HIV-1RT抑制剂化合物给予病人，然后给予第一种HIV-1RT抑制剂化合物，等等。
可将本发明组合物中的活性组分作为唯一的活性药物来给予时，也可以将活性组分与一种或多种其它药物联合使用，其中所述其它药物是对本发明组合物中活性组分无毒的或者它与活性组分的联合对所治疗的宿主无毒。
下列实施例用于说明本发明。
实施例材料和方法试验化合物
如上Perez-perez等人所述合成TSAO衍生物〔1-[2′，5′-二-0-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-D-呋喃核糖基]-3-N-甲基胸腺嘧啶-3′-螺-5″-(4″-氨基-1″，2″-氧硫杂环戊烯2″，2″-二氧化物(TSAO-m3T)。由Zhang Hao(National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)提供或从Pharmatech International Inc.(WestOrange，NJ)得到 TIBO R82913。分别由Boehringer IngelheimPharmaceuticals，Inc.(Ridgefield，CT)和Merck，Sharp&Dohme(WestPoint，PA)提供Nevirapine(BI-RG-587)和吡啶酮L-697，661。从The Upjohn Company(kalamazoo，MI)得到BHAP U-88204(N-异丙基-2-〔4-(2-酮基吲哚基)-1-哌嗪基〕-3-吡啶胺)并且从Hoechst AG(Frankfurt，Germany)得到BHAP U-90152。由FukushimaMedical College(Fukushima，Japan)提供MCK-442。用美国专利5,268,389中所描述的方法制备在下表A列出的化合物I，II，III，IV，和V。
表A
从American Tissue Cell Cμ lture Collection(Rockville，Md.)得到CEM细胞。HIV-1(IIIB)最初从长时间受HIV-1感染的H9细胞的培养上清液中得到，并且由R.C.Gallo和M.Popovic(NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)提供。选择抗单独或联合给予的HIV-1特异性RT抑制剂的HIV-1(IIIB)突变菌株
在含几种固定浓度试验化合物的25cm2培养瓶(Falcon；BectonDickinson)中，将HIV-1(IIIB)在5ml CEM细胞培养基(4×105个细胞/ml)中培养2-3代来制备突变HIV-1菌株。培养基由含10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，和0.075％NaHCO3的RPMI 1640组成。最初感染倍数大约为CCID50(50％细胞培养基感染剂量)的1000倍。每3-4天，通过将0.5-1.0ml被感染的培养基上清液加到每ml含4×105个未被感染的CEM细胞的5ml悬浮液中，培养出新一代。将在细胞培养基中形成合体细胞作为突破的参数。在联合药物试验中，将化合物以单一药物试验中所使用的两个最低浓度相同的起始浓度合并。在CEM细胞培养基中，几种HIV-1突变菌株对试验化合物的敏感性
以250,000个细胞/ml的浓度，将CEM细胞悬浮在培养基中并以100倍50％细胞培养基感染剂量/ml的野生型HIV-1(IIIB)或突变HIV-1菌株来感染CEM细胞。然后，将100μl被感染细胞的悬浮液加到200μl含100μl适当稀释试验化合物的微量滴定板孔中。在37℃下培养4天后，测定细胞培养基中合体细胞的形成。测定50％有效浓度(EC50)，即50％抑制HIV-1引起的合体细胞形成所需要的化合物浓度。制备突变HIV-1感染的CEM细胞培养基，其用于多聚酶链反应分析和突变HIV-1菌株多基因(pol gene)的排序
上述Balzarini I和Balzarini等人在Pro.Natl.Acad.Sci.USA 90：6952-6956(1993)(“Balzarini III”)中描述了所使用的方法。选择低聚核苷酸来获得包含RT氨基酸50-270的727-bp片断。用1×105个细胞的10mM Tris.Hcl(PH8.8)，50mM Kcl，1.5mM MgCl2，0.1％Triton X-100，2.5单位耐热DNA聚合酶(Dyna Zyme，Finnzymes Inc.)和15μM的各个引物(总体积为100μl)的提取物进行前病毒DNA的增殖(35周期)。第一组引物(5′-GTAGAATTCTGTTGACTCAGATTGG和5′-TTCTG CCAGTTCTAGCTCTGCTTCT)得到前病毒逆转录酶基因的900-bp产物。将第一个PCR得到的反应物的十分之一作为模板，并用第二组引物(5′-CCTGAAAA TCCATACAATACTCCAGTATTTG和5′-AGTGCTTTGGTTCCTCTAAGGAGTT TAC)将其转移到新的35-环PCR中，得到包含氨基酸50-270的727-bp逆转录酶片断。第二组低聚核苷酸引导DNA从第一组低聚核苷酸内合成并因此从第一个PCR中扩大特异性产物，同时不进一步扩大非特异性产物。在1％琼脂糖凝胶上可见PCR产物。逆转录酶测定
反应混合物(50μl)包含50mM Tris.HCl，PH7.8，5mM二硫苏糖醇，300mM谷胱甘肽，500μM EDTA，150mM KCl，5mM MgCl2，1.25μg牛血清白蛋白，固定浓度的标记底物[2，8-3H]dGTP(2.95μM，2μCi)，固定浓度的模板/引物聚(C).低聚(dG)(0.1mM)，0.06％Triton X-100，5μl抑制剂溶液〔含各种浓度的(5倍稀释)试验化合物〕，和5μl RT抑制剂。将反应混合物在37℃下培养30分钟，此时，加入100μl小牛胸腺DNA(150μg/ml)，2ml Na4P2O7(0.1M的1MHCl)，和2ml三氯乙酸(10％，v/v)。将溶液在冰上保持30分钟，然后洗涤酸不溶性物质并进行放射性分析。测定试验化合物的IC50，其为50％抑制病毒颗粒产生的RT活性时的化合物浓度。结果化合物I，II，III，IV，和V的抗病毒活性谱
已证明，在CEM细胞中，化合物I，II，III，IV，和V明显抑制HIV-1(IIIB)的复制。其50％抑制浓度范围为0.004-0.05μg/ml。活性最大的化合物I，II，III，IV，和V对野生型HIV-1的抑制活性优于HIV-1特异性RT抑制剂nevirapine，BHAP，吡啶酮，TIB0和TSAO-m3T(表1)。然而，与后面HIV-1特异性RT抑制剂相反，在培养基中，化合物I，II，III，IV，和V对吡啶酮耐受性RT/181-Cys HIV-1突变病毒所引起的细胞病(cytopathicity)的抑制作用更强。结果，化合物I，II，III，IV，和V抗RT/181-Cys HIV-1突变病毒的活性至少比其它HIV-1特异性RT抑制剂大1-2个数量级。
化合物I，II，III，IV，和V对其它突变HIV-1菌株(所述菌株在其RT上含138 Glu→Lys和106 Val→Ala变种)的抗病毒作用至少比其它化合物大10-50倍。化合物I，II，III，IV，和V抗RT/100-Ile和RT/103-Asn突变病毒菌株的活性低于抗野生型HIV-1病毒的化合物。然而，其抗病毒作用仍然在ng/ml范围，他比其它HIV-1特异性RT抑制剂的浓度低，其它抑制剂的ED50值接近或者甚至明显高于1μg/ml(表1)。
表1
不同的突变HIV-1菌株的敏感/耐受谱
评估化合物I，II，III，IV，和V对重组HIV-1RT的抑制作用。利用聚(C)。低聚(dG)作为模板引物和2.95μM[2，8-3H]dGTP作为放射性标记底物，测得上述化合物是有效的HIV-1RT抑制剂。其IC50值恒定地在0.018-0.077μg/ml之间。已注意到，nevirapine，吡啶酮，BHAP和TIBO的IC50值较高，并且TSAO-m3T抑制HIV-1RT的IC50值甚至比化合物I，II，IV，和V高20-50倍(表2)。
表2
抗HIV-1RT(WT)活性
将化合物I，II，III，IV，和V以及BHAP U88204和nevirapine以0.1，0.5，和2.5μg/ml的起始浓度加到HIV-1(IIIB)感染的CEM细胞中。在试验过程中(10次传代培养或35天)，保持药物浓度不变。然后，从细胞培养基中除掉药物，并将细胞进一步传代培养至少5代。仅仅在含最低浓度(即0.1μg/m1)化合物I，II，III，IV，和V的培养基中出现病毒。化合物V在0.5μg/m1下出现病毒突破(表3)。相反，在类似试验条件下，在感染的细胞培养基中，病毒对0.1和0.5μg/m1 BHAP和01.，0.5和2.5μg/ml nevirapine的抑制作用产生耐受性。因此，化合物I，II，III，IV，和V在HIV-1感染的细胞培养基中抑制病毒突破的作用至少分别为BHAP或nevirapine的5-20倍(表3)。在第10代传代培养中，由UR衍生物充分保护，并因此未感染上HIV-1引起的细胞病的HIV-1感染的CEM细胞培养基中没有产生可觉察到的p24水平，并且没有任何前病毒DNA。除掉试验化合物，并进一步在不含试验化合物下传代培养细胞后，不出现病毒。因此，可以得出结论，当在含明显低于其它HIV-1特异性RT抑制剂浓度的化合物I，II，III，IV，和V中培养时，HIV-1感染的细胞培养基中不含病毒。
表3
在CEM细胞培养物中HIV-1(III)诱导的细胞病的突破
从第35天开始，在试验化合物不存在下进行传代培养
在用化合物I，II，III，IV，和V治疗情况下出现的突变HIV-1菌株的特性
通过RT上可能存在的变种来确定在用化合物I，II，III，IV，和V，以及用化合物A和B(如下定义)治疗情况下出现的七种突变HIV-1菌株RT基因的特性。在氨基酸的100，101，103和138部位发现变种。有趣的是，发现了三种新的变种。由于密码子第二个碱基(A→C)的颠换，突变HIV-1/IV菌株含103Lys→Thr变种。化合物B在RT的101氨基酸部位选择新的变种，即由Glu(GAA)取代Lys(AAA)。当以0.1μg/ml的浓度使用时，化合物V选择在病毒RT上含双变种，即101-Lys→Ile和141-Glu→Glu的病毒(表4)。
化合物A的结构为
化合物B的结构为
表4
在化合物A、B、I、II、III、IV、V、BHAP或Nevirapine选择过程中
获得的突变HIV-1菌株逆转录酶的氨基酸突变
在用化合物I，II，III，IV，和V，A和B治疗情况下出现的其它突变病毒在其RT的100，101，103和138部位包含氨基酸改变，其中，所述RT已在先前有关HIV-1特异性RT抑制剂中报道过，它包括TIBOR82150，TIBO R82913，BHAP U88204，吡啶酮L-697，661和TSAO衍生物。在用BHAP和nevirapine治疗情况下出现的病毒在其RT中分别包含181Tyr→Cys和106Val→Ala突变。突变HIV-1菌株对其它HIV-1特异性RT抑制剂的敏感性/耐受性
在其RT中包含新的101Lys→Glu突变的突变HIV-1/B显示一种特有的耐受模式。化合物I以及所有其它HIV-1特异性抑制剂对该病毒菌株的作用至少降低2-3个数量级(EC50：≥1μg/ml)。然而，吡啶酮L-697，661保留了对该突变病毒菌株的显著的抑制效力(EC50：0.035μg/ml)(表5)。在其RT中包含103Lys→Asn突变的三个突变HIV-1菌株对HIV-1特异性抑制剂的敏感谱是显著不同的。例如，TIBO，BHAP，nevaripine，吡啶酮和MKC-442对HIV-1/III(0.1)的抑制作用比HIV-I/V(0.5)大10-30倍。化合物I，II，和IV对HIV-1/V(0.5)的抑制作用比对HIV-1/III(0.1)的抑制作用仅仅弱3-5倍，而TSAO-m3T对两种病毒突变体的抑制作用是相等的。第三个RT/103-Asn突变病毒菌株〔HIV-I/I(0.1)〕显示对HIV-1特异性RT抑制剂的耐受/敏感谱介于其它两种RT/103-Asn突变病毒之间。含双(101Lys→Ile+141Gly→Glu)突变的HIV-1/V(0.1)对些化合物保留了显著的敏感性，包括吡啶酮，TSAO-m3T，MKC-442，和化合物II和III。
表5
HIV-1突变体对HIV-1特异的RT抑制剂的敏感/耐受谱
最后，在其RT的103位上，含新的Thr突变的HIV-1/IV(0.1)突变菌株保留了对大多数ng/ml范围HIV-1特异性抑制剂的敏感性，除了nevirapine，TIBO R82913，化合物III和化合物V，它们仅仅以1.1-2.75μg/ml的EC50抑制该突变病毒。用化合物IV，TSAO-m3T和/或BHAP U90152进行两个和三个药物的联合治疗
将化合物IV，BHAP和TSAO-m3T以0.04，0.10和0.25μg/ml(化合物IV和BHAP)或者1.0，2.5和5.0μg/ml(TSAO-m3T)的浓度加到HIV-1感染的CEM细胞中。另外，通过以其在单一药物试验中所使用的最低(0.04μg/ml)或中间(0.1μg/ml)的浓度混合抑制剂，将化合物IV，BHAP和TSAO-m3T进行各种两个或者三个药物的联合。在我们的试验条件下，在所有评估浓度进行单一药物治疗时都出现了突变病毒。在一些情况下，病毒最快在开始试验后的7-11天出现。最好时，病毒出现可延迟到第14天(较高浓度的BHAP和TSAO)或第21天(最高浓度的化合物IV)(表6)。
然而，以其最低浓度(即0.04μg/m l的化合物IV和1.0μg/ml的TSAO-m3T)结合化合物IV和TSAO-m3T时，在感染后的第18天出现HIV-1诱导的细胞病变的第一个信号，而0.04μg/ml的化合物IV与2.5μg/ml的TSAO的组合物将病毒突破延迟到感染后的第28天，它比以相同浓度或者是2.5倍(TSAO-m3T)或6倍(化合物IV)浓度的两种化合物作为单一药物加到细胞培养基中能延迟长得多的时间(表6)。
用化合物IV(0.1μg/ml)和TSAO-m3T(1.0或2.5μg/ml)的组合物更能延迟病毒突破。在这些试验条件下，病毒被完全抑制，直到第十三次传代培养(感染后的第46天)。在不存在试验化合物情况下，将该培养物再传代培养10次(感染后的第77天)，证明了没有病毒诱导的细胞病变，也证明了培养物是病毒抗原(p24)-阴性的。而且以单一药物2.5-5倍较高浓度使用化合物IV或TSAO-m3T时，细胞培养物中的病毒仅可被抑制14-25天。因此，化合物IV与TSAO-m3T组合产生显著的延迟或甚至完全预防突变病毒出现，如果以相同或甚至2.5-5倍较高浓度单独使用这些化合物时，不能获得这样的结果。三组合的化合物IV，BHAP和TSAO-m3T甚至获得更显著的作用。当以较低浓度加入时，三药物组合物基本上能延迟(到第39天，第46天，第56天)或者甚至预防耐受病毒的出现〔第77天没有病毒出现(第22次传代培养)〕，然而，最高单一药物浓度仅仅预防病毒突破到14-21天(表6)。所有以0.1μg/ml组合化合物IV的三药物组合物能够从病毒中清除HIV-1感染的CEM细胞培养物。事实上，通过PCR证明，这些培养物不含有前病毒，不产生p24并且在第13代以后，在没有试验化合物情况下生长，其生长速度与未感染的细胞培养物没有区别。
表6不同浓度下的HIV-1特异的RT抑制剂的不同组合物中突变HIV-1菌株在CEM细胞培养物中的突破
(化合物IV，TSA0-m3T and BHAP U90152)
表6(续)
机译： 预防和治疗HIV-1的组合物预防和治疗HIV-1的组合物至少包含两种不同的HIV-1感染至少两种不同的HIV-1逆转录酶抑制剂逆转录酶抑制剂
机译： 用于预防和治疗HIV-1感染的组合物，其包含至少两种不同的HIV-1逆转录酶抑制剂
机译： 预防和治疗至少两种不同的HIV-1逆转录酶抑制剂的HIV-1感染组合物
