具有生长激素生物活性增效作用的生物活性分子特别是肽类分子

本发明涉及一种肽类生物活性分子，当其与某些转运肽和/或某些佐剂共价相连时，能够体内诱导生长激素GH生物活性增效作用。

抗体对GH生物活性特别是体细胞发育活性的增效作用是由Holder等(1980)首先观察到的，他们的研究是基于测定Snell型矮鼠中肋软骨中放射活性硫酸盐的掺入和GH诱导的体重增加。

由Holder等(1985)和Aston等(1986和1987)进行的基于相同参数的三个研究表明，所研究的抗体大部分具有GH生物作用的增效作用。Wallis等(1987)的工作证实了抗GH抗体提高牛生长激素体细胞发育活性的现象。他们的研究基于对Wistar品系垂体切除大鼠中IGF-1(胰岛素生长因子)的血浆水平和体重增长的测量。

尤其，欧洲专利申请EP284406(COOPERS ANIMALHEALTHLTD)描述了在35-53位与生长激素的连续氨基酸残基序列具有一级结构同源性的肽或具有交叉反应活性的肽，所述肽可用于增强脊椎动物生长激素效应的抗原组合物中。Aston等描述的试验是体内服用抗体，该抗体或为血清形式(当得自羊时)，或为单克隆抗体形式，这种抗肽或抗天然GH激素的与所述激素相复合的抗体的被动给药提高了该激素的生物活性。但其没有显示生长激素的35-53肽可用于主动免疫领域。

对增效抗体的最新工作似乎表明，如果GH单独固定在肝细胞上，则GH-MAb复合物或本发明激素与单克隆增效抗体形成的复合物将优先固定在窦状隙细胞水平上(枯否细胞)(Tans等(1994))。因此，人们从此因此可能认为IGF-1和IGF BP3肝细胞水平的合成(Massart等(1993))可以通过所述复合物在窦状隙细胞水平的作用得以提高。

专利申请EP137234(THE WELLCOME FOUNDATIONLIMITED)中描述道，生长激素的某些抗体能够增强该激素的活性，而人们已知一般这种抗体至少在体内具有对抗激素作用的倾向。另外这种抗体可以是动物宿主用生长激素特异片段“免疫接种”的就地产物，以产生一类具有有限特异性的多克隆抗体，后者能够增强内源激素的活性。

本发明中表明，与载体分子和/或佐剂结合的生长激素某些序列能够增强所述激素在脊椎动物中的活性。本发明肽片段的发现是起先基于IgG类单克隆抗体(MAb)选择的研究结果，所述抗体对生长激素特别是牛生长激素的反应性似乎是最高的。纯化所述MAb后，选择了四种类型。Massart等(1993)已试验了在未成熟的垂体切除大鼠中这些类型的抗体对通过单次注射bGH诱导的血浆IGF-1应答的效应。人们最终得以鉴定被称为2H4的增效抗体所识别的表位，这种抗体能够特异性地识别位于天然生长激素3号α螺旋中的肽序列。

凡提及GH的一级、二级或三级结构均参照Scanes C.G等(1995)的描述。

本发明的目的是提供一种以有效且比现有技术方法更持久的方式增强生长激素GH作用的方法。特别是，本发明提供了一种肽或半抗原，当其与一种转运肽和/或佐剂共价结合时能够在体内诱导对生长激素生物活性的增效作用。

这种效应可以是一种免疫接种类型的主动免疫的结果，其中给予半抗原特别诱导体内特异抗体的生成。

因此本发明涉及含有生长激素GH从103位到114位序列之全部或部分或与所述序列具有交叉免疫反应性的所述序列的同源序列的肽构建体，该肽片段与一种转运肽和/或一种佐剂共价相连，并能够体内诱导所述生长激素生物活性的增效作用。

该GH序列或“GH肽”的精确鉴定源于对一些抗GH单克隆抗体的分析，这些抗体在以抗体-GH复合物施用时具有增效作用。该肽片段中源自GH的肽序列也可视为半抗原型分子，这种片段可被2H4抗体识别。另外，在具有最佳增效作用的抗体中，可观察到2H4对GH的亲和力较其他抗体的弱。

本发明一种优选的肽构建体中，所述生长激素GH的序列含于下述序列中：

GTSDRVYEKL

还优选所述GH激素序列选自以下序列：

TSDRVYEKL

GTSDRVYEK

SDRVYEKL

TSDRVYEK

GTSDRVYE

这五个肽分别相当于Scanes等(1995)公开的生长激素GH的105-113、104-112、106-113、105-112、104-111区，并可通过肽合成的常规技术获得。

作为半抗原(定义上不是免疫原)，本发明的肽与一种转运剂共价相连。例如，这种转运剂最好是源自卵白蛋白、KLH(钥孔槭血兰素)或白蛋白的肽序列，更特别为下列肽：

卵白蛋白的323-339；

Singaglia等所述的CS.T3肽的378-398或379-398或378-397或378-396或378-395；

呼吸道合胞病毒1A蛋白的45-60；

乙型肝炎病毒包被基因组RNA之蛋白的120-140。

这些序列与“GH肽”的羧基端或氨基端共价连接。

除以上转运分子外，本发明的肽片段还可与N-乙酰-胞壁酰(MAP，与肽相连)型佐剂如MPP或其衍生物共价连接。

根据本发明肽片段的一种优选实施方案，佐剂为胞壁酰二肽(MDP)或其衍生物，如MDP-赖氨酸：Lys(NH2)-D-isoGlu-L-Ala-NMc-Nur。

因而按与EP89290所述基本相似的方法，将MDP与“GH肽”和转运剂组成的肽的羧基端共价连接。

本发明的肽片段在有或无MDP或其衍生物的情况下，另外还可以与已知或推测为T依赖性的序列连接，或者与脂质体相连或包含在其中。本发明的肽这样就可以在水介质或油介质中通过口服、皮下注射、肌内或透粘膜的途径、或通过“小丸”(含所述产品的可生物降解的聚合物)和微泵输送的系统植入来给药。其他佐剂如单独或与卵磷脂结合的PAO(EP445710)、ZN(OH)₂或与Al(OH)₃结合的HBW538(DRUGS.EXP.CLIN.RES.17(9),1991,445-450)，也可以与GH肽转运剂共价或非共价结合。

最后，在同一个转运分子上当然可以固定多个本发明的肽片段，只要不影响增效作用即可。

可按本领域已知的方法，例如Merrifield法，通过化学途径合成“GH肽”或与转运肽相连的“GH肽”。

这种产生主动免疫的途径是一种比给予抗体具有许多优点的技术。实际上，按照免疫接种，主动免疫产生持久的效力，而给予抗体只有暂时的效力；另外制备肽比制备抗体或天然GH耗资要少得多。

本发明也包括含有编码本发“GH肽”(优选与转运肽相连的)的核苷酸序列的重组核酸。这种重组核酸可用于：

-转染原核或真核细胞，并使其在体外产生所述肽；

-或作为GH增效药物的活性成分；然后这些肽按WANG B等(1993)描述的相似机制在体内产生。

本发明还涉及一种含有上述肽片段或重组核酸的免疫原性组合物。

在这种组合物中，可加入佐剂，无论是否如上所述与肽相连。本发明的一种组合物可有利地用作饲料添加剂，用于刺激动物的生长和/或乳汁分泌，特别是牛、羊、猪和其他脊椎动物(鱼、有袋目动物、人…)。该组合物可用于口服，例如作为饲料添加剂；或用于直肠、皮下、肌内或透粘膜给药，“小丸”和微泵系统，特别是脂质体作为载体用于含有GH肽(与转运剂或与佐剂连接或不连接)的组合物中。

为了达到对动物生长和泌乳的促进作用，应配制该组合物使本发明肽的给药剂量为0.01μg到10μg/kg。

本发明的肽和组合物还可用于人，用于制备治疗生长疾病的药物，这些疾病是由人的内源性生长激素缺陷或代谢失调引起的。这些组合物的配制与上述定义的相同。

以下实施例和附图非限制性地表明本发明肽构建体特别有益的效果，特别是与其他生长促进剂相比。详细描述

1)GH肽的序列确定

在起始阶段，需要在抗bGH的不同单克隆抗体中选择与bGH具有一定的亲和力的那些抗体。实际上这些抗体看来是最可能以上调或下调方式干扰激素生物活性的那些抗体。

为了获得这些抗体，使用了如Holmdahl等(1985)和Mirza等(1987)描述的能获得特异性单克隆抗体的快速免疫技术。bGH用作了抗原。

关于以下各项鉴定了所获得的抗体：

-同型，

-RIA中与¹²⁵I标记的bGH的反应性，

-ELISA中的反应性(加合滴定，捕获)，

-Western印迹中的反应性。

然后按Bruck等(1982)描述的技术从腹水纯化这些抗体，一旦纯化结束，所得抗体溶液在SDS变性凝胶上进行微型电脉(PHAST SYSTEM)。这一操作的目的是检查免疫球蛋白的分离。

已按Massart描述的方法，用快速技术测定了纯化的MAb在溶液中与bGH形成高浓度免疫复合物的能力。在存在PEG(聚乙二醇)下沉淀的条件下，通过抗体与¹²⁵I标记的bGH形成复合物的能力测定这一反应性。这样就筛选到具有所希望的反应性并称为2H4的抗体，已研究了其与bGH的亲和性。该抗体的理化特征的结果列于S.Massart的论文里和下表Ⅰ中。

                    表Ⅰ

S：培养物上清液

A：腹水液

(A)：从稀释的腹水液测定的同种型，而非从培养物上清测得，

++：中度沉淀

+++：强度沉淀

++++：大强度沉淀

反应性滴度：腹水液抗bGH的MAb滴定(0.200(1)至2.000(10)范围内观察到的OD值)

ELISA捕获：用吸附在塑料上的抗体捕获生物素化的bGH(用显示所观察到的最大OD值的抗体稀释度表示)。

b)抗体2H4所识别表位的绘图：

以上的工作已允许特别按照Beattie和Holder(1994)的方法进行表位绘图研究，确定Mab 2H4的表位。

已合成了一组8个氨基酸的肽并与单克隆抗体反应。用分光光度法鉴定了与抗体结合的肽。抗体肽复合物的分子量明显高于单独肽的分子量。

还证明了抗体的固定位点为GH结构上的104-113肽。

该104-113区域位于GH的第3号α螺旋上，由于该螺旋的肽与放射性受体的弱反应性(Scanes等编，1995)，这一区域是GH激素中很少研究的区域。但人们已知这一区域的肽具有显著的生长促进活性，另外第3号α螺旋是GH结合蛋白(GHBP)的第二个连接位点区。事实上，为了GH与其肝受体相连，需要与两个GHBP形成一种二聚体，以按Fuh(1992)(科学，256,1677-1678)的模型诱导生长促进作用。没有GH或GHBP的这种二聚化，则不产生任何拮抗作用，从而不能获得任何生长促进作用。由此可以假设增效抗体帮助或改善了GHBP在结合位点的这种结合，这可能解释了这种GH肽的有利效果。

实施例

用19批(每批5只)Wistar去垂体雌性大鼠进行了本发明的体内实验。这些动物在4周龄时被切除垂体然后持续观察一周。在另一个观察周中，进行称重并排除那些在七周末体重增长大于5克的动物。实际上，认为这些动物的脑垂体切除是不完全的。它们因而不适合用于本工作中。

选择的每只动物接受甲状腺激素T4和可地松的替代治疗。每日皮下给予50μg可地松/100g体重，1μg T4/100g体重。在注射这些激素后一般观察到动物体重的轻微增长。这种激素补充治疗进行一周，在此期间每天称重。从此，这些动物适合用于对与具有作为GH肽的104-113序列或EP 284406描述的35-53序列的不同肽构建体温育或不温度的bGH的体细胞发育活性进行比较评价。

在这一进行了50天的评价中，力图通过体重增加和IGF-1水平测定以与针对GH104-113肽的抗体(与针对GH35-53肽的抗体相比)的复合物形式给予的猪GH的激素活性增长。

肽104-113通过与不同肽转运分子连接形成下述肽构建体而具有了免疫原性，然后将这种构建体与不同来源的佐剂结合或不结合注射给个体，所述佐剂特别为MDP的肽衍生物、矿物油、细菌来源的产品或氢氧化物。这种注射是以含有所述肽构建体的组合物形式以0.01μg-10μg组合物/kg大鼠的量进行的。

同时，同样去垂体的对照大鼠接受0.01μg-10μg/kg的猪GH的注射，其中存在正常免疫球蛋白(阴性对照)或存在针对GH35-53肽的抗体(假定的阳性对照)。

在欧洲专利申请EP284406中已描述了两种免疫源(35-53-OVA和35-53-SRIF)对获得能在去垂体Wistar大鼠中提高GH活性的抗体有效。在本发明的这些实验中，GH的35-53肽也按104-113的相同共价连接而成为免疫原。

这样免疫原104-113-OVA、104-113-Lys MDP、104-113-SRIF、104-113-SRIF-Lys MDP与具有相同偶联类型(转运分子或佐剂)但其中104-113肽被35-53肽替代的免疫原进行了比较。

用于与OVA及SRIF偶联的方法可以是在专利申请EP284406中描述的那些。另外，与LysMDP的连接可按Carelli等在欧洲专利EP89290中描述的方法进行。

抗肽或抗GH抗体的检测也按欧洲专利申请EP284406中描述的方法进行。

在D-1、D-15和D-40天进行皮下注射，在D-1、D-7、D-21、D-45天进行采血，最好一次采血在D-50天。

各批的描述：

第1批：PBS(阴性对照)

第2批：ACF(福氏完全佐剂，第2个阴性对照)

第3批：IFA(福氏不完全佐剂，第3个阴性对照)

第4批：PBS+与OVA偶联的104-113

第5批：ACF+与OVA偶联的104-133

第6批：PBS+与OVA偶联的35-53

第7批：ACF+与OVA偶联的35-53

第8批：PBS+与SRIF偶联的104-113

第9批：ACF+与SRIF偶联的104-113

第10批：PBS+与SRIF偶联的35-53

第11批：ACF+与SRIF偶联的35-53

第12批：PBS+与MDPLys偶联的104-113

第13批：PBS+与MDPLys偶联的35-53

第14批：PBS+与SRIF和MDPLys的偶联物偶联的104-

        113

第15批：PBS+与SRIF和MDPLys的偶联物偶联的35-53

第16批：IFA+与MDPLys偶联的104-113

第17批：IFA+与MDPLys偶联的35-53

第18批：IFA+与SRIF和MDPLys的偶联物偶联的104-113

第19批：IFA+与SRIF和MDPLys的偶联物偶联的35-53。

因而在不同的批次之间进行了以下比较：

-按Massart(1988)第27和34页中描述的方法诱导增效抗体，

-诱导抗肽抗体，以及识别天然GH的抗肽抗体水平，

-体重变化

-血浆IFG-1水平。

处理结束后，对各批中每只动物称重，不麻醉断头处死动物以测定IGF-1水平，并在不同批次上比较了不同实验组的体重变化和IGF-1应答。

为了测定IGF-1水平，在玻璃试管中收集躯体血。去凝血块后，离心血样(4℃下2小时)，于-20℃下保存血清。

然后按Renaville等(1993)第444页中描述的方法进行IFG-1提取。该技术的IGF-1回收率为93％；99％以上的连接蛋白被除去。这样提取的IFG-1然后用Rab2抗血清按放射免疫法(Renaville等(1993))进行定量。

首先可注意到两类结果之间存在的相似性，因为在体重增加和IGF-1应答之间显著地存在密切相关性。

实际上，在100μg/只鼠的剂量下，bGH诱导的IGF水平平均为60ng/ml。该值是去垂体对照动物中基础水平的8倍。

这些实验结果表明，含GH肽的肽构建体诱导激素活性的提高。这种提高反映在所得的IGF-1的浓度上，它高于仅注射bGH的动物中的浓度。

这一实验的结果还证明在识别天然激素(GH)的循环抗体水平和被免疫大鼠的体重增长之间存在相关性。特别是，接受与OVA偶联并在ACF存在下注射的肽或与MDPLys直接相连并在PBS中注射的肽的批次与其他批次相比尤为突出。因而OVA作为转运剂好于SRIF，甚至后者本身与MDPLys相连时也如此。

因而当在PBS中而非IFA中给药时，肽直接与MDPLys相连产生了良好的结果。还应注意到，接受35-53肽的批次产生了好于第13和第17批的结果，但比第5和第12批的结果差。

                   参考文献

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