一个与抗癌基因P53相作用的人类新基因P53BP3

本发明涉及与抗癌基因编码产物P53相作用的人类新基因P53BP3及它在人体各组织中的表达和在染色体上的定位，以探索肿瘤诊断和治疗的新途径。

P53是一种抗癌基因的编码产物，它可以广泛参与细胞周期、基因表达、DNA复制和修复、细胞分化和发育的调控、抑制肿瘤的形成和维持基因组的稳定等各项生理过程(Levine，A.J.，Cell，1997，88：323-331)。其核心环节就是DNA与蛋白质，蛋白质与蛋白质相互作用，其中P53与其它蛋白质因子之间的相互作用更加重要，已成为人们注意的焦点。过去几年来，人们已经克隆了许多编码产物能够与P53相作用的基因(Goga，A.and Liu，X.，Oncogene，1995，11：791-799；Walker，K.K.and Levine，A.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93：15335-15340；Wang，X.W.and Yeh，H.Nature genet，1995，10：188-193；Maheswaran，S.and Englert，A.J.Genes Der.1995，9：2143-2156；Horikoshi，N.and Vsheva，A.，Mol.Cell.Biol.1995，15：227-234.)，一方面研究这些因子的结构特征，寻找它们与P53的作用规律，另一方面致力于研究它们的功能。这两方面的研究为阐明P53参与细胞各项生理过程的调控机制奠定了基础。

正常的P53具有抗癌作用，其中P53介导的细胞凋亡过程是P53控制肿瘤发生的一种有效途径(Symonds，H.，et al.Cell，1994，78：703-711)，但是一些P53的突变体由于丧失了正常功能而导致细胞癌变，另一些P53的突变体本身即具有致癌功能。在50-55％的人类癌症中可以检测到P53基因的突变(Hollsteim，M.，Rice，K.et al.Nucleic Acid Res.1994，22：3551-3555)。研究P53与其他蛋白质因子的相互作用，有助于探讨肿瘤的发病机制，为肿瘤的诊断和治疗提供新的设想和方案。

酵母双杂交系统是近年来发展起来的一种在体内研究蛋白质之间相互作用的体系(Chien，C.T.et al.Proc.Acad.Sci.USA，1991，88：9578-9582)。该系统的原理是基于酵母中的一种转录因子GAL4功能的重建。GAL4分子含有两个相对独立的功能域：DNA结合区和转录激活区。把欲验证存在相互作用的两个蛋白质(X和Y)的基因分别以GAL4的DNA结合区和转录激活区融合，再将这两个融合表达载体转入特殊的酵母细胞中，此酵母菌的染色体上，已整合了可被GAL4 DNA结合区所识别并结合的位点及下游报告基因(HIS3或LacZ)，如果两个蛋白质之间发生相互作用，报告基因就能表达。蛋白质Y也可是一个基因文库，就可以从中筛选以蛋白质X相互作用的新蛋白质基因。

为此，本发明的目的是提供一种能与P53相作用的人类新基因P53BP3全长cDNA序列，并分析它在16种正常人组织和7种肿瘤细胞株的表达水平及在染色体上的定位。

本发明是一种与抗癌基因P53相作用的人类新基因P53BP3，它是根据以上情况，利用P53融合GAL4的DNA结合区，作为蛋白质X，以HeLa细胞cDNA文库融合GAL4的转录激活区为蛋白质Y，筛选到了一个人类新基因P53BP3。经原位杂交方法钓到了全长cDNA片段，测定了全序列，并进行了染色体定位和在16种正常人组织及7种肿瘤细胞株中的Northern杂交分析，为研究P53的作用原理开辟了新的途径。

本发明以P53为靶分子，利用酵母双向杂交系统从HeLa细胞cDNA文库中筛选到多个阳性克隆，测定各阳性克隆的cDNA序列，其中一个长度为1312bp的cDNA序列经基因数据库检索未发现同源序列，该cDNA序列编码437个氨基酸的肽段(图1)。Northern杂交的结果表明，该基因全长mRNA约为5.0kb。以上述1312bp的cDNA片段为探针，从HeLa cDNA文库中又获得4.0kb和1.8kb克隆片段(图2)。测定核苷酸序列后，可将它们拼接为5055bp的全长cDNA(图3)。其中5’非翻译区为2046bp，编码区为2445bp，编码815个氨基酸组成的蛋白质，3’非翻译区为564bp。

该基因的编码产物N端区存在一个亮氨酸拉链结构(63-84)，中部有一个核定位序列(386-402)，另外在分子的近N端和近C端共有4个PEST序列富积区，表明该蛋白在细胞内代谢周转较快，稳定性较弱。它可能是一种DNA结合蛋白(图4)。经蛋白数据库检索，未发现与其他蛋白的同源性，该基因为“孤儿”基因，同家族的其他基因尚未被发现。

进行16种正常人组织mRNA的Northern杂交分析，结果表明该基因在各种组织中广泛表达(图5)。其中在睾丸组织内表达最高，胎盘、心脏和胸腺次之，在脑、肝脏、肾脏、脾脏、骨骼肌、卵巢、小肠、结肠、前列腺、胰脏和外周血白细胞中都有一定表达，而在肺组织中则表达很弱。用7种人肿瘤细胞株总RNA进行Northern杂交分析(图6)，结果表明该基因在畸胎瘤和淋巴瘤细胞株中的表达较在子宫癌、乳腺癌、肝癌和神经胶质细胞瘤的细胞株为高，而在肺癌细胞株中则未检测到表达。

本发明还进行了P53BP3基因的染色体定位分析，以P53BP3为探针，与展层于载玻片上的人淋巴细胞染色体杂交。同时记录同一视野内的FISH信号和DADI信号，二者对比即可确定P53BP3基因定位于第12号染色体的p11.2-12.1区段(图7)。

本发明的优点：

1、提供一种全新的P53BP3基因的cDNA序列，它的编码产物能与抗癌基因的产物P53相作用，在肿瘤的诊断和治疗上有重要意义。

2、P53BP3编码的蛋白产物含有亮氨酸拉链结构和核定位序列，可能为一种转录调控因子，有可能成为基因工程的产品。

3、P53BP3在16种正常人组织中广泛表达，显示该基因在细胞内具重要功能作用，可作为诊断指标。

4、本发明已将P53BP3基因定位在12号染色体的p11.2-12.1区段，宜进行染色体上基因的连锁分析，应用于疾病的诊断。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

附图说明：

图1.与P53相作用的P53BP3部分cDNA核苷酸序列及由此推出的编码氨基酸序列

图2.P53BP3cDNA片段的克隆及限制性内切酶的切点

图中2723-4007代表图1中的核苷酸序列

    1-3943为5’端部分cDNA序列

    3247-5055为3’端部分cDNA序列

图3.P53BP3 cDNA核苷酸全序列及编码的氨基酸序列

图4.P53BP3基因编码产物的氨基酸序列

图中粗写的L表示亮氨酸拉链结构中的亮氨酸的位置

双线部分为核定位序列

单线部分为PEST序列

图5.以P53BP3为探针，人不同组织mRNA的Northern杂交

图中：1.心脏     2.脑         3.胎盘        4.肺脏

      5.肝脏     6.骨骼肌     7.肾脏        8.胰脏

      9.脾脏     10.胸腺      11.前列腺     12.睾丸

      13.卵巢    14.小肠      15.结肠       16.外周血白细胞

图6.以P53BP3为探针，不同肿瘤细胞总RNA的Northern杂交分析

图中：1.肺癌(A549)        2.HeLa          3.肝癌(HepG2)

      4.乳腺癌(MCF-7)     5.神经胶质瘤(U251MG)

      6.淋巴瘤(JurKatt)   7.畸胎瘤(PA-1)

图7.P53BP3基因在染色体上的定位

图中：A中箭头所指为P53BP3在染色体上的荧光定位，B为同一视野下的12号染色体，C为12号染色体的模式图，黑点表示P53BP3在12号染色体上的位置。

实施例1酵母双向杂交系统筛选P53BP3 cDNA片段

将P53与GAL4 DNA结合域融合表达质粒和HeLa细胞cDNA文库与GAL4转录激活结构域融合表达质粒(均购自Clontech公司)共转化酵母HF7c中。把蛋白质粒的营养筛选标记为TRP1基因，文库质粒的营养筛选标记为LEU2，如果靶蛋白与被检测蛋白之间有相互结合，就激活HF7c中报告基因HIS3的表达，因此细胞就能在缺少Leu、Trp和His的基本培养基上生长。在1.5×10⁶个转化子(在L^-和W^-平板上)中获得35个能在SD(W^-L^-H^-)平板上生长的转化子。为了排除假阳性克隆，测定这些克隆的半乳糖苷酶活力，发现仅有6个克隆在X-gal平板上显蓝色。将阳性转化子接种于缺少Leu的培养液中培养，抽取质粒DNA，转化大肠杆菌，再制备质粒DNA。将该质粒与靶蛋白质粒转化酵母SFY526中，在X-gal平板上均显蓝色，表明有半乳糖苷酶活力，证明确为阳性克隆。对6个阳性克隆中的cDNA文库质粒分别进行限制性内切酶图谱分析和部分DNA序列测定，其中一个cDNA片段长度为1.3kb(图1)，在基因文库中未查询到同源序列，它代表人的一个新基因，并命名为P53BP3。

实施例2 P53BP3全长cDNA的克隆和测序

将上述1.3kb cDNA片段分别用EcoRI/XbaI和XbaI/XhoI酶切为850bp和450bp片段，分别按随机引物标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司)推荐的方法进行同位素标记，从HeLa细胞cDNA文库(Clontech公司)中筛选杂交克隆，噬菌斑原位杂交方法按cDNA文库说明书推荐方法进行。经两轮筛选，获得13个阳性克隆。对各个克隆进行限制酶切鉴定，其中两个克隆，长度分别为4.0kb和1.8kb，可以拼接成5.0kb的P53BP3全长cDNA(图2)、按照图2的限制性内切酶的切点，作不同长度的酶切片段，分别克隆到M13mp18和M13mp19(购自BRL公司)中，以双脱氧终止法测定DNA序列。P53BP3 cDNA全长5055bp，5’非翻译区为2046bp，编码区为2445bp，3’非翻译区为564bp(图3)。

实施例3 P53BP3在人正常组织和肿瘤细胞株的表达分析

将固定有人16种正常组织总mRNA的尼龙膜(Clontech公司)，放入杂交管内，加入5ml 68℃预热的快速杂交液(Clontech公司)，68℃预杂交30分钟，加入变性的同位素标记的P53BP3的1.3kb片段，68℃杂交2小时。取出杂交管洗膜，2×SSC，0.05％SDS中室温10分钟，0.1×SSC，0.1％SDS 50℃洗两次，共30分钟。将膜置于滤纸上晾干，压片，即得图5。

肿瘤细胞株总RNA的制备、电泳及转膜，均按《分子克隆·实验指南》介绍的方法进行(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，与探针杂交同前，可得图6。

实施例4 P53BP3在染色体上的定位

从人血液中分离淋巴细胞，培养于含10％胎牛血清和PHA的基本培养基(a-MEM)中，68-72小时后用BrdU处理，使细胞同步化。然后以无血清的培养液洗涤细胞3次，再用含胸腺嘧啶的a-MEM培养液培养6小时。收集细胞并涂布于载玻片上，经低渗处理使细胞破裂，固定后于空气中晾干。用Rnase处理载有细胞裂解物的载玻片，再用70％甲醛/2×SSC于70℃处理，使染色体DNA变性，然后用乙醇脱水。用BRL公司的BioNickLabeling Kit以生物素化的dATP标记P53BP3 cDNA片段，将标记的探针加入到杂交混合液中，75℃变性5分钟。此杂交混合液还包含50％甲醛，10％硫酸葡聚糖和人Cotl DNA。将杂交混合液加到载有变性染色体DNA的载玻片上，37℃保温过夜。杂交过后，洗去载玻片上的混合液，以酶促反应检测杂交信号，同时记同一视野中的FISH信号(图7中的A)和DAP1信号(图7中的B)，二者对比后即可确定P53BP3定位在第12号染色体的p11.2-12.1的区段内，如图7中的C所示。