包含一个IgE－结合结构域和一个HSA成分的融合多肽及其在诊断和治疗中的应用

发明领域

本发明涉及融合多肽。它涉及包含一个IgE-结合结构域和一个人血清白蛋白(HSA)成分的融合多肽及其盐。它也涉及多核苷酸和生理功能相同的多肽，它们是制备这些融合蛋白过程中的中间物；以及适当的重组表达载体，相应的原核和真核表达系统，和合成此融合多肽的方法。发明背景

免疫球蛋白E(IgE)与其受体之间的相互作用在人抵御寄生虫感染中具有确定的作用(M.Capron和A.Capron.《科学》(Science)264[1994]1876-1877)。然而在具有良好卫生条件的工业化国家，环境变应原引起的IgE的过量产生对IgE网络的干扰要比接触寄生虫更频繁，它导致变态反应和其它的IgE或者IgE受体介导的疾病状态。

IgE是参与引发速发型变应性应答的主要抗体，是维持晚期应答的主要参与者。IgE在B淋巴细胞中合成，与高亲和力的IgE受体即FcεRI结合后发挥效应，发现FcεRI位于变态反应效应细胞如肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜伊红性粒细胞的表面。IgE也可通过与其在抗原提呈细胞如朗罕氏细胞、B细胞和单核细胞上的受体结合发挥诱导功能(G.C.Mudde等人，《变态反应》(Allergy)50[1995]193-199)。

当IgE分子通过IgE受体FcεRI与变态反应效应细胞表面结合，并且被变应原交联时，即出现变应性应答或状态。由此导致信号传导，起始了细胞中胞质颗粒的脱粒，并伴随着变态反应介质的释放，如组胺、5-羟色胺、前列腺素和细胞因子，以及随后发生的局部组织水肿和炎性细胞的流入。另一个刺激变态反应及相关状态的方法是IgE受体FcεRI与抗FcεRI的循环自身抗体的相互作用。

FcεRI典型地以四聚体存在，包含一个α-、一个β-和两个γ-链(即＂亚单位＂)，尽管在单核和朗罕氏细胞上β-亚单位缺失。

据显示FcεRI的IgE结合位点完全包含于其α亚单位中(称为FcεRIα)(J.Hakimi等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)265[1990]22079-22081；U.Bank等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)266[1991]2639-2646)。发现删除完整α-亚单位基因的重组＂敲除＂鼠不能使变应性应答演变为变应原激发(D.Dombrowicz等人，《细胞》(Cell)75[1993]969-976)。

FcεRIα是一种高度糖基化的多肽，分子量大约60KD，包含一个疏水穿膜结构域以及暴露于细胞外表面的亲水胞外(＂外＂)和胞质结构域。FcεRIα的IgE结合能力被进一步定位于胞外部分(J.Hakimi等人，[1990]出处同前；Leder等人，美国专利4′962′035)。可通过切除穿膜部分及其下游序列而产生了可溶的分泌性分子(C.Ra等人，《国际免疫学》(Int.Immunol.)5[1993]47-54)；产生的截短成分基本由人FcεRIα胞外结构域组成，在体内和体外均具有IgE结合活性(M.Haak-Frendscho等人，《免疫学》(Immunol.)151[1993]351-358：“与截短的IgG1 H链C区融合的FcεRIα的氨基酸残基1-204”；C.Ra等人，[1993]出处同前：FcεRIα的残基1-172，对应于SEQ.ID.NO.1的残基26-197)。此片段的结构特征包括两个潜在的二硫桥和七个潜在的糖基化位点(M.Haak-Frendscho等人[1993]，出处同前)。

因此，基本由胞外结构域组成的截短的FcεRIα可能用于治疗性地向哺乳动物施用，结合血清IgE，以防止它与变态反应效应细胞上的高亲和力受体结合，并且也抑制人淋巴细胞中IgE的从头生物合成(Y.Yanagihara等人，《临床调查杂志》(J.Clin.Invest.)94[1994]2162-2165)。

然而，由于IgE-结合多肽如FcεRIα的胞外结构域可被从循环血浆中快速清除，在体内存留极短，从而阻碍了其在系统治疗哺乳动物IgE-或IgE受体介导的变应性疾病中的有效应用。鉴于IgE-或IgE受体介导的疾病占医生-患者接触的10-20％，有效的治疗将明显有益于患此疾病的患者，并对临床中治疗IgE或IgE受体介导的疾病如变态反应和变态反应相关疾病有重要提高。

因此将受益于获得一种IgE-结合多肽，它具有延长的有效的血清寿命，并在治疗变态反应尤其是系统治疗特应性皮炎、变应性哮喘和慢性荨麻疹中具有提高的临床应用，以及在效率高、效益好的方法中具有提高的活性。发明概述

现在发现，通过将一个IgE-结合结构域与一个人血清白蛋白(HSA)成分融合，可以获得比单独的IgE-结合结构域具有延长的血清半寿期的融合多肽，而IgE-结合活性不丢失，产生用于系统治疗变态反应和其它IgE-介导疾病的IgE-结合多肽。系统施用的IgE-结合多肽将与血清IgE及抗IgE受体的循环自身抗体FcεRIα结合，防止它们与细胞所结合的FcεRIα结合，并且防止和/或抑制变应性反应及相关现象。

进一步发现，可以应用每分子包含多于一个IgE-结合结构域的本发明的融合多肽来获得IgE-结合活性的显著提高。例如，发现本发明的＂二聚体＂分子比本发明的＂单体＂具有显著提高的IgE-结合活性。

名词＂二聚体＂在此指本发明的具有两个IgE-结合结构域的融合多肽。名词＂单体＂指本发明的具有一个IgE结合区的融合多肽。单体或二聚体可包括单个或多个HSA成分。例如，一种本发明的单体融合多肽可包含一个IgE-结合结构域，其氨基端或羧基端与一个HSA成分相融合。另外，单体也可包含一个两端均与HSA成分融合的IgE-结合结构域。根据本发明的二聚体融合多肽可包含，例如，两个IgE-结合结构域，它们中一个的羧基端和另一个的氨基端与介入的HSA成分相融合。另外，除两个IgE-结合结构域之外，二聚体可包含多个HSA成分。

进一步发现本发明的二聚体分子具有意外的有利的活性。

因此本发明涉及融合多肽及其盐，它们包含至少一个与至少一个HSA成分相融合的IgE-结合结构域；优选的，涉及单体融合多肽，其中单个IgE-结合结构域与一个或多个HSA成分相融合，或者涉及多聚体融合多肽，其中两个或多个IgE-结合结构域与至少一个HSA成分相融合；更优选的，涉及具有两个IgE-结合结构域和至少一个HSA成分二聚体。

本发明进一步涉及其多核苷酸中间物。

名词＂融合的＂或＂融合＂在此指如下多肽：

(i)一个给定的功能性结构域(即IgE-结合结构域)，其羧基端通过共价(优选的，肽，即酰胺)键与另一个功能性结构域(即HSA成分)的氨基端或接头肽相结合，此接头肽本身通过共价(优选的，肽)键与其它功能性结构域的氨基端结合；和/或，

(ii)一个给定的功能性结构域(即IgE结合结构域)，其氨基端通过共价(优选的，肽，即酰胺)键与另一个功能性结构域(即HSA成分)的羧基端或接头肽相结合，此接头肽本身通过共价(优选的，肽)键与其它功能性结构域的羧基端结合。

同样地，当与本发明的多核苷酸中间物一同使用时，＂融合的＂意思是指编码第一个功能性结构域的核苷酸序列的3′-[或5′-]端，通过共价键或间接地通过核苷酸接头，与编码第二个功能性结构域的核苷酸序列相应的5′-[或3′-]端结合，此接头本身的末端优选地与编码第一个功能性结构域的多核苷酸及编码第二个功能性结构域的多核苷酸共价结合。

优选地，融合多肽或其盐是单体或二聚体；当是二聚体时，它包含两个与一个HSA成分融合的IgE-结合结构域，例如第一个IgE-结合结构域在其羧基端与一个HSA成分的氨基端融合，而第二个IgE-结合结构域在其氨基端与此HSA成分的羧基端融合。

本发明的融合多肽除IgE-结合结构域和HSA成分外，也可包含另外的功能性结构域，例如，全长或截短的人蛋白质(如可溶的胞外片段)，如细胞因子或尿激酶的氨基端片段。这些另外的功能性结构域本身可作为接头肽，例如，用于一个IgE-结合结构域与另一个IgE-结合结构域或一个HSA成分的连接；另外，它们可位于融合分子的其它部位，如其氨基或羧基端。

本发明的融合蛋白的实例可用以下通式表示：I.    R₁-L-R₂II.   R₂-L-R₁III.  R₁-L-R₂-L-R₁IV.   R₁-L-R₁-L-R₂V.    R₂-L-R₁-L-R₁     其中R₁是一个IgE-结合结构域的氨基酸序列，R₂是一个HSA成分的氨基酸序列，每一个L是独立的共价(优选的，肽)键，或者是通过共价(优选的，肽)键与R₁和/或R₂末端结合的肽接头，以上分子片段有阅读方向性，即左侧对应于分子的氨基端而右侧对应于分子的羧基端。

发现当融合多肽被IgE-结合结构域引导时，即，当IgE结合结构域组成成熟融合蛋白的N-端部分时(如以上通式I、III和IV的化合物中)，IgE结合是高水平的。本发明的一个特别优选的实施方案包括以上的通式III的二聚体，即其中引导表达的蛋白质区是IgE-结合结构域，其羧基端与一个HSA成分的氨基端融合，而此HSA成分反过来以其羧基端与第二个IgE-结合结构域的氨基端融合。当存在多于一个的R₁成分，或多于一个的R₂成分，或多于一个的L成分时，这些成分可以相同，但这不是必需的。

优选地，本发明的融合多肽包含至少一个可溶、分泌性的、与至少一个HSA成分融合的哺乳动物IgE-结合结构域，及其药学可接受的盐。

本发明进一步涉及防止和/或治疗IgE或IgE受体-介导的疾病的方法，尤其是变应性反应如特应性皮炎、变应性哮喘和慢性荨麻疹，包括对需要此种治疗的对象施用本发明的融合多肽或其药学可接受的盐；并且涉及药物组合物，它包含本发明的融合多肽或其药学可接受的盐，以及至少一种药学可接受的载体或稀释剂。

本发明进一步涉及本发明的融合多肽的生理功能相同物，它们是多肽合成的中间物；涉及多核苷酸，它们是制备融合多肽或如上定义的生理功能相同物的过程中的中间物；涉及用于构成它们的寡核苷酸中间物；涉及由这些寡核苷酸编码的肽；涉及用于表达融合分子的重组载体；涉及原核或真核(尤其哺乳动物)表达系统；以及应用这些表达系统制备融合多肽或其生理功能相同物的方法。

SEQ.ID.NO的描述及相关定义

SEQ.ID.NO.1：全长天然人FcεRIα优势形式的氨基酸序列，包括信号序列。

名词＂前-IgE^R＂指SEQ.ID.NO.1的残基Met₁-Leu₂₀₄。名词＂IgE^R＂指前-IgE^R的成熟形式，并组成SEQ.ID.NO.1的残基Val₂₆-Leu₂₀₄(即FcεRIα的胞外结构域)。

SEQ.ID.NO.2：天然前原-HSA的优势形式的氨基酸序列(在此称为＂前原HSAI＂)，包括残基Met₁-Leu₆₀₉。

SEQ.ID.NO.2的残基AsP₂₅-Leu₆₀₉代表成熟天然蛋白的优势形式(在此称为＂HSAI＂)。

名词＂前原-HSAII＂代表羧基端截短一个氨基酸(Leu₆₀₉)的天然序列，因此指SEQ.ID.NO2的残基Met₁-Gly₆₀₈。

SEQ.ID.NO.2的残基Asp₂₅-Gly₆₀₈代表前原-HSAII的成熟形式，在此称为＂HSAII＂。

SEQ.ID.NO.3：实施例5中制备的质粒R-H-R/SK#50的EcoRI片段所编码的氨基酸序列，包括残基1-204处的＂前-IgE^R＂序列；残基205-211处的接头AlaSer(Gly)₄Ser(以下称为＂L₁＂)；残基212-795处的HSAII序列；残基796-799处的接头(Gly)₃Ser(以下称为＂L₂＂)；以及残基800-978处的＂IgE^R＂序列。

本发明的成熟二聚体融合多肽，在此称为＂IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R＂或者＂IgE^R-HSA-IgE^R二聚体＂，是应用实施例7描述的方法由CHO细胞表达的，具有SEQ.ID.NO.3的氨基酸序列Val₂₆-Leu₉₇₈。SEQ.ID.NO.4：实施例5质粒R-H-R/SK#50的EcoRI片段的核苷酸序列，包括：位点10-621处编码＂前-IgE^R＂的多核苷酸序列；位点622-642处编码L₁的寡核苷酸；位点643-2394处编码HSAII的多核苷酸；位点2395-2406处编码L₂的寡核苷酸；以及位点2407-2943处编码＂IgE^R＂的多核苷酸；位点2944-2949处的两个终止密码子。

编码片段尾端和接头区中的限制位点位于位点1-6；622-627；637-642；2387-2393；2401-2406；和2950-2955。Kozak序列位于核苷酸位点7-9。

与HSA共有核苷酸序列不同的点突变位于位点804，1239；1290；1446，1815，2064和2079。因为点突变位于摆动位置，不影响氨基酸序列。

SEQ.ID.NO.5：天然前原-HSA的优势形式的核苷酸序列，对应于图12和SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。

SEQ.ID.NO.6；全长天然人FcεRIα的优势形式的核苷酸序列，包括信号序列，对应于图13和SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列。附图描述

以下附图中，所示的分子有阅读方向性，即左侧对应于氨基(或5′-)端而右侧对应于羧基(或3′-)端。

图1A-C：鼠中的血清半寿期：不同时间(注射后10-800分钟)体内蛋白浓度(每ml血清中蛋白的皮摩尔数)：

(A)游离HSAI蛋白，和

(B)实施例7描述的从CHO细胞中制备的IgE^R蛋白(称为＂游离α链＂)和IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R二聚体融合多肽(称为＂IgE^R-HSA-IgE^R＂二聚体)。

(C)(A)中游离HSAI与(B)中二聚体融合多肽(＂IgE^R-HSA-IgE^R＂)的血清半寿期的对比，将注射后10分钟的血清浓度标准化为1。图2：被动皮肤过敏反应导致的外渗

鼠中静脉施用系列稀释(10μg/kg、50μg/kg或500μg/kg)的IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R多肽(＂IgE^R-HSA-IgE^R二聚体＂)，按实施例7描述的方法制备(对照组接受0μg/kg)；面积mm²；在通过皮内注射单克隆鼠IgE抗-二硝基苯(DNP)抗体致敏和随后的含1％伊凡斯蓝的DNP-牛血清白蛋白溶液激发之前，间隔5、15或30分钟。

图3：本发明的三种融合多肽的示意图(两种单体和一种二聚体)，也显示了多肽接头：

I.单体：

(1)HAS-前导单体，包含通过L₂(“GGGS”)与IgE^R融合的HSAII(图中称为“HSA”)。编码HSAII位点Leu₆₀₇Gly₆₀₈的核苷酸包含一个如标出的唯一的MstII位点，编码L₂的GlySer的核苷酸包含一个BamHI位点(编码的氨基酸以下划线标出)。

(2)IgE-结合结构域前导单体，包含在其羧基端通过L₁(即“ASGGGGS”)与HSAII(图中称为“HAS”)融合的IgE^R。编码L₁的寡核苷酸分别包含一个NheI位点和一个BamHI位点(L₁的编码氨基酸AlaSer和GlySer以下划线标出)。

II.二聚体：IgE-结合结构域前导二聚体，包含第一个IgE^R，在其羧基端通过L₁与HSAII(图中称为“HSA”)的氨基端融合，此HSAII的羧基端通过L₂及以上描述的编码单体多核苷酸中的限制位点与第二个IgE^R融合。

图4：截短的全长人FcεRIαcDNA(称为“IgE受体cDNA”)的PCR引物，用于获得编码以下成分的DNA：

(i)IgE^R[通过寡核苷酸#18添加到FcεRIα编码链5′末端的BamHI位点；以及通过寡核苷酸#19添加到非编码链3′末端的终止密码子和EcoRI和SalI位点]；

(ii)前-IgE^R

[添加SstI、EcoRI和Kozak位点至FcεRIα编码链5′末端的寡核苷酸#20；在FcεRIα非编码链中添加NotI和NheI位点(以及删除第二个NheI位点)的寡核苷酸#31]；

(iii)前-IgE^R

[如以上所述使用的寡核苷酸#20和#19]：

(A)“HSA-前导”：将上述(i)亚克隆入SK载体，提供克隆载体TA克隆pEK1，用于构建HSAII-前导单体。

(B)“IgE^R-前导”：将(ii)亚克隆入SK载体，提供构建体IgE^R/TA#1，用于制备IgE^R-前导单体。

(C)“单独的IgE^R”：将(iii)亚克隆入SK载体，提供构建体IgE^RFL/TA#34，用于表达作为标准的成熟IgE^R。双星号代表两个终止密码子。

图5：截短全长人前原-HSAI cDNA的PCR引物对，以产生编码如下成分的cDNA：

(i)在羧基端与L₂融合的前原-HSAII[添加SpeI、EcoRI和Kozak序列到编码链5′-末端的寡核苷酸#24；寡核苷酸#28和#29，在HSAII3′端添加编码MstII和HindIII位点的接头]；

(ii)与HSAII5′端融合的L₁[添加NotI、NheI、接头和BamHI位点到编码链的寡核苷酸#26；包含非编码链中NcoI位点的寡核苷酸#27]。

(iii)前原-HSAI[如上应用的寡核苷酸#24；以及添加终止子、EcoRI和HindIII位点至非编码链3′端的寡核苷酸#25]：

(A)“HSA前导”：将(i)亚克隆入SK载体，提供用于构建HSAII-前导单体的pEK7。

(B)“IgE^R前导”：将(ii)亚克隆入SK载体，提供用于构建IgE^R-前导单体的HSA/SK#5。

(C)“单独的IgE^R”：将(iii)亚克隆入SK载体，提供HSA/SK#17，编码用作标准的成熟天然人血清白蛋白(即HSAI)。

图6：人血清白蛋白(HSA)测序寡核苷酸#1-10、12、16、17、22和30，用于对克隆入TA并且与IgE-结合片段连接后的材料进行测序。

图7：IgE受体测序寡核苷酸#11、13和23，用于对克隆入TA并且与HSA成分连接后的片段进行测序。

图8：

(A)人血清白蛋白的致突变寡核苷酸#14和#15；

(B)用于构建融合多肽的PCR和接头寡核苷酸#18-20，24-29和31。

图9：载体HSA-IgE^R/SK#49的构建，它包含编码前原-HSAII的多核苷酸(图中称为“HSA”)，其在3′端通过编码接头L₂的寡核苷酸(图9中以“GGG”表示)与编码IgE^R的多核苷酸(图中称为“IgE^R”)的5′端融合，方法是将pEK1的BamHI、SalI片段连接入用BamHI、SalI酶切的pEK7。

图10：载体IgE^R-HSA/SK#1的构建，它包含编码前-IgE^R的多核苷酸(图中称为“IgE^R”)，其在3′端通过接头L₁的寡核苷酸(以“GGG”表示)与编码HSAII的多核苷酸(“HSA”)的5′端融合，方法是将IgE^R/TA#1的SstI、NheI片段连接入SstI、NheI酶切的HSA/SK#5。

图11：载体HSA-IgE^R Pst Sal/SK#37的构建，它包含编码HSAII的多核苷酸(表示为“HSA3”)，其在3′端通过L₂的寡核苷酸(未描述)与编码IgE^R的多核苷酸(表示为“IgE^R”)的5′端融合，方法是将HSA-IgE^R/SK#49的PstI、SalI片段连接入SK载体。也显示载体R-H-R/SK#50的构建，它包含一个编码前-IgE^R的多核苷酸(表示为“IgE^R”)，其在3′端通过L₁的寡核苷酸(未描述)与编码HSAII的多核苷酸(“HSA”)的5′端融合，编码HSAII的多核苷酸再通过L₂的寡核苷酸(未描述)与编码IgE^R的多核苷酸(“IgE^R”)融合。此载体的制备方法是将HSA-IgE^R Pst Sal/SK#37的PstI、KpnI片段连接入PstI、KpnI酶切的IgE^R-HSA/SK#1。

图12：人血清白蛋白的核苷酸序列和对应于SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.5的氨基酸序列。

图13：IgE^R的核苷酸序列和对应于SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.6的氨基酸序列。

图14：R-H-R/SK#50的EcoRI片段的核苷酸和氨基酸序列，对应于SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4，编码R₁-HSA-R₁二聚体融合蛋白。HSA序列以斜体字显示。接头序列以小写显示。不同于共有HSA核酸序列的点突变以粗体小写显示。因为点突变在摆动位置，不影响氨基酸序列。片段末端和接头区中的限制位点以下划线标出。

图15：实施例7中纯化的成熟融合多肽的SDS-PAGE：加于凝胶的总量：8μg(道1)、6μg(道2)、4μg(道3)和2μg(道4)；分子量标准：97.4、66.2、45、31、21.5和14.4KD(道5)。发明详述

本发明涉及融合多肽及其盐，包含至少一个与至少一个HSA成分融合的IgE-结合结构域。

名词“IgE-结合结构域”指能结合哺乳动物如人的IgE、或能用其它方式与其关联以防止IgE与其受体FcεRI结合的氨基酸序列。

人FcεRIα的cDNA和推断的氨基酸序列已知(J.Kochan等人，《核酸研究》(Nucleic Acid Research)16[1988]3584；以及Leder等人，美国专利4′962′035)。人FcεRIα编码一个NH₂-端信号肽[氨基酸残基(包括第一个Met)Met₁-Ala₂₅]、两个免疫球蛋白样的胞外结构域(残基Val₂₆-Leu₂₀₄)、一个疏水穿膜区(Gln₂₀₅-Ile₂₂₄)和一个亲水胞质尾区(残基SeR₂₂₅-Asn₂₅₇)(参考SEQ.ID.NO.1)。在细胞内加工期间信号肽被切除。天然人FcεRIα优势形式的全长氨基酸序列包括在SEQ.ID.NO.1中。

“IgE^R”在此指SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列Val₂₆-Leu₂₀₄(编码胞外结构域)；名词“前-IgE^R”指SEQ.ID.NO.1的Met₁-Leu₂₀₄残基(编码胞外结构域的信号序列上游)。

IgE-结合结构域是与以上定义的IgE^R具有至少80％，更优选的至少85％，更优选的至少95％，或者最优选的至少99％同源性的氨基酸序列(在对比序列以及必要时引入跨度(gap)以达到最大百分数的序列相同后，计算天然序列与改变了的序列间的相同百分数即为同源性，作为天然分子的总序列长度的函数)。

在本发明的融合多肽的亚基中，IgE-结合结构域成分是

(Xa)其中(Xa)是：(a)IgE^R；或者(b)IgE^R的天然发生的等位基因，或者(c)在羧基端截短1-12(如1-10，1-7或1-4)个氨基酸的(a)或(b)；或(d)(a)、(b)或(c)的一种变体。“变体”意思是：

—被可达10(如1-7或1-5)个氨基酸的一个或多个缺失(不同于在羧基端的截短)所修饰的(a)、(b)或(c)的序列；

—在氨基酸序列内部插入总数可达10(如1-5)个的氨基酸，或者在任一端插入总数可达100的氨基酸；或

—总数可达15(如1-5)个氨基酸的保守替换。

更优选的IgE-结合结构域是

(Xb)其中(Xb)是：(a)IgE^R；(b)羧基端截短1-7个氨基酸的IgE^R；或(c)(a)或(b)的一种变体。甚至更优选IgE-结合结构域为

(Xc)其中(Xc)是：(a)IgE^R；或(b)羧基端截短1-7个氨基酸(如SEQ.ID.NO.1的序列Val₂₆-Ala₁₉₇)的IgE^R。

最优选的IgE-结合结构域为IgE^R。

优选地，任何同系物、截短体或变体被重组制备为“可分泌的”多肽，即编码IgE-结合结构域的成熟肽序列可被从宿主细胞中分泌，细胞中此序列(或前体形式如预成体(preform))从多核苷酸合成。

本发明的重组融合蛋白人血清白蛋白(HSA)的其它主要成分构成了最丰富的血浆蛋白，占血浆总蛋白含量的每重量成分的60％。人血清白蛋白分子由非糖基化的585个氨基酸的多肽单链组成，分子量66.5KDa。白蛋白一个特殊的特征是它的复杂的二硫键模型(F.F.Clerc等人，《色谱杂志》(J.Chromatogr)662[1994]245-259)。人血清白蛋白广泛分布于全身，尤其是肠道和血液区室中，其中它作为血清中最丰富的蛋白主要维持渗透压和血浆体积。此外，人类中它可被肝脏缓慢清除，显示14-20天的体内半寿期(T.A.Waldmann，“白蛋白结构、功能和应用”，Pergamon出版社[1977]255-275)。人血清白蛋白缺乏酶或免疫学功能。它是参与内源转运和各种天然以及治疗性分子运输的天然载体(H.Lu等人，《欧盟生物化学学会通讯》(FEBS Lett.)356[1994]56-59；WO 93/15199；EP 648499；P.Yeh等人，美国国家科学院院报(PNAS USA)89[1992]1904-1908；EP 413622)。

人细胞最初以前原-多肽的形式合成血清白蛋白。蛋白质穿过内质网腔时，18个氨基酸的信号序列(包括第一个Met)被去除，在N-端仍留下6个氨基酸(主要形式：Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg)，它在穿过分泌器官的运输过程中或之后立即被蛋白酶酶解切除。

众所周知人血清白蛋白是多态的(D.C.Carter和J.X.Ho，《蛋白质化学进展》(Adv.Pro.Chem.)45[1994]153-203)。例如，白蛋白Naskapi以Lyr₃₇₂替换Glu₃₇₂，原白蛋白Christchurch有改变的原-序列，即Glu₂₄代替Arg₂₄(Latta等人，美国专利5′100′784)。

天然发生的蛋白质的优势形式，在此称为“前原-HSAI”，其完全的氨基酸序列是已知的(A.Dugaiczyk等人，美国国家科学院院报79[1982]71-75)(SEQ.ID.NO.2)。SEQ.ID.NO.2的Asp₂₅-Leu₆₀₉代表成熟蛋白的优势形式(“HSAI”)。

本发明的融合多肽的HSA载体，可以是与SEQ.ID.NO.2的残基25-609(即HSAI)具有至少80％，更优选的至少85％，更优选的至少95％，或最优选的至少99％同源性的氨基酸序列(在对比序列以及必要时引入跨度以达到最大百分数的序列相同后，计算天然序列与改变了的序列间的相同百分数即为同源性，作为天然分子的总序列长度的函数)。

在本发明的融合多肽的亚基中，HSA成分是

(Ya)其中(Ya)是：(a)HSAI；或者(b)(a)的天然发生的等位基因；或者(c)在其羧基端截短1-10(如1-5，或1或2)个氨基酸的(a)或(b)；或(d)终止于氨基酸残基n的截短的(a)，其中n是369到419，特别是373、387、388、389、390和407(如美国专利5′380′712中所描述)；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的一种变体。

“变体”意思是：

—被可达10(如1-7或1-5)个氨基酸的一个或多个缺失(不同于羧基端的截短)所修饰的(a)、(b)、(c)或(d)的序列；

—在序列内部插入总数可达10(如1-5)个的氨基酸，或者在任一端插入总数可达100的氨基酸；或

—总数可达15(如1-5)个氨基酸的保守替换。

更优选的HSA成分是

(Yb)其中(Yb)是：(a)HSAI；或(b)(a)的天然发生的等位基因；或(c)在其羧基端截短1-10(如1-5、或1或2)个氨基酸的(a)或

(b)；或(d)(a)、(b)或(c)的一种变体。

甚至更优选的HSA为

(Yc)其中(Yc)是：(a)HSAI，或(b)在其羧基端截短1-10(如1)个氨基酸的HSA(这种截短的一个实例是“HSAII”，其是SEQ.ID.NO.2的Asp₂₅-Gly₆₀₈所代表的氨基酸序列)。

在甚至更优选的亚基中，HSA成分是HSAI或HSAII，尤其是HSAII。

特别优选的是实施例7的融合多肽，尤其是没有前导序列的融合多肽，即SEQ.ID.NO.3的多肽Val₂₆-Leu₉₇₈。

优选地，用于制备本发明的融合蛋白的天然HSA的任何同系物、截短体或变体均缺少酶功能；并且不能防止或抑制IgE-结合结构域与血清IgE结合。更优选的是这种同系物或变体将具有至少14天的血清半寿期。

谈及IgE-结合结构域或HSA成分，名词＂保守替换＂指一个或多个氨基酸被其它具有相似性质的氨基酸替换，以使至少多肽的二级结构，更优选的是三级结构基本不变。例如，典型的这种替换包括丙氨酸或缬氨酸替换甘氨酸，天冬酰胺替换谷氨酰胺，丝氨酸替换苏氨酸以及精氨酸替换赖氨酸。所有这些氨基酸(除甘氨酸外)更优选地是天然发生的L-氨基酸。

优选地，每一个IgE-结合结构域与IgE^R至少95％同源，并且每个HSA成分与HSAI至少95％同源。

在其它优选的亚基中：

-每个IgE-结合结构域优选地是(Xa)，并且每个HSA成分是(Ya)，或更优选地(Yb)，或甚至更优选地(Yc)，如上定义；

-每个IgE-结合结构域更优选地是(Xb)，并且每个HSA成分是(Ya)，或更优选地(Yb)，或甚至更优选地(Yc)，如上定义；

-每个IgE-结合结构域甚至更优选地是(Xc)，并且每个HSA成分是(Ya)，或更优选地(Yb)，或甚至更优选地(Yc)。

进一步选择，IgE-结合结构域是IgE^R，并且HSA成分是(Ya)，或更优选地(Yb)，或甚至更优选地(Yc)，如上定义，最优选地是HSAI或HSAII，尤其是HSAII。

上面表达的选择也尤其应用于通式I、II、III、IV和V各自的多肽。

本发明的优选的多肽包含第一个IgE^R分子，其通过羧基端与HSAII分子的氨基端融合，而HSAII在其羧基端与第二个IgE^R分子的氨基端融合。(IgE^R是SEQ.ID.NO.1的残基Val₂₆-Leu₂₀₄；而HSAII是SEQ.ID.NO.2的残基Asp₂₅-Gly₆₀₈)。

本发明的特别优选的多肽包含以上通式III的二聚体，其中每个R₁是IgE^R、R₂是HSAII。特别优选的是每个L为1-25个氨基酸的通式III的二聚体。

任何优选的肽接头(在通式I-V中表示为＂L＂)允许独立折叠和IgE-结合结构域活性；且无发展为可妨碍IgE-结合结构域或导致患者的免疫反应的一种有序二级结构的倾向；并且具有最小的能与IgE-结合结构域相互作用的疏水或电荷特性。

肽接头优选地为1-500个氨基酸；更优选的为1-250个氨基酸；甚至更优选的是1-100(如1-25、1-10、1-7或1-4)个氨基酸。接头优选为线性，即没有分支的。总体上，肽接头包含可满足接头标准的Gly、Ala和Ser。例如，本发明的接头包括：GlyGlyGlySer(在此为＂L₁＂)和AlaSerGlyGlyGlyGlySer(在此为＂L₂＂)。也可使用不同长度和序列组成的接头。

本发明也包含编码本发明的肽接头的寡核苷酸。这些寡核苷酸应与编码IgE-结合结构域和HSA成分的多核苷酸＂在框架内融合＂，并且优选地包括分子中唯一的限制位点。＂在框架内融合＂意思是：

(1)在IgE-结合结构域或HSA成分的阅读框中不存在接头寡核苷酸导致的位移；以及

(2)IgE-结合结构域和HSA成分的阅读框之间无翻译终止。

本发明进一步包括新的融合多肽的生理功能相同物，它们是合成新的多肽中的正常的中间物。名词＂生理功能相同物＂优选地指包含本发明的融合多肽的更大的分子，其中加入了从特定宿主细胞中有效表达和分泌本发明的成熟重组融合多肽所必要或期望的氨基酸序列。这些添加序列典型地位于成熟多肽的氨基端，通常组成了可引导其进入分泌路径的前导(即信号)序列，且通常在从细胞中分泌该多肽之前或一经分泌后被切除。信号序列可由相关多肽的天然N端区衍生而来，或者从编码分泌蛋白的宿主基因中获得，或者由任何已知可提高目的多肽分泌的序列衍生而来，包括合成的序列和＂前-＂、＂原-＂区之间的所有组分。信号序列与编码成熟多肽序列之间的连接点对应于宿主的切割位点。

在融合多肽中IgE-结合结构域＂引导＂表达，即位于融合分子中其它编码序列的上游，应用天然人FcεRIα的前导序列(即SEQ.ID.NO.1的Met₁+Ala₂-Ala₂₅)是有利的，并被有效应用于从哺乳动物表达系统(如CHO、COS)以及酵母(巴斯德毕赤氏酵母)中获得成熟多肽。

成熟二聚体融合多肽IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R的生理功能相同物的一个实例是：前-IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R。然而，另外的前导序列不必是人FcεRIα的前导序列，并可从任何合适的来源获得，只要它适于实现从特定宿主细胞中表达/分泌成熟多肽。例如，HSA的前原-序列也可用于制备以上的二聚体融合多肽，特别是用于在酵母中表达。

在本发明的融合多肽中HSA成分引导表达，合适的前导序列可包含天然前导序列。例如，HSA的天然前原区可被用于从哺乳动物(如CHO、COS)细胞或酵母(巴斯德毕赤氏酵母)中分泌成熟的异源多肽。

HSAII-L₂-IgE^R所代表的成熟融合多肽的生理功能相同物的一个实例是：前原HSAII-L₂-IgE^R。然而，其它前导序列，对HSA或宿主细胞不必是天然的，可提供在一定宿主中有效表达成熟融合蛋白(美国专利5′100′784；美国专利5′330′901)。

本发明也包括多核苷酸，它们是制备本发明的重组融合多肽过程中的中间物，包括编码融合多肽或其生理功能相同物的多核苷酸，以及编码接头肽的寡核苷酸，例如图8所描述的。

另一方面，提供了制备以上定义的重组融合多肽或其盐的方法，包括：

(a)用载体转化宿主细胞，此载体包含编码以上定义的融合多肽或其生理功能相同物的DNA。

(b)在该细胞中表达融合多肽或其生理功能相同物，籍此修饰生理功能相同的多肽(如通过切除信号序列)，产生以上定义的融合多肽；以及

(c)从宿主细胞中回收结果多肽，优选地作为分泌产物，任选地以盐的形式。

本发明的另一方面提供了用于表达融合多肽的载体，优选的是质粒。这些载体包含编码以上定义的多核苷酸或其生理功能相同物的DNA。总体上，能转化可表达融合多肽的微生物的合适载体包括包含编码融合多肽核苷酸序列的表达载体，此序列与转录和翻译调控序列如启动子相连接，它们一起组成了表达盒。启动子可以由使用的特定宿主的基因衍生而来，或者这些控制区被修饰如，通过体外定点诱变，通过引入另外的控制元件或合成序列。在本发明中特定使用的表达盒也包括转录和翻译终止区，它们在意欲使用的宿主中有功能，位于编码杂合大分子的序列的3′末端。除表达盒外，载体将包括可使转化的宿主被选择的一种或几种标记。这些标记包括赋予抗生素抗性如G418抗性的标记。这些抗性基因将被置于合适的转录和翻译信号的控制下，以便在给定宿主中表达。

更具体的是，本发明的重组融合多肽的制备可按如下所述实现：A：融合蛋白表达载体的构建

重组融合多肽构建的第一步是把融合多肽部分亚克隆至克隆载体。本文中，＂克隆载体＂是能在宿主原核细胞中自主复制的DNA分子，如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体典型地包含一个或少量的限制性内切酶识别位点，外源DNA序列能以可决定的方式在此位点插入而不丢失载体的基本生物学功能，克隆载体也包括适合用于选择、鉴定克隆载体转化的细胞的标记基因。标记基因典型地包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。合适的克隆载体在J.Sambrook等人(编写)的《分子克隆：实验指南》第二版(冷泉港实验室出版社[1989])中有描述，并可从不同的来源获得。

FcεRIαcDNA克隆pGEM-3-110B-1，在A.Shimizu等人于美国国家科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)85[1988]1907-1911发表的文章中有描述，可从美国典型培养物保藏中心(ATCC原种#67566)获得。单链人肝cDNA可从Clontech获得(PCR-准备的快速克隆cDNA，Cat.D#7113-1)。HSA序列可从GenBank保藏号#S：V00495、JOOO78、LOO132、LOO133下获得。HSA cDNA可用寡核苷酸#24和25通过PCR扩增获得，如实施例2所描述。

编码合适的IgE-结合结构域的多核苷酸或HSA成分DNA可应用聚合酶链式反应(PCR)来制备。PCR利用单链cDNA模板和寡核苷酸引物的混合物。PCR步骤通过众所周知的方法进行。(见如C.R.M.Bangham，＂聚合酶链式反应：正在开始＂，《人类分子遗传学手册》，人类出版社[1991]，章I，p.1-8)。PCR试剂盒及其中使用的材料也已商品化，可从不同来源获得。试剂盒及其使用方法进一步在如美国专利5′487′993中描述。

编码信号肽的DNA序列可以通过PCR添加，或者如果必要时使用编码已知信号肽序列的合成寡核苷酸。编码异源信号肽与编码融合多肽N-端的DNA序列被亚克隆至框架内。

多核苷酸的融合可通过亚克隆至中间载体来完成。另外，一个基因可被直接克隆至包含其它基因的载体。接头和衔接子可用于连接DNA序列。

亚克隆按常规技术进行，例如用限制酶消化以提供合适的末端，应用碱性磷酸酶处理以避免不希望的DNA分子的连接，以及用合适的连接酶连接。这些操作技术在文献中有描述，为本领域已知。B：融合多肽的表达克隆

然后从克隆载体上切下克隆的融合蛋白，插入一种表达载体。合适的表达载体典型地包括：

(1)编码细菌复制起点的原核DNA元件，以及用于在细菌宿主中生长和选择表达载体的抗生素抗性标记。

(2)控制转录起始的真核DNA元件，如启动子；以及

(3)控制转录物加工的DNA元件，如转录终止/聚腺苷酸化序列。

因此，本发明另一方面涉及用于表达本发明的融合多肽的载体，优选的是质粒载体，它包含在此描述的编码本发明的融合多肽的多核苷酸序列。可转化原核或真核细胞的适当的表达载体包括含有编码融合分子核苷酸序列的表达载体，此序列与根据应用的宿主细胞而选择的转录和翻译调控序列相连接。为在大肠杆菌中表达，可应用如M.W.Robertson在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)268[1993]12736-12743发表的文章中描述的载体。产物预期是二硫键键合的但非糖基化的。为在酵母中表达，可应用表达载体如Invitrogen(San Diego，CA，美国)巴斯德毕赤氏酵母表达试剂盒(目录#K1710-01)提供的pHIL-D2。蛋白质产物预期是二硫键键合的和糖基化的。其它合适的酵母表达系统包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)。为在杆状病毒中表达，载体如pAC360、pVL1392和pVL1393(Invitrogen，SanDiego，CA，美国)可用于感染昆虫细胞，使其分泌糖基化的和二硫键键合的产物。

本发明的融合多肽通常是糖蛋白，尤其是在哺乳动物细胞中表达时。本发明包括任何糖基化或二硫桥形式的融合多肽。特别是，突变分析表明，IgE受体α链N-端连接的糖基化位点的第一、二和第七位置的N-端连接的糖基化(A.Shimizu等人，美国国家科学院院报85[1988]1907-1911，图2)(对应于SEQ.ID.NO.1的氨基酸残基46、67和191)提高了包含它的IgE^R分子和单体和二聚体的生物学活性。最优选的表达系统是，其中任何添加的糖与衍生该多肽的天然分子中的糖最相似。已知酵母和昆虫细胞修饰糖蛋白不同于哺乳动物细胞，而大肠杆菌分泌后不添加糖分子。因此，从这些表达系统的任一个中表达可产生用于诊断的蛋白产物，(例如，检测变应性疾病)，用于表达此产物以用作治疗分子的最优选的形式是在哺乳动物细胞中表达或可能在转基因哺乳动物的奶中表达。

为在哺乳动物宿主表达，用在表达盒中的转录和翻译调控信号可由病毒来源衍生而来，如腺病毒、牛乳头瘤病毒或猴病毒，其中调控信号与高水平表达的特定基因相关联。合适的转录和翻译调控序列也可从哺乳动物基因获得，如肌动蛋白、胶原、肌球蛋白和金属硫蛋白基因。转录调控序列包括足以引导哺乳动物细胞中RNA合成起始的启动子区。典型的哺乳动物细胞的例子是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SV40转化的猴肾细胞(COS)、Hela、BHK、NIH瑞士鼠胚胎细胞、大鼠、猴或人成纤维细胞、或大鼠肝瘤细胞。

为在哺乳动物细胞中表达，优选的方法是从CHO细胞中分泌。CHO和人细胞都未添加α1，3-连接的半乳糖残基，它是在鼠细胞如C127和SP2/0细胞中表达的象征。该糖键的抗体出现于人血清中[C.F.Goochee等人，《生物技术学》(BioTechnol)9[1991]1347-1355]，并可影响从这些鼠细胞表达的重组产物的半寿期、可及性及清除。CHO、dhfr细胞是二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变体，因此不能从头合成嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷和氨基乙酸。带有DHFR基因野生型拷贝的染色体整合质粒可用如下方法增加或扩增其拷贝数，将这些质粒所转化的细胞暴露于增长水平的氨甲喋呤，它是一种与结合在酶活性位点的叶酸竞争的叶酸类似物。pMT2是一个在CHO、dhfr细胞中表达的合适的载体(R.J.Kaufman等人，《欧洲分子生物学会杂志》(EMBO J.)6[1987]187-193)。pMT2载体有DHFR基因的野生型拷贝，此基因与外源基因一起转录为单链mRNA。因此，用提高浓度的氨甲喋呤处理转化的CHO、dhfr细胞后，外源基因和DHFR基因均共扩增。在哺乳动物模型中这些细胞分泌的产物预计是二硫键键合的和糖基化的。

可用不同技术将表达载体引入宿主细胞，包括磷酸钙转染、脂质体介导转染、电穿孔及类似方法。优选的，选择和增殖其中表达载体被稳定地整合于宿主细胞基因组中产生稳定的转化体的转染细胞。细胞可在如DMEM培养基中培养。用如抗生素抗性选择后建立稳定的细胞系或转化细胞后，瞬时表达24-72小时，然后可用标准的生化方法回收分泌至培养液中的多肽。

从培养液中回收表达的多肽的常规方法包括，应用周知的生化技术分级分离培养液中的含多肽部份。例如，凝胶过滤、凝胶层析、超滤、电泳、离子交换或亲和层析等方法，如已知可用于蛋白分级分离、可用于分离培养液中的表达蛋白的方法。另外，也可应用常规的免疫化学方法，如免疫亲和或免疫吸附。转化、培养、扩增、筛选及产物生产和纯化等方法也已众所周知(见J.Sambrook等人[1989]出处同前；R.J.Kanfman遗传工程：原理和方法Plenum出版社，vol.9，[1987]，156-198)。

本发明的融合多肽显示可应用于治疗患变态反应的哺乳类尤其是人类患者。融合多肽的IgE-结合结构域与肥大细胞、嗜碱性粒细胞及朗罕氏细胞上天然存在的IgE受体竞争IgE，使IgE与施用的蛋白结合，而不能结合这些变态反应效应细胞以调节变应性应答。IgE-结合结构域也通过结合FcεRI的自身抗体而与IgE受体FcεRI竞争。

因此本发明提供了一种药物组合物，它用于竞争性结合IgE(和/或FcεRI的自身抗体)，和/或抑制IgE的产生，以及由此抑制性地和/或预防性地治疗IgE或IgE受体-介导的疾病，更特别的是变态反应以及与变态反应相关的疾病，如特应性皮炎、变应性哮喘和慢性荨麻疹。

＂IgE-或IgE受体-介导的疾病＂意思是与细胞所结合的IgE受体FcεRI结合IgE或结合FcεRI的自身抗体相关的疾病，例如典型的变应性反应(＂超-IgE综合征＂)如支气管哮喘、变应性哮喘、枯草热、花粉变态反应、变应性鼻炎、特应性皮炎、湿疹、过敏症，以及慢性荨麻疹、非变应性Kimura′s病、和其它的肺部、皮肤或自身免疫疾病。

特别是特应性皮炎(特应性的一种最生动的表现)，是一种与血清高IgE水平及不同环境变应原致敏相关的慢性炎性皮肤病(M.-A.Morren等人，《美国学院皮肤学杂志》(J.Am.Acad.Dermatol.)31[1994]467-473)。当前对特应性皮炎的治疗集中于应用含类固醇的药膏，并且其严重病例已被环孢素A成功地治疗(H.Granlund等人，《英国皮肤学杂志》(Br.J.Dermatol.)132[1995]106-112)，但副作用使这种治疗局限于少数患者。一种抑制IgE的功能如肥大细胞脱粒和IgE介导的B细胞及其它抗原提呈细胞提呈抗原的试剂，优越于现知的任何对特应性皮炎的治疗，并且它也用于其它轻微形式的变态反应。

除特应性皮炎和变应性哮喘外，本发明的多肽可用于治疗或预防慢性荨麻疹(CU)，通过激活FcεRIα使肥大细胞脱粒在其中起了作用。与另外的准备用于治疗此病的抗-IgE单克隆抗体相比，本发明的融合多肽可清除抗FcεRIα的循环自身抗体。

多肽能以包含本发明的多肽的药物组合物的形式施用，优选的是在药物可接受的载体或稀释液中的未修饰的多肽或其药学可接受的盐。

名词＂盐＂尤其指药学可接受的盐，它从药学可接受的、无毒的酸中制备，形成如多肽链氨基基团的酸性加成盐，或从药学可接受的、无毒的碱中制备，形成如多肽链羧基基团的碱性加成盐。这些盐能以内盐和/或以本发明的多肽的氨基或羧酸末端盐的形式形成。

合适的药学可接受的酸性加成盐是药学可接受的、无毒的有机酸、聚合酸或无机酸的盐。合适的有机酸的实例包括乙酸、抗坏血酸、苯甲酸、苯磺酸、柠檬酸、乙烷磺酸、延胡索酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、异硫脲酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、粘酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、水杨酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和对甲苯磺酸，以及聚合酸，如鞣酸或羧甲基纤维素。合适的无机酸包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。

用于形成羧基基团的盐的合适的无机碱包括：碱性金属盐如钠盐、钾盐和锂盐；碱性土盐如钙盐、钡盐和镁盐；以及铵盐、铜盐、亚铁盐、高铁盐、锌盐、亚锰盐、铝盐和锰盐。优选的是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。适于形成羧基基团盐的药学可接受的有机碱包括有机胺，如三甲胺、三乙胺、三(正-丙)胺、双环己胺、β-(二甲氨基)乙醇、三(羟甲基)氨基甲烷、三乙醇胺、β-(二乙氨基)乙醇、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、N-乙基哌啶、哈胺青霉素G、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、吡啶、咖啡因和普鲁卡因。

多肽的酸性加成盐可按常规方法制备，用一种或几种期望的有机或无机酸如盐酸的等同物接触多肽。常规制备肽的羧基基团盐的方法是将肽与一种或几种期望的碱如氢氧化金属碱如氢氧化钠；碳酸化或碳酸氢化碱金属，如碳酸钠或碳酸氢钠；或胺碱如三乙胺或三乙醇胺接触。

本发明也涉及包含以上定义的新的融合多肽或其药学可接受的盐的药物组合物，及药学可接受的载体或稀释剂。优选的载体是无菌的、不含致热原的、可非肠道使用的液体。水、生理盐水、葡萄糖水溶液和乙二醇是优选的液态载体或稀释剂，尤其是用作注射液(当等渗时)。组合物可以是常规制备的冷冻干燥物。

此组合物可系统地施用，即非肠道(如肌肉内、静脉内、皮下或真皮内)或腹膜内施用。用于非肠道施用，优选的是融合多肽在患者血清或血浆中基本可溶，如，至少1毫克多肽可溶于1毫升血清或血浆中。

这些组合物也可用已知的方法局部施用。合适的用药形式包括喷雾、眼溶液、鼻溶液和软膏。例如，喷雾可按如下操作：在合适的溶剂中溶解肽，将其放入喷雾器中，以气溶胶的形式用于普通的吸入治疗。眼或鼻液可按如下操作：在蒸馏水中溶解活性成分，加入需要的任何辅助剂，如缓冲液、等渗液、增稠剂、保存剂、稳定剂、表面活性剂或防腐剂，调节混合物至pH4到9。软膏可如下获得，如从聚合物溶液中制备组分，如2％聚乙烯酸溶液，以及碱，如2％氢氧化钠，混合成凝胶，并在胶中混入一定数量的纯化融合多肽。

组合物的施用优选的以皮下或静脉内方式，最典型的是皮下方式。

本发明也包括治疗变应性疾病的方法，其包括对需要此种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的融合多肽或其药学可接受的盐。治疗方法在变应性疾病病程中实行(即当特别需要解除症状时)；或作为连续的或预防性的治疗(即在预期的IgE或IgE受体-介导的疾病如变应性反应发作之前)。

考虑到如所治疗的疾病的程度或严重性、患者年龄、性别以及患者的状况、治疗的长短、特定融合蛋白的效力、常规方法可测定的因素，有效剂量有很广的变化范围。

患者IgE的(以及FcεRI的抗体)个体含量变化很大，因此最好把治疗有效的剂量描述为血清IgE和FcεRI抗体总量的5×10²倍至1×10⁴倍之间，以摩尔数表示。治疗患者可以每天单次或多次施用。组合物也可每月施用(或合适的以每周间隔)，也以单次或多次施用。

对于普通的患者(70kg)，合适的每月剂量可从较低的剂量每月大约0.5mg到较高剂量每月大约500mg的本发明的融合多肽(如实施例7的二聚体)，优选的是从每月大约1mg到约300mg。更优选的是从每月大约20mg到大约250mg，可方便地以分为每月一次或两次的剂量施用。较高的剂量范围，如每月500mg到每月2g，可用于具有高血清IgE浓度或处于早期治疗阶段的患者。

施用的剂量和时间可以是不同的。开始时可用以上范围内的较高剂量施用本组合物，并且比疾病治疗后期施用更频繁。合适的剂量可通过测定如上表示的患者血清中IgE和FcεRI抗体的浓度来确定。例如，在疾病病程早期，本发明的融合多肽，如实施例7的二聚体，可按200-500mg多肽的每周剂量施用于普通患者(70kg)。血清IgE和FcεRI抗体清除后，治疗方案可减为每周治疗或每几周治疗，剂量为每次治疗50μg到100mg多肽。

本发明的组合物可以单独使用也可与本发明的其它化合物或进一步与药物试剂如抗组胺或皮质类固醇联合使用。

本发明也包括将本发明的融合多肽用于任何标准形式的体外诊断测定，如ELISA，以测定获自病人(如慢性荨麻诊患者)的生物样品如血或组织样品中的IgE或FcεRI自身抗体水平。在ELISA测定中HSA成分使IgE或FcεRI自身抗体与FcεRI的结合和检测更容易。样品中IgE或自身抗体的数量可用于测定患者对其接触的物质的变应性应答。也可检测IgE或自身抗体水平以测定抗变态反应治疗的效率，并用于监测一定时间患者的变应性状态。

本发明进一步包括对人应用编码本发明的融合多肽的多核苷酸来治疗IgE或IgE受体-介导疾病的基因治疗方法。基因治疗方法包括通过引入编码本发明的融合多肽的多核苷酸来修饰患者细胞以及从这些细胞中表达多肽。例如，可首先从患者中除去体细胞，然后在培养中通过插入多核苷酸进行遗传修饰，所得修饰后的细胞重新引入患者，由此使患者细胞表达本发明的多肽。

另外，可在体内通过直接插入编码该多肽的载体DNA修饰细胞。

用于修饰的合适细胞包括内皮细胞或白细胞。用于基因治疗时，本发明的多核苷酸优选的位于可调控的(如可诱导的)启动子的控制下。应用已知的可调控的启动子系统，可使多肽的表达依赖于患者与外源因素的接触。

本发明也包括应用基因治疗的方法制备非人的体细胞重组体或转基因动物以表达本发明的融合多肽，如表达至奶中。这些修饰过的非人的动物也构成了本发明的一部分。有用的动物的实例包括小鼠、大鼠、兔、猪、绵羊、山羊和牛，它们都已被应用标准技术制成转基因动物(如D.R.Hurwitz等人，《转基因研究》(Transgenic Research)3[1994]365-375)。这些动物可用于模型目的或蛋白质的实际生产。尤其是，本发明涉及表达本发明的融合多肽的转基因鼠、山羊、牛或猪。制备这些动物的方法众所周知。编码本发明的融合蛋白的多核苷酸可在体外或体内引入动物的体细胞，以产生遗传修饰了的、但不能将遗传修饰传给后代的体细胞重组动物。另外，多核苷酸可被插入胚胎细胞，以产生能将表达本发明的蛋白质的能力传给后代的转基因动物。

用于基因治疗的细胞转染可用常规方法完成，如电穿孔、磷酸钙沉淀、以脂质转染试剂为基础的方法、肌内注射、显微注射或使用“基因枪”。以质粒为基础的载体优选的包括一种标记如新霉素基因，以在真核细胞中用细胞毒氨基糖苷G418选择稳定的转染子。

实现感染的方法是将融合多肽的基因序列掺入逆转录病毒载体中。本领域中已知很多这种掺入的方法。其中一个广泛应用的方法是，使用缺陷鼠逆转录病毒包装逆转录病毒，以及使用两亲的包装细胞系制备用于感染靶供体细胞的感染两亲病毒。

进一步的描述如下实现：血清半寿期的体内测定：总步骤：

将用不含Ca²⁺、Mg²⁺的无菌PBS稀释的测试蛋白静脉注射入重约25g的雌性SKH1/hr/hr Charles River鼠。将这些鼠分为如下三组：

—组(i)接受130μg(1nmole)融合多肽，如实施例7制备的二聚体IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R，或

—组(ii)接受60μg IgE^R(2nmole)，或

—组(iii)接受65μg HSAI(1nmole)。

每只鼠于注射后10分钟、30分钟、3小时、6小时和12小时取血100μl。离心制备血清。各种蛋白质的血清浓度水平的测定方法是：(a)IgE受体ELISA结合测定；(b)抑制ELISA；或(c)HSA夹心ELISA，如下：a)IgE^R ELISA结合测定

IgE血清浓度的测定方法是用以下的夹心ELISA检测IgE结合：200ng人IgE固定于含100μl包被缓冲液的COSTAR 8孔条形板中(Cambridge，MA，美国)，4℃湿盒中过夜。每孔用300μl不含Ca²⁺、Mg²⁺、pH7.2的PBS洗两次。板用200μl含5％BSA(Sigma)无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS于室温封闭一小时。用300μl含0.05％吐温20、无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS(PBST)洗两次后，加入用100μl 1∶10稀释(于不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS中)的鼠血清稀释样品，室温温育一小时。

用300μl PBS洗孔两次，用100μl(1ng)抗人IgE受体的单克隆抗体如5H5/F8室温温育一小时。再用300μl PBST洗孔两次，用100μl山羊抗鼠IgG-HRP(Biorad，用不含Ca²⁺、Mg²⁺的PBS 1∶2000稀释)室温温育一小时。用300μl PBST洗板三次，用100μl ABTS(Biorad)底物检测辣根过氧化酶结合物。5分钟后用100μl 3％草酸中止反应。用EASY READER光度计测定405nm的颜色强度。b)抑制ELISA

100ng FcεRIα固定于含100μl包被缓冲液(0.1MNaHCO₃，0.01％NaN₃ pH9.6)的Nunc 96孔免疫板(F96 cert.Maxisorb)，湿盒4℃过夜。每孔用300μl PBS，0.05％吐温20(冲洗缓冲液)洗4次。向不同孔及阴性对照中(50μl 1∶25稀释于PBS，0.05％吐温20，2％FCS中的鼠血清)，加入系列稀释的样品或系列稀释的融合多肽标准，如IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R标准(从400ng/ml稀释至1.6ng/ml)。标准和样品稀释于鼠血清中，此血清是以1∶25稀释于PBS，0.05％吐温20，2％FCS中的。随后立即加入50μl溶于稀释缓冲液的400ng/μl人IgE-生物素偶联物混匀。温育混合物中鼠血清的最终稀释度为1∶50。

37℃温育2小时后，用300μl冲洗缓冲液洗板4次，加入50μl以1∶1000稀释于稀释缓冲液中的链亲和素-碱性磷酸酶偶联物(Gibco)，37℃温育一小时。300μl冲洗缓冲液洗板4次，加入100μl底物(1mg/ml对硝基苯磷酸于二乙醇胺缓冲液，pH9.8中[BIORAD])，37℃温育30分钟后用50μl的2M NaOH中止反应。用BIOMEK-1000工作站光度计测定405nm的光密度。应用Beckman IMMUNOFIT ELISA评价程序从标准曲线(4-参数逻辑曲线拟合)进行定量估计。计算：

结合百分数＝[OD(样品或标准值)/OD(缓冲液值)]×100c)HSA夹心ELISA

500ng单克隆抗-鼠HSA(HSA-9)固定于含100μl包被缓冲液(0.1MNaHCO₃，0.01％NaN₃ pH9.6)的Nunc 96孔免疫板(F96 cert.Maxisorb)，湿盒4℃过夜。每孔用300μl冲洗缓冲液(PBS，0.05％吐温20)洗4次。加入作为阴性对照的100μl 1∶100稀释的鼠血清(PBS，0.05％吐温20，2％FCS＝稀释缓冲液)，或加入100μl标准(1μg/ml-2ng/ml人血清白蛋白，KABI)，或100μl稀释于1∶100稀释的鼠血清中的样品。37℃温育2小时后，用300μl冲洗缓冲液洗板4次，加入100μl以稀释缓冲液稀释的1ng/μl兔抗-HSA-生物素偶联物，抗-HSA-生物素偶联物用CH-Seph4B-HSA免疫亲和层析纯化，与鼠血清的交叉反应性用鼠血清-琼脂糖免疫吸附去除。37℃温育2小时后，用300μl冲洗缓冲液洗板4次，加入50μl以1∶1000稀释于稀释缓冲液中的链亲和素-碱性磷酸酶偶联物(Gibco)，37℃温育一小时。300μl冲洗缓冲液洗板4次，加入100μl底物(1mg/ml对硝基苯磷酸于二乙醇胺缓冲液，pH9.8中[BIORAD])，37℃温育15分钟后用50μl 2M NaOH中止反应。用BIOMEK-1000工作站光度计测定405nm的光密度。应用Beckman IMMUNOFIT ELISA评价程序从标准曲线(4-参数逻辑曲线拟合)进行定量估计。结果：

图1(A)和(B)显示了二聚体融合多肽IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R、游离IgE^R(称为“游离α链”)或HSAI(称为“HSA”)的浓度，作为注射后消除时间的函数，单位是pmole/ml血清。

图1(B)显示游离受体仅可在施用后约10分钟时在鼠血清中检测到，而二聚体融合多肽在施用后约12小时仍可检测到。

图1(C)显示HSA和二聚体融合多肽的相对清除动力学。在头10分钟的组织-血分布稳定后，二聚体和HSA显示几乎相同的清除曲线。这确证了IgE-结合结构域的血清半寿期可通过与HSA融合而大大延长。鼠中被动皮肤过敏反应(PCA)的抑制总步骤：(a)多肽的施用：

将融合多肽如实施例7中从CHO细胞获得的IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R系列稀释为10、50或500μg/kg，在致敏前以不同间隔静脉注射入重约25g的雌性SKH1/hr/hr Charles River鼠。

根据致敏前注射的多肽的量(即10、50或500μg/kg)，建立三组鼠。第四组的对照鼠静脉内接受200μg/kg PBS代替多肽。四组鼠每组分为三个亚组，根据静脉注射化合物与用IgE皮内致敏[下面的步骤(b)]的间隔划分。检测间隔为：5分钟、15分钟和30分钟。(b)皮内致敏：

将小鼠麻醉，4次皮内注射致敏背部皮肤，每次注射溶于10mlPBS的5ng单克隆鼠抗二硝基苯(DNP)IgE抗体(BioMakor，Rehovot，以色列)。对照组中，在同一部位皮内注射盐水。(c)变应原攻击：

致敏后90分钟，再次麻醉小鼠，且通过静脉注射含有50μg的二硝基苯-牛血清白蛋白(DNP-BSA)(Calbiochem-Behring，San Diego，美国)含1％伊凡斯蓝的溶液攻击小鼠。通过测量外渗引起的染色测试点的直径来对PCA应答定量。结果：

在图2的条形图中描述了实施例7的成熟融合多肽(SEQ.ID.NO.3的氨基酸VaL₂-Leu₉₇₈)。浓度500μg/kg时，二聚体融合多肽在应用的所有时段均完全阻断了PCA。50μg/kg时，攻击前30分钟处理使统计学上显著减少了36％。攻击前15分钟处理，施用10和50μg/kg二聚体都可看到趋势。因此，二聚体融合多肽对防止PCA是有效的。

进行本发明的方法和技术在本领域中是已知的。在此未特别描述其制备方法，使用的化合物、试剂、载体、细胞系等都是已知的和易获得的，或可以通过常规方法从已知的和易获得的材料中获得，或者等同的材料可用常规方法从已知的和易获得的材料中制备。

以下的非限制的实施例说明了本发明。所有的温度都为摄氏度。材料与方法PCR扩增：

从头化学合成本发明的引物可使用任何合适的方法进行，如磷酸三酯或磷酸二酯法。

扩增特定核酸序列的方法和系统在美国专利4′683′195和美国专利4′683′202中以及H.A.Erlich等人编、冷泉港实验室出版社出版[1989]的《聚合酶链式反应》中有描述。

PCR后，使用QiaEx方案(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA，美国)切割和纯化DNA片段，然后亚克隆入TA载体[TA Cloning试剂盒(Invitrogen)(产品目录，版本2.2)]。用于产生PCR扩增核酸的引物列于图8中。应用测序酶方法(USB，Cleveland，OH，美国)对DNA测序。质粒与试剂：

FcεRIαcDNA克隆，pGEM-3-110B-1(A.Shimizu等人，美国国家科学院院报85[1988]1907-1911)从美国典型培养物保藏中心(ATCC原种#67566)获得。单链人肝cDNA从Clontech(PCR-准备的快速克隆cDNA，目录D#7117-1)获得。HSA序列从GenBank保藏号#s VOO495、JOOO78、LOO132和LOO133下得到。限制酶从Boehringer-Mannheim或Gibco/BRL获得。Taq DNA聚合酶从Perkin-Elmer Cetus(PECI)或Boehringer-Mannheim获得。SK载体从Stratagene获得。

pHIL-D2从Invitrogen(San Diego，CA，美国；目录号K1710-01[1994])得到(见“毕赤氏酵母表达试剂盒-蛋白表达-在巴斯德毕赤氏酵母中表达重组蛋白的方法手册-版本3.0”[1994年12月])(此后称“Invitrogen手册”)。

载体pXMT3由pMT2(Sambrook等人编[1989]出处同前)衍生而来，方法是将pUC8(Pharmacia)的PstI到EcoRI的接头克隆至pMT2的PstI和EcoRI位点(R.J.Kaufman等人[1987]出处同前)。

以下使用的标准技术在Sambrook等人(编写)[1989](出处同前)中有描述。实施例A：TA克隆载体

质粒pCR₂分别与实施例1和2中获得的PCR扩增产物连接。应用T4DNA连接酶在以下反应混合物中进行连接反应：25mM Tris-HCl(pH7.8)10mM MgCL₂1mM DTT1mM ATP50ng载体DNA100-200ng PCR反应产物(未纯化)4单位T4DNA连接酶(New England Biolabs)

转化入感受态细胞之前，每一反应混合物均于15度保存18小时。实施例1：PCR扩增和FcεRIαcDNA的克隆

使用Qiagen方法从pGEM-3-110B-1中纯化FcεRIαcDNA。然后：

(A)为制备HSA-前导构建体，FcεRIαcDNA的PCR扩增用寡核苷酸#18和#19(图4、图8)在以下反应混合物中进行：1μl(50ng)的FcεRIαcDNA每个50pmole的寡核苷酸#18和#195μl 10XPCR缓冲液(PECI)0.5μl 20mM dNTP贮存液＝200μM终dNTPs浓度0.5μl(2.5U)Taq DNA聚合酶(PECI)加水至50μl。

反应混合物以矿物油覆盖以防止蒸发，在Perkin Elmer Cetus DNA 480型热循环仪中进行热循环。反应的循环条件是：95度加热5分钟，然后进行30个循环的94度1.5分钟，53度2分钟，72度3分钟的循环，随后于72度延伸三分钟，并于4度浸泡过夜。

随后的电泳中，～550bp的扩增产物被溴化乙锭染色证实。将片段亚克隆入PCR₂载体以产生编码IgE^R的pEK1(图4、图8B)。

(B)为制备IgE-前导构建体，FcεRIαcDNA的PCR扩增除使用寡核苷酸#20和#31以外(图8B)根据以上的步骤(A)进行。随后进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，～600bp的扩增产物被溴化乙锭染色证实。将片段亚克隆入PCR₂载体以形成编码前-IgE^R的IgE^R/TA#1(图4)。

(C)为制备编码前-IgE^R的构建体以表达成熟、截短的蛋白用作测定中的对照，FcεRIαcDNA的PCR扩增如上述(A)使用寡核苷酸#20和#19进行(图8B)。随后电泳，～620bp的扩增产物被溴化乙锭染色证实。将PCR片段切割，并亚克隆入PCRII载体以提供IgE^RFL/TA#34，它编码前-IgE^R，跟随着终止密码子(图4)。实施例2：PCR扩增和人血清白蛋白cDNA的克隆

为获得编码前原-HSAII的序列，在实施例1(A)的总步骤之后，使用寡核苷酸#24和#25进行全长人血清白蛋白cDNA的PCR扩增(图8B)。获得的克隆HSA/TA#1与GenBank中的序列最相似。此克隆中，检测到七个摆动位置中的突变和一个导致1333位碱基从赖氨酸变为谷氨酸的突变。七个摆动位置中的突变是：碱基309：A变为T；碱基744：A变为G；碱基795：G变为A；碱基951：G变为A；碱基1320：C变为T；碱基1569：A变为C；碱基1584：G变为A(参考HSA/TA#1)。用图8A中显示的寡核苷酸进行定点诱变以及使用Bio-Rad诱变噬菌粒体外诱变试剂盒(BioRad，Cat#170-3581)，将赖氨酸到谷氨酸的突变修正回GenBank的序列。此方法依赖于尿嘧啶残基掺入亲本链和随后它在诱变链中的去除(T.A.Kunkel，《美国国家科学院院报》(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)82[1985]488-492)。因为摆动位置的点突变不改变所编码的蛋白的天然氨基酸序列，所以以上七个突变未予修正。随后电泳，～1.8Kb的扩增产物被溴化乙锭染色证实。

将1.8Kb的产物亚克隆入pCR₂载体形成HSA/TA mut#16，由DNA测序证实它包含完全的前原-HSAII序列。HSA/TA mut#16作为SpeI、HindIII片段被亚克隆入Bluescript SK，产生HSA/SK#17(图5)。

(A)为制备HSA-前导构建体，HSA/SK#17用MstII和HindIII消化以去除编码3′端氨基酸(Leu₆₀₉)的核苷酸序列；将如上定义的编码接头L₂的寡核苷酸引入线性化的HSA/SK#17的3′端，方法是激酶处理寡核苷酸#28和#29(图8B)和退火以及将这些片段连接入线性化的HSA/SK#17的MstII/HindIII位点，产生编码与L₂融合的前原-HSAII的pEK7(图8B)。小量制备的DNA通过BamHI消化和测序核对。

(B)为制备IgE-前导构建体，用寡核苷酸#26和#27通过PCR扩增编码前原-HSAII的HSA/SK#17(图5，8)。寡核苷酸#26从HSA中去除前原序列，并在HSA的5′端添加编码L₁的寡核苷酸。寡核苷酸#27结束于天然发生的、唯一的NcoI位点，大约在HSA编码序列的核苷酸位置800处。根据实施例1(A)中的步骤进行PCR扩增。通过凝胶电泳和Qia分离大约800bp的片段，将其亚克隆入pCR₂载体以提供克隆HSA Nco/TA#13，通过DNA测序证实其序列。此克隆的NcoI到NotI片段被亚克隆入NcoI和NotI酶切的HSA/SK#17 DNA，产生HSA/SK#5(图5)，它编码连接于编码HSAII的cDNA5′-端的L₁。

(C)为表达单独的HSA，应用以上制备的HSA/SK#17构建体。实施例3：编码前原-HSA+接头+IgE^R的融合构建体HSA-IgE^R/SK#22

用BamHI和SalI消化pEK7(包含前原-HSAII cDNA+L₂的寡核苷酸)和pEK1(包含IgE^R)。从pEK7获得的1.8Kb片段用磷酸酶处理，然后与从pEK1获得的550Kb片段相连接。制备了一个阳性的小量制备的#23，但被另一种未知的质粒污染，它阻止了HSA-IgE^R带的回收。因此，从小量制备的#23中纯化包含HSA-IgE^R融合体的2.4Kb的SpeI至SalI片段，以及包含载体DNA的2.9Kb片段，并将其连接在一起，产生克隆HSA-IgE/SK#49(图9)[发现载体位点从亚克隆区的任一端丢失，于是将HSA-IgE/SK#49的2.4Kb的SpeI至SalI片段亚克隆入SpeI加SalI酶切的Bluescript SK，产生HSA-IgE/SK#22(图中未显示)]。

HSA和接头与IgE受体DNA连接体的序列以及与载体DNA融合体末端的序列经DNA测序分析证实与HSA-IgE/SK#22中预料的一致。实施例4：编码IgE^R+前原-HSAII的融合构建体IgE-HSA/SK#1

HSA/SK#5和IgE^R/TA#1用SstI和NheI消化。IgE/TA#1的600bp片段用凝胶电泳纯化，并连接入酶切和磷酸酶处理的HSA/SK#5，产生克隆IgE-HSA/SK#1(图10)。实施例5：编码前-IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R的融合构建体R-H-R/SK#50

IgE^R-HSA/SK#1和HSA-IgE^R/SK#49的HSA区唯一的PstI位点，被用于通过L₂的寡核苷酸连接IgE^R和前原-HSAII。用PstI和SalI消化HSA/IgE^R/SK#49和Bluescript SK。包含HSAII3′部分的1.2Kb片段、接头和IgE^R序列被连接至PstI加SalI酶切的Bluescript DNA，产生HSA-IgE^R Pst Sal/SK#37(图11)，它用PstI和KpnI消化，制备出1.2Kb片段。

IgE^R-HSA/SK#1 DNA用PstI和KpnI消化，分离出包含载体、IgE^R、接头和HSA5′半段的4.8Kb片段，磷酸酶处理，连接至HSA-IgE^R Pst Sal/SK#37的1.2Kb片段。获得最终的二聚体结构R-H-R/SK#50(图11)  。实施例6：经转染HSAII-L₂-IgE>R单体融合多肽和巴斯德毕赤氏酵母的培养

通过用EcoRI酶切质粒HSA/SK#49及分离编码融合蛋白的2.4Kb片段，制备编码HSAII-L₂-IgE^R的质粒MB#2。用EcoRI消化质粒pHIL-D2及碱性磷酸酶处理后，将此片段连接至巴斯德毕赤氏酵母表达载体pHIL-D2(Invitrogen)的唯一EcoRI位点。产生的MB#2质粒用NotI消化使其线性化，并转化入his4 GS115细胞，如“Invitrogen手册”中所描述。在甲醇上生长筛选His+转化子。按“Invitrogen手册”的说明，在甲醇上显示缓慢生长的菌株在“Invitrogen手册”特定的基本甘油培养基中生长至稳定期，离心转移至缓冲的复合甲醇培养基生长4天。ELISA测定细胞上清中HSA的存在和IgE-结合能力。从巴斯德毕赤氏酵母分泌获得的产物的IgE-结合能力在摩尔基础上相当于HSA浓度和完全的生物学活性。实施例7：经转染IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R二聚体融合多肽和CHO细胞的培养

通过用EcoRI消化R-H-R/SK#50(见实施例5)并分离编码二聚体融合多肽的3Kb的EcoRI片段，制备质粒pXMT3-RIα-HSA-RIα(包含编码前-IgE^R-L₁-HSAII-L₂-IgE^R的SEQ.ID.NO.4的多核苷酸)。用EcoRI消化pXMT3和碱性磷酸酶处理后，将此片段连接至pXMT3的唯一的EcoRI位点。

质粒转染至CHO DUKX B11细胞。此细胞缺少核苷合成所需要的功能性的dhfr-基因(二氢叶酸还原酶)。因此，细胞保存于含10％胎牛血清(FCS)的α+培养基中(含核糖核苷和脱氧核糖核苷的MEMα培养基/Gibco)。为用于转染，细胞在无Ca⁺⁺-Mg⁺⁺的PBS(CMF-PBS)中洗两次，在CMF-PBS中细胞浓度调节为2×10⁶细胞/ml。将0.8ml细胞悬液加入15μg质粒DNA。使用BIORAD基因脉冲发生器(电压＝100V；电容＝25μF)用电穿孔法进行转染。转染后细胞在15ml含10％FCS的α+培养基中培养3天。

位于pXMT3质粒上的Dhfr-基因允许在去除核苷的培养基中选择重组细胞。转染后3天将细胞置于含10％透析过的胎牛血清(FCSD)的α-培养基中(不含核糖核苷和脱氧核糖核苷的MEMα培养基/Gibco)。培养两周后，可见重组细胞集落。在开始基因扩增之前，将细胞保存于含10％FCSD的α-培养基中再传代4次。

在氨甲喋呤(MTX)存在下扩增dhfr和与其相连的基因，导致转基因表达的增加。因此，在去除核苷的培养基中选择重组细胞之后，跟着在存在20nM MTX的含10％FCSD的α-培养基中培养。通过逐步增加氨甲喋呤至100nM和500nM MTX进行进一步扩增。

以9×10³/cm²的密度在含10％FCS(GIBCO)的α-培养基中接种库(pool)T1/3-500nM至滚瓶，产生蛋白。接种5天后收集第一次上清，随后转为无血清的α-。3天后第二次收集，产生总共1升上清液用于纯化。

第二批从由适于无血清生长条件的库T1/3-500nM衍生来的2升上清液中纯化。细胞以5×10⁴细胞/ml浓度接种，接种6天后收集上清液。实施例8：融合蛋白的纯化通过固定抗-FcεRI单克隆抗体(如5H5-F8；鼠IgG1)的免疫亲和层析纯化实施例7的培养上清液，根据标准技术制备和纯化：

a)层析支持体的制备：

根据生产商说明以10mg抗体/ml凝胶的密度将单克隆抗体偶联至CN Br-活化的Sepharose 4B(Pharmacia，Uppsala，瑞典)。随后用乙醇胺封闭过量的反应基团，树脂保存于补充了0.02％NaN₃的PBS中直到使用。

b)亲和层析：

澄清的培养上清液加于5ml用PBS以0.5ml/分钟流速平衡过的抗体柱中。用50mM柠檬酸，140mM NaCl，pH2.70洗脱吸附的材料。包含组分的蛋白立即调节至pH7.0(NaOH)，随后无菌过滤。

c)定量/表征：

用在30mM(3-[N-吗啉代]丙)磺酸(MOPS)，pH7.0中的天然构象以及其变性形式(6M盐酸胍)的280nm的吸光度，测定二聚体融合多肽的浓度。使用以表列出的色氨酸、酪氨酸和胱氨酸残基在模型化合物中的吸光系数，并修正折叠和非折叠蛋白间光密度的差异，从这些氨基酸残基的数量计算相应的摩尔吸光系数。融合蛋白包括17个色氨酸、40个酪氨酸和21个胱氨酸，这导致其理论消光系数为150840M^-1cm^-1。用标准SDS-PAGE和N-端自动化气相Edman降解测序和质谱法估计纯化材料的质量。SDS-PAGE(图15)中，多肽以大约140kDa的表观分子量迁移，反映大约28％糖基化(未糖基化的理论分子量：108′863.61Da)。

             序列表(1)一般信息  (i)申请人：

(A)姓名：NOVATISAG

(B)街道：Scharzwaldallee 215

(C)城市：Basle

(E)国家：瑞士

(F)邮政编码(ZIP)：CH-4058

(G)电话：61 324 5269

(H)传真：61 322 7532  (ii)发明名称：融合多肽  (iii)序列数目：6  (iv)计算机可读信息：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)  (v)当前申请数据：

(A)申请号：WO PCT/EP97/....  (vi)在先申请数据：

(A)申请号：US 08/690216

(B)递交日：1996年7月26日(2)SEQ ID NO：1的信息：  (i)序列特征：

(A)长度：257个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性  (ii)分子类型：蛋白质  (iii)假设：非  (iii)反义：非  (v)片段类型：内部  (xi)SEQ ID NO：1的序列描述：Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu1               5                   10                  15Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val

        20                  25                  30Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr

    35                  40                  45Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp

50              55                       60Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile65                  70                  75                  80Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln

            85                  90                  95Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp

        100                 105                 110Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu

    115                 120                 125Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile

130                 135                 140Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn145                 150                 155                 160Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys

            165                 170                 175Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile

        180                 185                 190Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Phe Phe Ile

    195                 200                 205Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Phe Ile

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(A)长度：609个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性  (ii)分子类型：蛋白质  (iii)假设：非  (iii)反义：非  (v)片段类型：内部(xi)SEQ ID NO：2的序列描述：Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala1               5                   10                  15Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

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    595                 600                 605Leu609(2)SEQ ID NO：3的信息：  (i)序列特征：

(A)长度：978个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性  (ii)分子类型：蛋白质  (iii)假设：非  (iii)反义：非  (v)片段类型：内部(xi)SEQ ID NO：3的序列描述：Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu1               5                   10                  15Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val

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        100                 105                 110Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu

    115                 120                 125Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile

130                 135                 140Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn145                 150                 155                 160Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys

            165                 170                 175Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile

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    195                 200                 205Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp

210                 215                 220Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln225                 230                 235                 240Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

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            965                 970                 975Trp Leu

978(2)SEQ ID NO：4的信息：  (i)序列特征：

(A)长度：2955个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑类型：线性  (ii)分子类型：DNA  (iii)假设：非  (iii)反义：非  (v)片段类型：内部(xi)SEQ ID NO：4的序列描述：GAATTCACCA TGGCTCCTGC CATGGAATCC CCTACTCTAC TGTGTGTAGC CTTACTGTTC    60TTCGCTCCAG ATGGCGTGTT AGCAGTCCCT CAGAAACCTA AGGTCTCCTT GAACCCTCCA   120TGGAATAGAA TATTTAAAGG AGAGAATGTG ACTCTTACAT GTAATGGGAA CAATTTCTTT   180GAAGTCAGTT CCACCAAATG GTTCCACAAT GGCAGCCTTT CAGAAGAGAC AAATTCAAGT   240TTGAATATTG TGAATGCCAA ATTTGAAGAC AGTGGAGAAT ACAAATGTCA GCACCAACAA   300GTTAATGAGA GTGAACCTGT GTACCTGGAA GTCTTCAGTG ACTGGCTGCT CCTTCAGGCC   360TCTGCTGAGG TGGTGATGGA GGGCCAGCCC CTCTTCCTCA GGTGCCATGG TTGGAGGAAC   420TGGGATGTGT ACAAGGTGAT CTATTATAAG GATGGTGAAG CTCTCAAGTA CTGGTATGAG   480AACCACAACA TCTCCATTAC AAATGCCACA GTTGAAGACA GTGGAACCTA CTACTGTACG   540GGCAAAGTGT GGCAGCTGGA CTATGAGTCT GAGCCCCTCA ACATTACTGT AATAAAAGCT   600CCGCGTGAGA AGTACTGGCT TGCTAGCGGT GGAGGTGGAT CCGATGCACA CAAGAGTGAG   660GTTGCTCATC GGTTTAAAGA TTTGGGAGAA GAAAATTTCA AAGCCTTGGT GTTGATTGCC   720TTTGCTCAGT ATCTTCAGCA GTGTCCATTT GAAGATCATG TAAAATTAGT GAATGAAGTA   780ACTGAATTTG CAAAAACATG TGTTGCTGAT GAGTCAGCTG AAAATTGTGA CAAATCACTT   840CATACCCTTT TTGGAGACAA ATTATGCACA GTTGCAACTC TTCGTGAAAC CTATGGTGAA   900ATGGCTGACT GCTGTGCAAA ACAAGAACCT GAGAGAAATG AATGCTTCTT GCAACACAAA   960GATGACAACC CAAACCTCCC CCGATTGGTG AGACCAGAGG TTGATGTGAT GTGCACTGCT  1020TTTCATGACA ATGAAGAGAC ATTTTTGAAA AAATACTTAT ATGAAATTGC CAGAAGACAT  1080CCTTACTTTT ATGCCCCGGA ACTCCTTTTC TTTGCTAAAA GGTATAAAGC TGCTTTTACA  1140GAATGTTGCC AAGCTGCTGA TAAAGCTGCC TGCCTGTTGC CAAAGCTCGA TGAACTTCGG  1200GATGAAGGGA AGGCTTCGTC TGCCAAACAG AGACTCAAGT GTGCCAGTCT CCAAAAATTT  1260GGAGAAAGAG CTTTCAAAGC ATGGGCAGTA GCTCGCCTGA GCCAGAGATT TCCCAAAGCT  1320GAGTTTGCAG AAGTTTCCAA GTTAGTGACA GATCTTACCA AAGTCCACAC GGAATGCTGC  1380CATGGAGATC TGCTTGAATG TGCTGATGAC AGGGCGGACC TTGCCAAGTA TATCTGTGAA  1440AATCAAGATT CGATCTCCAG TAAACTGAAG GAATGCTGTG AAAAACCTCT GTTGGAAAAA  1500TCCCACTGCA TTGCCGAAGT GGAAAATGAT GAGATGCCTG CTGACTTGCC TTCATTAGCT  1560GCTGATTTTG TTGAAAGTAA GGATGTTTGC AAAAACTATG CTGAGGCAAA GGATGTCTTC  1620CTGGGCATGT TTTTGTATGA ATATGCAAGA AGGCATCCTG ATTACTCTGT CGTGCTGCTG  1680CTGAGACTTG CCAAGACATA TGAAACCACT CTAGAGAAGT GCTGTGCCGC TGCAGATCCT  1740CATGAATGCT ATGCCAAAGT GTTCGATGAA TTTAAACCTC TTGTGGAAGA GCCTCAGAAT  1800TTAATCAAAC AAAATTGTGA GCTTTTTAAG CAGCTTGGAG AGTACAAATT CCAGAATGCG  1860CTATTAGTTC GTTACACCAA GAAAGTACCC CAAGTGTCAA CTCCAACTCT TGTAGAGGTC  1920TCAAGAAACC TAGGAAAAGT GGGCAGCAAA TGTTGTAAAC ATCCTGAAGC AAAAAGAATG  1980CCCTGTGCAG AAGACTATCT ATCCGTGGTC CTGAACCAGT TATGTGTGTT GCATGAGAAA  2040ACGCCAGTAA GTGACAGAGT CACCAAATGC TGCACAGAAT CCTTGGTGAA CAGGCGACCA  2100TGCTTTTCAG CTCTGGAAGT CGATGAAACA TACGTTCCCA AAGAGTTTAA TGCTGAAACA  2160TTCACCTTCC ATGCAGATAT ATGCACACTT TCTGAGAAGG AGAGACAAAT CAAGAAACAA  2220ACTGCACTTG TTGAGCTTGT GAAACACAAG CCCAAGGCAA CAAAAGAGCA ACTGAAAGCT  2280GTTATGGATG ATTTCGCAGC TTTTGTAGAG AAGTGCTGCA AGGCTGACGA TAAGGAGACC  2340TGCTTTGCCG AGGAGGGTAA AAAACTTGTT GCTGCAAGTC AAGCTGCCTT AGGTGGAGGT  2400GGATCCGTCC CTCAGAAACC TAAGGTCTCC TTGAACCCTC CATGGAATAG AATATTTAAA  2460GGAGAGAATG TGACTCTTAC ATGTAATGGG AACAATTTCT TTGAAGTCAG TTCCACCAAA  2520TGGTTCCACA ATGGCAGCCT TTCAGAAGAG ACAAATTCAA GTTTGAATAT TGTGAATGCC  2580AAATTTGAAG ACAGTGGAGA ATACAAATGT CAGCACCAAC AAGTTAATGA GAGTGAACCT  2640GTGTACCTGG AAGTCTTCAG TGACTGGCTG CTCCTTCAGG CCTCTGCTGA GGTGGTGATG  2700GAGGGCCAGC CCCTCTTCCT CAGGTGCCAT GGTTGGAGGA ACTGGGATGT GTACAAGGTG  2760ATCTATTATA AGGATGGTGA AGCTCTCAAG TACTGGTATG AGAACCACAA CATCTCCATT  2820ACAAATGCCA CAGTTGAAGA CAGTGGAACC TACTACTGTA CGGGCAAAGT GTGGCAGCTG  2880GACTATGAGT CTGAGCCCCT CAACATTACT GTAATAAAAG CTCCGCGTGA GAAGTACTGG  2940CTATAGTAAG AATTC   2955(2)SEQ ID NO：5的信息：  (i)序列特征：

(A)长度：1827个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑类型：线性  (ii)分子类型：DNA  (iii)假设：非  (iii)反义：非  (v)片段类型：内部(xi)SEQ ID NO：5的序列描述：ATGAAGTGGG TAACCTTTAT TTCCCTTCTT TTTCTCTTTA GCTCGGCTTA TTCCAGGGGT     60GTGTTTCGTC GAGATGCACA CAAGAGTGAG GTTGCTCATC GGTTTAAAGA TTTGGGAGAA    120GAAAATTTCA AAGCCTTGGT GTTGATTGCC TTTGCTCAGT ATCTTCAGCA GTGTCCATTT    180GAAGATCATG TAAAATTAGT GAATGAAGTA ACTGAATTTG CAAAAACATG TGTAGCTGAT    240GAGTCAGCTG AAAATTGTGA CAAATCACTT CATACCCTTT TTGGAGACAA ATTATGCACA    300GTTGCAACTC TTCGTGAAAC CTATGGTGAA ATGGCTGACT GCTGTGCAAA ACAAGAACCT    360GAGAGAAATG AATGCTTCTT GCAACACAAA GATGACAACC CAAACCTCCC CCGATTGGTG    420AGACCAGAGG TTGATGTGAT GTGCACTGCT TTTCATGACA ATGAAGAGAC ATTTTTGAAA    480AAATACTTAT ATGAAATTGC CAGAAGACAT CCTTACTTTT ATGCCCCGGA ACTCCTTTTC    540TTTGCTAAAA GGTATAAAGC TGCTTTTACA GAATGTTGCC AAGCTGCTGA TAAAGCTGCC    600TGCCTGTTGC CAAAGCTCGA TGAACTTCGG GATGAAGGGA AGGCTTCGTC TGCCAAACAG    660AGACTCAAAT GTGCCAGTCT CCAAAAATTT GGAGAAAGAG CTTTCAAAGC ATGGGCAGTG    720GCTCGCCTGA GCCAGAGATT TCCCAAAGCT GAGTTTGCAG AAGTTTCCAA GTTAGTGACA    780GATCTTACCA AAGTCCACAC GGAATGCTGC CATGGAGATC TGCTTGAATG TGCTGATGAC    840AGGGCGGACC TTGCCAAGTA TATCTGTGAA AATCAGGATT CGATCTCCAG TAAACTGAAG    900GAATGCTGTG AAAAACCTCT GTTGGAAAAA TCCCACTGCA TTGCCGAAGT GGAAAATGAT    960GAGATGCCTG CTGACTTGCC TTCATTAGCT GCTGATTTTG TTGAAAGTAA GGATGTTTGC   1020AAAAACTATG CTGAGGCAAA GGATGTCTTC CTGGGCATGT TTTTGTATGA ATATGCAAGA   1080AGGCATCCTG ATTACTCTGT CGTGCTGCTG CTGAGACTTG CCAAGACATA TGAAACCACT    1140CTAGAGAAGT GCTGTGCCGC TGCAGATCCT CATGAATGCT ATGCCAAAGT GTTCGATGAA    1200TTTAAACCTC TTGTGGAAGA GCCTCAGAAT TTAATCAAAC AAAACTGTGA GCTTTTTAAG    1260CAGCTTGGAG AGTACAAATT CCAGAATGCG CTATTAGTTC GTTACACCAA GAAAGTACCC    1320CAAGTGTCAA CTCCAACTCT TGTAGAGGTC TCAAGAAACC TAGGAAAAGT GGGCAGCAAA    1380TGTTGTAAAC ATCCTGAAGC AAAAAGAATG CCCTGTGCAG AAGACTATCT ATCCGTGGTC    1440CTGAACCAGT TATGTGTGTT GCATGAGAAA ACGCCAGTAA GTGACAGAGT CACAAAATGC    1500TGCACAGAGT CCTTGGTGAA CAGGCGACCA TGCTTTTCAG CTCTGGAAGT CGATGAAACA    1560TACGTTCCCA AAGAGTTTAA TGCTGAAACA TTCACCTTCC ATGCAGATAT ATGCACACTT    1620TCTGAGAAGG AGAGACAAAT CAAGAAACAA ACTGCACTTG TTGAGCTTGT GAAACACAAG    1680CCCAAGGCAA CAAAAGAGCA ACTGAAAGCT GTTATGGATG ATTTCGCAGC TTTTGTAGAG    1740AAGTGCTGCA AGGCTGACGA TAAGGAGACC TGCTTTGCCG AGGAGGGTAA AAAACTTGTT    1800GCTGCAAGTC AAGCTGCCTT AGGCTTA    1827(2)SEQ ID NO：6的信息：  (i)序列特征：

(A)长度：773个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑类型：线性  (ii)分子类型：DNA  (iii)假设：非  (iii)反义：非  (v)片段类型：内部(xi)SEQ IDNO：6的序列描述：ATGGCTCCTG CCATGGAATC CCCTACTCTA CTGTGTGTAG CCTTACTGTT CTTCGCTCCA      60GATGGCGTGT TAGCAGTCCC TCAGAAACCT AAGGTCTCCT TGAACCCTCC ATGGAATAGA     120ATATTTAAAG GAGAGAATGT GACTCTTACA TGTAATGGGA ACAATTTCTT TGAAGTCAGT     180TCCACCAAAT GGTTCCACAA TGGCAGCCTT TCAGAAGAGA CAAATTCAAG TTTGAATATT     240GTGAATGCCA AATTTGAAGA CAGTGGAGAA TACAAATGTC AGCACCAACA AGTTAATGAG     300AGTGAACCTG TGTACCTGGA AGTCTTCAGT GACTGGCTGC TCCTTCAGGC CTCTGCTGAG     360GTGGTGATGG AGGGCCAGCC CCTCTTCCTC AGGTGCCATG GTTGGAGGAA CTGGGATGTG     420TACAAGGTGA TCTATTATAA GGATGGTGAA GCTCTCAAGT ACTGGTATGA GAACCACAAC     480ATCTCCATTA CAAATGCCAC AGTTGAAGAC AGTGGAACCT ACTACTGTAC GGGCAAAGTG     540TGGCAGCTGG ACTATGAGTC TGAGCCCCTC AACATTACTG TAATAAAAGC TCCGCGTGAG     600AAGTACTGGC TACAATTTTT TATCCCATTG TTGGTGGTGA TTCTGTTTGC TGTGGACACA     660GGATTATTTA TCTCAACTCA GCAGCAGGTC ACATTTCTCT TGAAGATTAA GAGAACCAGG     720AAAGGCTTCA GACTTCTGAA CCCACATCCT AAGCCAAACC CCAAAAACAA CTG    773