突变的2,5二酮基－D－葡萄糖酸还原酶及其基因工程表达

本发明涉及一种突变的2,5二酮基-D-葡萄糖酸(2,5DKG)还原酶及其基因工程表达系统，适用于改进葡萄糖串联发酵产生2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的工艺，属于生物工程领域。

2-KLG工业上目前多采用“莱氏法”和“二步发酵法”生产，这两种方法均以山梨醇为原料，工业上以葡萄糖高压加氢制得山梨醇。这样制备既不安全又浪费，使整个工艺比较复杂。70年代中后期发明了从葡萄糖发酵生成中间体2,5-DKG，然后再发酵生成2-KLG的“二步串联发酵法”。但是串联发酵法的第二步棒状杆菌发酵利用底物2,5-DKG的浓度受到限制，总转化率不高，发酵液中最终2-KLG浓度只能达到15mg/ml左右。而且仍然要分两个步骤完成。

葡萄糖串联发酵的第二步发酵原理是棒状杆菌中的小分子量单链蛋白2,5-DKG还原酶催化2,5-DKG生成2-KLG的过程。它能在C-5位置立体专一地将2,5-DKG还原为2-KLG。利用重组DNA技术，把棒状杆菌中的2,5-DKG还原酶基因克隆表达到欧文氏菌中，构建一个基因工程菌，将实现葡萄糖一步发酵产生2-KLG。Anderson等人首先采用筛选基因文库的方法从棒状杆菌克隆到了一个2,5-DKG还原酶基因，并且构建了利用葡萄糖直接发酵产生2-KLG的基因工程欧文氏菌。此后另一个2,5-DKG还原酶基因也被Hardy等人用类似的方法从棒状杆菌克隆得到。但是表达量和酶活较低，难以在工业上应用。

本发明的目的是建立一项实用的生物合成2,5DKG还原酶的技术，为构建成功利用葡萄糖直接发酵产生2-KLG的基因工程菌和改进葡萄糖串联发酵工艺奠定基础。

本发明主要通过聚合酶链反应(PCR)方法从棒状杆菌SCB3058(本实验室筛选)克隆获得突变的2,5-DKG还原酶Ⅰ，并高效表达在大肠杆菌和最终表达在欧文氏菌SCB125(本实验室筛选)来实现发明目的。利用PCR技术，以基因组DNA为模板，优化PCR反应条件，经扩增得到含有2,5-DKG还原酶Ⅰ基因的片段，定向连接到克隆载体PGEM3Zf(+)，并转化大肠杆菌DH5α，筛选得到阳性克隆PGEM813。序列分析结果表明，片段全长1107bp，含有一个834bp的开放阅读框架，编码产生由278个氨基酸组成的分子量为34kD的蛋白，证实为2,5-DKG还原酶Ⅰ基因。将且的基因的调控序列进行缺失突变后，克隆到原核表达载体pBL上获得表达质粒pBL4，通过温度诱导，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析有明显的表达条带，约占菌体总体蛋白的20％，并且表达的蛋白具有较高的酶活力。将能够在大肠杆菌内高效表达棒状杆菌2,5-DKG还原酶Ⅰ基因的质粒pBL4改造成为具有链霉素抗性的质粒pBLS，采用改进的感受态转化法将pBLS导入能够利用葡萄糖高产2,5-DKG的欧文氏菌SCB125中，通过提高温度诱导，经SDS-PAGE分析2,5-DKG还原酶获得了高效表达，不形成包涵体。同时体外酶活测定结果表明表达的酶具有很高的活力。因此有很大的应用前景。

下面结合附图对本发明作进一步描述。

图1是2,5 DKG还原酶Ⅰ基因序列及编码蛋白序列图，图中有下划线的区域为突变区。

图2是表达在大肠杆菌DH5α中的SDS-PAGE图谱，M为分子量Marker,lane1为含表达质粒的大肠杆菌，lane2为含表达酸性磷酸酯酶(pho4)质粒的对照大肠杆菌。

图3是重组表达载体PBLS结构示意图，图中EcoRⅠ,XhoⅠ,BamHⅠ,HindⅢ为酶切位点，str为链霉素抗性基因，amp为氨苄青霉素素抗性基因，ori为复制起始区，Pl为启动子，CIts856m为Pl启动子的抑制蛋白基因，2,5DKGRI为2,5-DKG还原酶Ⅰ基因。

图4是表达在欧文氏菌SCB125中的SDS-PAGE图谱。Marker同图2,lane1为含表达质粒的欧文氏菌，lane2为不含表达质粒的对照欧文氏菌。

1．染色体DNA提取方法：是由哺乳动物细胞染色体DNA提取方法改进而来。对提取到的棒状杆菌DNA电泳检测，所抽提到的DNA分子大小为23kb左右。2．引物合成与PCR扩增：根据文献报道的2,5-DKG还原酶基因全序列，用PC/GENE软件中PCR引物设计程序，设计了PCR反应的引物，合成时在5’端加上酶切位点和保护碱基可以方便地进行克隆：5’端引物：5’TCTGAATTCGCGCCTACCCTGGAAGACATGACAG 3’

             EcoRⅠ3’端引物：5’TCTAAGCTTATCCTCGAAGCTCTCCCGTGCCATC 3’

            HindⅢ5’端突变引物：5’CGCCTACCCTGGAATTCATGACAG 3’

                          EcoRⅠ

以棒状杆菌SCB3058全基因组DNA为模板，按所设计的优化反应条件进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检查为单一条带，长约1.1Kb，大小与预期值完全一致；为了鉴定PCR反应的产物是否正确，从产物的酶切结果方面进行了初步判别，BamHⅠ、XhoⅠ等内切酶消化位点与理论值符合。扩增产物用Wizard PCR回收试剂盒纯化。3.PCR扩增产物的克隆与鉴定：PCR扩增产物经纯化后，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切，定向克隆到pGEM3Zf(+)中。通过蓝白斑变化和小规模抽质粒鉴定筛选阳性菌落。增大的重组克隆用EcoRⅠ、HindⅢ和基因内部酶切位点进行酶切初步鉴定。所得质粒PGEM813通过酶切图谱鉴定后，采用Sanger双脱氧末端终止法进行核酸序列分析，直接以重组质粒PGEM813双链DNA为模板，采用M13正向通用引物和中间合成的引物测出两端的序列，中间部分采用SalⅠ-PstⅠ亚克隆后测序(参见图1)，将全序列与发表的2,5-DKG还原酶基因顺序进行比较在基因编码区434位是G而不是A,734位是C而不是T，从而导致了两个氨基酸差异，145位His变成Arg,245位Val变成Ala。4．表达载体构建：将2,5-DKG还原酶Ⅰ基因直接从EcoRⅠ和HindⅢ位点克隆到原核表达载体pBL中，利用棒状杆菌的翻译信号进行翻译，构建成大肠杆菌表达载体pBL1028，经过SDS-PAGE分析未能实现高效表达。推测为pBL上的SD序列与起始密码子ATG之间距离太长(26bp)，大大影响了翻译效率。因而合成了新的5’端突变引物，在ATG前面突变两个碱基，构建出一个新的EcoRⅠ酶切位点，序列分析证实了产生的新片段缺失掉了棒状杆菌2,5-DKG还原酶Ⅰ基因原来的5’端调控序列，全部用表达载体pBL上的Pl启动子、SD序列等调控基因表达，SD序列与ATG起始密码子之间间距变为8bp，接近文献报道的最佳距离。构建出大肠杆菌高效表达载体pBL4。

含有重组表达载体pBL4的大肠杆菌DH5α经过42℃热诱导，产生了对照所没有的明显表达产物，在SDS-PAGE凝胶上可见明显的表达产物条带(参见图2)，测得分子量约为34kD，与理论值完全一致，灰度扫描结果表明，表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的20％。

按酶活力测定方法测定表达在大肠杆菌中的2,5-DKG还原酶Ⅰ活力，结果表明表达的2,5-DKG还原酶Ⅰ具有很高的生物学活性，达到了1660U/mg，比报道的酶活力有较大的提高。4．表达载体的改造：将约2Kb的链霉素抗性基因片段插入到pBL4上的2,5-DKG还原酶Ⅰ基因片段后面，得到质粒pBLS(参见图3)。质粒转化欧文氏菌SCB125用改进的CaCl2法进行。基因工程菌进行2,5-DKG还原酶Ⅰ表达分析主要通过SDS-PAGE分析和2,5-DKG还原酶Ⅰ比活测定，结果转基因欧文氏菌有明显表达条带(见附图4)，比活力3572U/mg，是对照菌的10倍。

以下为本发明实施例：

实施例1：以棒状杆菌基因组DNA为模板，在50ul PCR反应混合液含10×Buffer(Mg²⁺free)5ul,5mol/l dNTP 2ul,20pmol/ul引物各2ul，模板1ul,Taq DNA Polymerase 0.5ul，根据需要加入25mmol/lMgCl₂，甘油等若干，用无菌水调整至50ul。循环参数：95℃变性1min；50℃复性1min；72℃延伸3min；35个循环，扩增产物经电泳检查为单一条带，长约1.1Kb。

实施例2：挑取含pBL4的DH5α菌种接种于AmpLB液体培养基中，30℃培养过夜，次日接种新鲜AmpLB培养基中，30℃培养3-4h(A600约0.4)，升温至42℃诱导继续培养。离心收集菌体，悬浮于无菌水，加等体积上样缓冲液，煮沸，离心后取上清进行SDS-PAGE分析。用考马斯亮蓝染色，灰度扫描测定表达产物含量。在SDS-PAGE凝胶上可见明显的表达产物条带，测得分子量约为34kD，灰度扫描结果表明，表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的20％。

离心收集表达的菌体，用Buf A 0.1M Tris-Cl(pH7.0)洗涤，重悬浮于一定体积的Buf A中，用超声波破碎菌体，离心取上清作为测定用的酶液。在30℃，100ul酶液加到2.7ml Buf A中，再加100ul浓度为3-5mM的NADPH溶液及100ul过量底物2,5-DKG，测定A₃₄₀的变化，根据标准曲线换算成NADPH浓度变化，计算酶活力。酶活力单位(U)定义为：每分钟氧化1umol NADPH所需的酶量。蛋白浓度采用考马斯亮蓝染色法以牛血清白蛋白为标准测定，计算酶的比活力。通过不同的温度诱导，结果虽然42℃诱导能够得到高得多的表达量，但表达的酶蛋白主要存在于沉淀中，上清中酶的比活力仍保持基本相同的水平。

实施例3：转基因欧文氏菌的28℃培养在含50ug/ml链霉素LB的过夜菌以2％接种新鲜含50ug/ml链霉素LB，在28℃培养2-6h后，转移到42℃诱导培养若干小时，转速均200rpm。收获菌体以150D600重悬浮于1mlBufA,-70℃冻融超声波破菌壁。离心取上清电泳及测酶活，表达分析方法同例2。结果转基因欧文氏菌SCB125有明显表达条带，比活力3572U/mg，是对照欧文氏菌(365U/mg)的10倍，从28℃培养2小时后诱导酶的比活力最高。依次是4小时和6小时开始的诱导。从2小时后诱导酶的比活力可维持12小时不降低。

本发明所涉及的生物合成2,5DKG还原酶的技术，克隆到的棒状杆菌2,5DKG还原酶Ⅰ基因与以往报道的有差别，在构建的表达载体导入大肠杆菌DH5α和欧文氏菌SCB125，表达水平都很高，达到或超过目前文献报道的水平，重组表达的2,5DKG还原酶具有很高的催化活性，适用于改进葡萄糖串联发酵产生维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的工艺，具有很大的应用价值。