借助于X－射线晶体学方法筛选和设计配体

发明的技术领域

X-射线晶体学方法可用于鉴别结合靶受体分子的配体，并可用于设计对靶受体具有改进生物活性的配体。

发明的背景

X-射线晶体学方法(晶体学)是一门成熟的技术，它可对晶体中分子显示的图形以三维图象的形式提供最好的描述。科学家已经应用晶体学方法对许多重要的生物学分子分辨了其晶体结构。借助于晶体学方法，可对多种生物分子进行研究，包括但不局限于蛋白质，DNA,RNA和病毒。科学家甚至还报导了在其受体内携带配体的生物分子的晶体结构(一种“配体-受体复合物”)。

给定一种靶标生物分子或配体-受体复合物的“图象”，科学家可以找到在此可行使生物活性的空穴或受体。然后科学家可以通过实验或计算对此受体设计出高亲和性的配体(或药物)。计算方法已经被选择地用于筛选对小分子的结合。但是，以前这些设想仅获得了有限的成功。几个问题困扰着通过计算方法对配体的设计。计算方法与其说是基于对结合能量的精确测算，倒不如说是基于估算，并且，在与存在于生物分子内部复杂的相互作用相比较时，是依赖于简单的计算。而且，计算方法还需要实验证实，这种实验常常会暴露出一些对真实靶标不起作用的假阳性模式。

此外，基于配体-受体复合物图象的实验性高亲和性配体设计，仅局限于已经具有已知配体的生物分子。最后，科学家仅在最近才报导了有机溶剂和靶生物分子之间相互作用的晶体学研究。Allen等，物理，化学杂志V 100.pp2605-11(1996)。但是，这些研究仅局限于测定绘制溶剂的位点，而不是配体的位点。所需要的是，直接鉴别潜在的配体，并获得有关在靶生物分子内配体是如何结合和改变的详细信息。此外，还需要有可用于鉴别和/或设计某些配体的方法，这些配体对于给定的靶分子具有生物活性和/或药物活性。

发明概述

对于未知是靶生物分子配体的化合物，可以用晶体学方法筛选和鉴别它们结合此靶标的能力。该方法(此后写作“CrysteLEAD^TM”)包括，获得靶生物分子的晶体；将此靶标暴露于可能是此靶标潜在性配体的一个或多个待测样品；以及测定是否形成了配体/生物分子复合物，可通过不同的方法使此靶标暴露于潜在性配体，包括但不局限于在一个或多个潜在性配体的溶液中浸泡结晶体，或者在有一个或多个潜在性配体存在时共结晶生物分子。

在另一实施方案中，是将所发现的来自配体/受体复合物的结构信息用于设计新配体，同已知的配体相比较，这种新配体结合更紧密，结合的特异性更强，具有更强的生物活性，或者具有更安全的分布。

在一个优选的实施方案中，应用“不同形状”化合物的文库；使之在此配体即使作为混合物的一部分被暴露时，也能直接鉴别其配体-受体复合物。这就避免了对来自此混合物的命中复合物(hit)进行费时间的解盘绕(deconvolution)过程。在此，可同时实现三个重要步骤。计算出电子密度函数可直接揭示结合过程，鉴别所结合的化合物，并且提供配体-受体复合物的详细3-维结构。在一个实施方案中，一旦找到了一个命中复合物，就可能借助于常规的筛选方法筛选此命中复合物的许多类似物或衍生物，找出且有更紧密结合或更强生物活性的。另一个实施方案是利用此命中复合物和关于靶分子结构的信息，构建具有更紧密结合或更强生物活性的类似物或衍生物。在还有一个实施方案中，是将此配体-受体复合物暴露于潜在配体的补充迭代物，这样使二个或多个命中复合物可被连接在一起，构成一个更有效的配体。

附图简述

图1显示基于结构的药物设计，在此应先找到起始前导化合物，然后被用作携带附加部分的支架，装配环绕主要位点的次级位点。

图2显示对于具有二个或更多相邻主空穴的生物分子片段连接的方法。

图3是CrysteLEAD^TM法的示意图，其中晶体被浸泡于多种潜在性配体(I1-I10)的溶液中，收集X-射线衍射数据组，并转化成电子密度图形，用于检查化合物的结合。

图4显示2-维和3-维的典型化合物的混合物。3-维图形是代表分子“形状”的理论2Fo-Fc电子密度图形。

图5是人尿激酶的一级序列。

图6显示在将尿激酶浸泡于含有潜在配体混合物的溶液之后，如何通过形态检测和鉴别命中复合物。图6A是起始Fo-Fc图形。图6B显示在尿激酶的活性位点化合物如何结合。图6C显示没有结合混合物的化合物时，未结合配体的活性位点。

图7显示对于被浸泡在含有潜在性配体混合物溶液中的尿激酶的一个命中复合物。图7A是起始Fo-Fc图形。图7B显示在尿激酶的活性位点化合物如何结合。

图8显示对于被浸泡在含有潜在性配体混合物溶液中的尿激酶的一个命中复合物。图8A是起始Fo-Fc图形。图8B显示在尿激酶的活性位点化合物如何结合。

图9显示对于被浸泡可含有潜在性配体混合物溶液中的尿激酶的另外二个命中复合物。图9A是对于混合物中强配体的Fo-Fc图形。图9B是对于混合物中较弱配体的Fo-Fc图形。只有当将强配体从混合物中除去之后才能检测较弱的配体。

图10显示在通过CrysteLEAD^TM发现的前导化合物和最佳后随化合物之间的比较性晶体结构。

图11显示被鉴别的VanX命中复合物。

图12显示尿激酶的一个命中复合物。

图13显示化合物44与ErmC’的晶体结构。

图14显示化合物45与ErmC’的晶体结构。

发明详述

CrysteLEAD^TM(晶体引导法^TM)提供了一种有效的筛选方法，用于鉴别将结合于靶生物分子的化合物。这样一些化合物可以作为设计对靶标具有改进生物学活性的配体和/或药物的前导或支架。必须注意到，较紧密结合的配体不一定就提供更强的生物活性或者构成更好的药物，虽然这是一般的规律。有可能结合较弱的配体由于除了紧密结合以外的同素(例如选择性，生物有效度)而提供较强的生物活性。

为了进行基于结构的药物设计，晶体学方法已广泛地被用于观测受体-配体复合物。为了观测这种复合物，通常将已知的配体浸泡于靶分子晶体中，随之观察复合物的晶体学过程。有时必须使配体与靶分子共结晶，以便获得适合的晶体。

直至现在，晶体学尚未用来筛选潜在的配体，尽管它提供了详细的结构信息。对于通过晶体学方法筛选化合物可能存在如下多种偏见：此方法太复杂或太费时间，很难获得适合的晶体，现有的晶体尚不允许掺入一个以上化合物(更不用说是十个或更多化合物的混合物)，可能需要太多的生物分子，按常规的方法建立晶体太费时间，以及在X-射线晶体测角计上持续地更换晶体太冗长缓慢。

但是，目前现有的技术已经克服了许多这些方面的障碍。例如，曾经仅能从天然来源获得靶分子，并且由于天然降解或糖基化有时不适合于结晶。此外，天然浓度常常太低，不能获得结晶所必需的高度纯化蛋白质的量。借助于分子生物学方法，有可能表达和纯化大量的蛋白质用于结晶。必要时甚至可以重建此蛋白质，以便提供不同的或更好的晶体形状。

进而，由于已经有了极亮的光源(同步加速器发射)和更灵敏的检测器，使收集数据所需的时间从几天惊人地降低至几小时或者甚至是几分钟。而且，一些在目前尚不是常规的，但可能很快将成为常规的现有技术，使之有可能在大约几秒钟或者甚至在几分之一秒钟内收集充分的数据组(例如，Laue晶体衍射法)。J.Hajdu等，自然，V 329.pp.178-81(1987)。更快的计算机和更自动化的软件，已大大减少了收集和分析资料所需要的时间。最后，本发明者已发现，掺入或共结晶化合物的混合物，有可能用于筛选潜在的配体。因此，如下面所述，现在，晶体学方法是一种实用的和可行的筛选方法。

在CrysteLEAD^TM中，是通过将小分子文库，单独地或以混合物状态暴露于靶分子(例如蛋白质，核酸等)来鉴别具有晶体形态的靶分子配体。因此，可获得假定靶标-配体复合物的电子密度图与靶生物分子的电子密度图相比较的结晶学数据。电子密度图同时提供了配体结合的直接证据，对结合配体的鉴别，以及配体-靶标复合物的详细3-维结构。还可以通过结晶衍射图形中单个反射波的改变来监测配体结合，已知这种结晶衍射图形对在活性位点配体的结合是敏感的。这可以作为预筛选，但不是选择的主要方法，因为它不能提供详细的结构信息。

通过观测此衍射图形中配体电子密度水平或某些反射波强度，作为对晶体加入的或共结晶中的配体浓度函数的改变，还可以确定配体对生物分子的结合亲和性。还可以通过竞争性实验获得结合亲和性资料。在此，是用已知结合亲和性的一系列不同形状配体中的一个浸泡或共结晶此新化合物。如果已知配体在电子密度图形中出现，那么未知的配体是较弱的结合物。但是，如果发现新化合物中的一个化合物竞争此位置，那么它将是最紧密的结合物。通过改变已知配体的浓度或同一性，可估算对CrysteLEAD^TM命中复合物的结合常数。

所筛选化合物的数目是根据所要求的检测极限，化合物的溶解度及此晶体所允许的有机共溶剂的量。确切的数目取决于各个晶体。例如，对于一个允许1％有机共溶剂的典型晶体，为了同时筛选10个化合物其灵敏度极限应该是Kd＜1.5mM。对于20个化合物，其灵敏度极限将是Kd＜0.63mM。但是，允许高含量有机共溶剂(例如40％)的晶体，在Kd＜1.5mM的检测极限内可筛选达到50个化合物。

在CrysteLEAD^TM法的最一般性的应用中，是将命中复合物或引导化合物用于确定，在基于结构的药物设计中应该对什么化合物测定其生物活性。然后通过传统的药物化学获得衍生物和类似物，以便找出最好的配体或药物。

另一方面，在筛选过程中收集的结构信息可被直接用于提示该命中复合物的类似物或衍生物。对这种方法的图解说明显示，此时其活性位点是由一个主要的空穴组成，它周围环绕着多种亚位点和小空穴(图1)。当检测命中复合物时，可同时获得有关受体如何结合化合物的详细结构信息。这种信息对于普通的技术人员设计更好的配体是有用的。P.Colmen，结构生物学现代观点V.4.pp 868-74(1994)；J.Crreer等，医疗化学杂志，V.37.pp.1035-54(1994)。特别是，此命中复合物可识别用于类似物合成的位点，这样使之能够接近周围的亚位点和小空穴。这意味着可设计更好地适合活性位点的新化合物。而且，在具有现存的结构-功能关系的情况下，可以在3-维结构水平将增强活性的取代图形直接转移至新的前导支架。

另一种图解(图2)通常可应用于具有将容纳片段的2个或更多单独空穴的靶标。在此，将为结晶靶标筛选按顺序或同时占据全部位点的配体。因为是通过观察共结晶结构来监测此结合过程，所以可直接鉴别配体结合的位点，并且为了确保此配体确实在蛋白质上占据不同的位点，没有必要作竞争性实验。分别筛选可用于对不同空穴结合的配体，这些空穴重叠于它们的结合位置。在存在前者时筛选后者，可检测在第二位点的协同结合。一旦确立了潜在的前导和结构-活性关系，则可应用此详细的结构信息和以前描述的片段连接方法设计每个位点间的连接，以便产生新型的，更有效的配体。S.B.Shaker等，科学，V.274.PP 1531-34(1996),C,Verlimde等，结构，V.15,PP.577-87(1994)。

在第三种应用中，即支架融合法(未显示)，其靶活性位点是由二个或多个亚位点组成。可筛选结晶蛋白借助于这些亚位点与之结合的配体，并且经过多次实验观测相对配体的结合取向。这些配体将通过占据一个或几个亚位点，并且覆盖多命中复合物的结构而相结合，可设计一个有利于接近多亚位点的核心。然后，此核心将作为一个新颖并更有效的前导化合物，此化合物也可在药物设计循环中作为前导支架。

CrysteLEAD^TM连接-片段法为基于结构的连接片段法提供了实验性方法，后者仅在计算水平被Verlinder等在计算机辅助分子设计杂志V,16.PP.131-47(1992)中报导过。Verlinde等提出了基于数学计算的配体片段。然后测定这些所提议片段的结合活性。如果这些片段确实被结合了，则可借助于X-射线晶体学方法测定它们的三维结构，并设计一个接头。相比之下，CrysteLEAD^TM可同时检测结合过程并提供此配体-蛋白质复合物的实验性测定的三维结构。本发明还提供了一种方法，用于测定靶分子与其配体之间的结合常数。本发明不需要对靶标作特定的标记。因此，靶分子可以包括蛋白质，多肽，核酸，核蛋白，或者其它任何适合的靶分子，它们可从天然来源中分离出，或者作为普通技术人员的开发实践，通过重组技术从任何适合的宿主系统得到。

晶体筛选法有几个优点。一个重要的优点是可直接监测结合过程，这样可使假阳性的可能性降低至接近于零。晶体学数据可提供配体-受体复合物的三维电子密度快速摄影照片，显示出结合了哪种化合物，以及它如何被结合。

此方法对靶标和配体的结构改变特别灵敏。在设计前导支架的过程中，观测结构的改变是关键性的，此支架结合了来自不同配体-靶复合物结构的信息。存在这样一个实例，当为了适应一个配体蛋白质改变了结构，但是，此结构改变同时也阻碍了第二个配体的结合。类似地，测定结构改变也是重要的，因为如果主要支架以不同方式结合，那么它也许不可能使它们组合成较大的支架。

因为可直接监测结合过程，CrysteLEAD^TM不需要对配体结合间接敏感的特殊标记的样品、探针或靶分子。只要能够获得靶标的晶体结构，就可以应用CrysteLEAD^TM筛选配体。

如果适当地设计成形状各异的化合物混合物，本发明则可减少对作为混合物被浸泡的文库脱盘绕的需要，因为可通过测定在结合位点的电子密度形状直接检测此结合过程。因此，电子密度的形状可直接地鉴别结合过程和化合物的同一性。按另一种方法，还可以设计此混合物使之包含带有不规则散射原子(例如Br,S)的化合物，这可以借助于不规则散射技术来鉴别。另外，因为CrysteLEAD^TM可直接监测结合过程，所以它特别适合用于研究尚未知存在配体的靶标。

因为在CrysteLEAD^TM中计算的电子密度函数显示出晶体的“真实空间”，所以可直接聚焦于感兴趣的区域。因此，可专门在感兴趣的位点检测结合，虽然此方法并不局限于活性位点。从整体考虑可以将在其它位点的结合删除，在大多数结合测定中这种结合会使分析复杂化。

CrysteLEAD^TM还提供了一种在不同位置同时监测结合的方法。这就是，对于具有一个以上空穴的靶标，对第二位点的筛选不需要在有第一配体存在时筛选。但是，为了发现协同配体，可在有第一配体存在时完成对第二位点的筛选。

CrysteLEAD^TM适用于任何一种可获得晶体结构的靶分子。根据目前的文献这包括任何一种具有分子量大约5000-200000的可溶性大分子。但是，随着技术的进步，此范围几乎在日益扩展。此方法还对很宽的结合离解常数范围(＜毫纤克分子至克分子)敏感。应用较灵敏的CCD摄像检测器，以一个旋转的阴极源，可以在大约＜4小时-4小时之内收集数据。这使每个检测器，每天有可能筛选上千个化合物。应用同步加速器源，每个检测器筛选的化合物数目可增加至数千个，并且，以Lane数据收集法和检测混合物，可在一秒或更短的时间内收集CrysteLEAD^TM数据，这样，每天每束射线可检测上千个化合物。因此，多检测器或单个同步加速器射线有助于实现真正高产率的筛选。

图3是本发明的概要。在有一个或几个化合物存在时通过浸泡其结晶或者通过通过共结晶此靶分子，使靶分子的结晶暴露于一个或几个化合物。然后收集处理晶体学数据，并将它转变成作为配体结合证据被检测的电子密度图。检测配体结合的一种方法是将初始晶体的结构与所暴露晶体的结构相比较。

可借助于所公布的条件或者通过在本领域已成熟的其它方法将新靶标结晶。类似地，靶标的结构可从数据库如蛋白质数据库获得，或者可通过已成熟的方法测定获得。分子生物学和蛋白质工程的进展促进了靶标的结晶过程，同时，数据收集的进展有助于对以前未知结构的靶标快速地测定其结构。

通过浸泡暴露于潜在配体的晶体需要一个未占用并易接近的活性位点。可以通过多种方法获得具有未占用活性位点的晶体，包括但不局限于：在没有配体的情况下结晶；在存在结合于远端位点的配体时结晶；或者在存在非共价配体的情况下结晶，一旦此生物分子形成结晶，此配体易被稀释或者从靶分子中被交换。借助于一种新颖的方法，本发明者通过在活性位点存在可降解的配体时结晶一个生物分子，然后在晶体形成时使此配体降解，获得了此生物分子的结晶。按另一种方法，有可能在有将被筛选的化合物存在的情况下生长出晶体。使晶体在存在此混合物的情况下达到平衡，在此平衡点，配体作为它们的浓度和结合亲和性的函数而结合。

对于浸泡法，此方法的灵敏度可能接近于简单的平衡关系，因为在晶体中蛋白质的浓度可以计算，配体的浓度是已知量。例如，晶体中25000MW的蛋白质(尿激酶)的浓度可按如下计算：在具有55×53×82³体积的正交晶单位细胞(全角90°)中有4个分子；应用阿伏伽德罗数，此浓度是28mM。因此，对于每个配体具有6mM浓度的混合化合物将导致Kd＜1.5mM的计算灵敏度极限(假定晶体中有大约80％占有率的检测极限)。

浸泡混合化合物还会产生多占有率的问题(一个以上配体结合于所需位点)。对于配体被结合在不同空穴的多占有率的情况(见图2)，通过CrysteLEAD^TM法分辨是容易的，因为，借助于电子密度图，可逐个地区分在不同位点的结合。对于不同配体竞争占据相同位点的情况，为了计算对这种结合的需要量，可应用一个简单的竞争性抑制模型。根据实验观测人们相信，晶体学方法可以分辨一个抑制剂的占有率是80％，另一个是20％的情况。因此，大于4的结合亲和性比率将导致仅由较高亲和性配体的明显占有率。在混合物中二个化合物的结合常数之比小于4的不大可能的情况下，所形成的电子密度可能将是二个分隔密度的重量平均数而难以鉴别。从而，只有当结合亲和性的比率小于4的情况下，为了使混合物脱盘绕，有必要进行进一步的浸泡实验(例如逐个检查各个晶体中的每个化合物)。这仍然是值得和有效的，因为它已经确定在此混合物中至少存在二个命中复合物。

使被筛的化合物组成文库。为了对此进行论述，文库是化合物的大混合物(100-10000+)，并且可能是一般性的或结构定向的。一般性的文库是随机的，也就是说其大小，形状和官能度完全不同。结构定向性文库被指向特定的功能混合物或靶分子活性位点中的亚位点(例如，其所有的化合物都含有羧化官能度的文库将定向于靶活性位点中的正电荷)。

在优选的实施方案中，两种类型的文库都被分成较小的形态不同的混合物组。因此，可将混合物定义为可能被浸渍或生长成晶体的文库子系统。通过对二维化学结构的目测或者通过计算程序，可确定此混合物是形态不同的。此混合物的形态差异使有可能根据形成的电子密度图直接鉴别结合的配体(见图4)。这就避免为了确定混合物中什么化合物是命中复合物(结合于靶标的)而需要持续地实验。

如果待测化合物是水溶性的，可将应用于结晶的特定缓冲液和沉淀剂溶液用来溶解此混合物，并将它们浸渍成为晶体。对于较低水溶性的化合物，可单个地在适当的有机溶剂中溶解，成为最终浓度2M。在一个实施方案中，是将它们溶解于100％DMSO，并存放于4℃，在暴露于晶体之前，通过混合这些DMSO贮备液面使化合物混合。这些混合物可用于共结晶生长条件不包含有机试剂的大多数晶体系统。一般是将这些化合物浸泡达到1-10％的最终DMSO浓度，并使其与结晶蛋白平衡一段预先确定的时间(4-24小时)。在此情况下，每次浸渍混合物都将每个晶体暴露于多个化合物。某些晶体生长条件可包括高浓度的有机溶剂(40-50％)，一般是醇衍生物。在此情况下，可将此化合物文库溶解于结晶有机溶剂中，对于浸渍实验，此有机溶剂允许达到最终共溶剂浓度40-50％。在此，每次浸渍混合物时化合物的数目可能增加。

浸泡之后，在浸渍混合物中将每种晶体暴露于晶体保护剂如5-20％甘油，并安装在尼龙环中，置于在氮冷却气流(160K)下的X-射线装置上。还可以在室温或其它为晶体稳定所必要的适当条件下对晶体进行研究。可使用自动化晶体安装和更换装置，以便加速此操作过程。

收集和处理晶体学数据，其中对衍射图形上的每个反射(点)赋予一个指数值(h,k,l)，并测定其强度作为此范围的标准。X-射线源可以是实验室X-射线发生器，或者是高亮度的同步加速器源，后者可非常快速地收集衍射数据。具体地说，实验室数据收集对每种晶体可能花费30分钟-几小时，而使用同步加速器源可以减少时间。应用Lane数据收集方案可使每种晶体数据收集的时间缩短至几分之一秒。

然后借助于普通技术人员熟悉的方法将此衍射数据转变成电子密度图。此电子密度图是配体和/或靶生物分子的三维图象。

对于Fo-Fc图形，是从观测的结构因子幅度(｜Fo｜)减去计算的结构因子幅度(｜Fc｜)，后者是从不具有所结合配体的已知晶体结构获得的。因此，这图形表示从由存在文库混合物时浸泡的晶体所得到的数据，直接减除由天然蛋白质结构所得到的数据。此结果是具有正向和负向峰值的电子密度图形。与CrysteLEAD^TM有关的峰是正向峰，它是配体在靶标上所需位点结合的直接结果，也就是将配体加入靶分子中。在图3，其Fo-Fc图形在尿激酶的活性位点清晰地显示了一个大的正向峰。此峰的形状相当于配体2-氨基-8-羟基喹啉。显示出此配体拥有正向差异密度。其它的正向峰相当于结合的硫酸盐部分(以SO₄^2-指示)和结合的水分子(以H₂O指示)。这种类型的图形对小的结构改变(以Δ指示)也非常灵敏，当和2Fo-Fc图形一起应用时，使之可能确定整个配体-蛋白质复合物的详细结构。为了计算2Fo-Fc图形，可从2(｜Fo｜)减去(｜Fc｜)。在此，此图形是正向的，并且有此分子的所有原子的密度。

在图3，对图形的观测可指示出所结合化合物的同一性和结构。优选地，可将暴露晶体的图形与未暴露靶分子的图形相比较，以便区别可能在Fo-Fc图形中所发现的正向密度。在不存在结合配体的情况下，有时水分子占据晶体中的活性位点。这易于被区分，因为所结合水分子常常以和结合的氢一致的几何形状定向，并且因为它们不被共价键的网络连接。因此，所产生的图形倾向于被断开，指示结合的溶剂而不是有机化合物。如果确定Fo-Fc或2Fo-Fc图形中的密度代表有机化合物，那么可将此三维图形与存在于文库中的化合物的三维图形相比较，并可形成最适合的匹配。按另一种方法，应用程序如QUANTA的XFIT模型(分子模拟公司，产生和展示量子的分子，San Diego：分子模拟公司，1997)可使此方法自动化。

由于测定或处理衍射强度的能力改进了，可以不需要对电子密度图进行比较。可以通过将暴露晶体的衍射图形与未暴露晶体的进行简单的比较来检测结合。因此，如果在此预筛选过程检测结合情况，只需要产生电子密度图形。

如上面所示，可以将CrysteLEAD^TM应用于能获得晶体结构的任何靶生物分子。因为它的广泛适用性，下面将通过实施例对它作最好的说明。

尿激酶和VanX实施例代表CrysteLEAD^TM应用的二种情况。对于尿激酶，重建的微UK(μUK)晶体衍射性能非常好，并且是高度对称性空间晶群。与之相反，VanX晶体衍射性能较弱并具有较低的对称性。因此，VanX需要较多的数据收集时间。此外，尿激酶晶体在其不对称单元中有一个分子，而VanX具有6个。较大的不对称单元需要收集较高分辨率的数据，并且使对图形的观测更加缓慢。但是，在VanX的情况下，在借助于CrysteLEAD^TM发现它们之前，尚不知有任何非真晶格(non-Substrate)拟态结合物。因此，CrysteLEAD^TM提供了一种新颖的非肽前导化合物，将被注入药物发现的周期中。对于尿激酶，CrysteLEAD^TM提供了一种新颖的初始支架。通过应用现存的SAR和晶体结构，本申请者能够迅速地增加此初始支架的效力，以便设计优于已知尿激酶配体，具有改进生物有效度的较高亲和性的衍生物。

但是，这些实施例仅说明本发明的优选实施例，并不对权利要求或详细说明构成限制。普通的技术人员很快将体会到，只有按照本发明的范围和精髓，才能对特定的实施方案进行改变和修饰。最后在此将所有引证的文献引入作为参考。

实施例

实施例1：尿激酶

尿激酶是一种丝氨酸蛋白酶，与肿瘤细胞密切相关联。尿激酶激活血纤维蛋白溶酶原变成血纤维蛋白溶酶，后者又激活基质金属蛋白酶。血纤维蛋白溶酶和金属蛋白酶使细胞内基质降解，并促进肿瘤生长和转移。因此，特异性对准尿激酶的抑制剂可能用作有效的抗癌药剂。

人的前一尿激酶由411个氨基酸组成(图5)。Verde等，国家科学院学报.V.81(5),pp 4727-31(1984)；Nagai等，基因V.36(1-2).pp.183-8(1985)。当通过蛋白水解在Lys¹⁵⁸-Ile¹⁵⁹断开肽键而被激活，此酶成为由单一二硫桥(Cys¹⁴⁸-Cys²⁷⁹)连接的二条链。A-链(残基1-158)包含EGF样功能区和kringle功能区。B链(残基159-411)包含丝氨酸蛋白酶催化功能区。对尿激酶的进一步温育将导致在Lys¹³⁵-Lys¹³⁶进一步蛋白水解断开肽键，形成低分子量的尿激酶。Spraggon等，在结构，V.3.pp.681-91(1995)中报道，他们获得了在与共价抑制剂Glu-Gly-Arg氯甲基酮的复合物中存在的此酶的结晶形式，并且在高能同步加速器源下显示出达到2.5分辨率的衍射。但是，这些晶体连同存在的共价结合抑制剂的衍射质量差，使之难以应用CrysteLEAD^TM法。

μUK晶体的制备及其结构

为了实施CrysteLEAD^TM法，重新构建了人的尿激酶，使之仅由B-链的残基159-404组成，其中以谷氨酸取代天冬酰胺302，以便除去糖基化位点，并以丙氨酸取代半胱氨酸，以便除去自由巯基部分。这种形式的尿激酶(μUK)显示出完全的活性，并发现能以同CrysteLEAD^TM法相容的晶体形式形成结晶。(也可参见Heyneker等的美国专利No.5112,755,1992年5月12日发表。)

制备载体构建体pBC-LMW-UK-Ala²⁷⁹

将人UK的突变体克隆进入双顺反子细菌表达载体pBCFK 12。Pilot-Matias等，基因，V.128.pp 219-25(1993)。借助于PCR，用下列寡核苷酸产生多种UK突变体：

SEQ ID #                PCR引物序列

1    5′-ATTAATGTCGACTAAGGAGGTGATCTAATGTTAAAATTTCAGTGTGGCCAA-3′

2    5′-ATTAATAAGCTTTCAGAGGGCCAGGCCATTCTCTTCCTTGGTGTGACTCCTGATCCA-3′

3    5′-ATTAATTGCGCAGCCATCCCGGACTATACAGACCATCGCCCTGCCCT-3′

按照标准的PCR反应，应用人UK cDNA作模板，用SEQ ID No 1和2作引物，对低分子量UK(此后被称为LMW-UK(L¹⁴⁴-L⁴¹¹))进行起始克隆。将PCR扩增的DNA作凝胶纯化，并用限制性酶SalⅠ和HindⅢ消化。然后使此消化产物连接进入预先用相同的这二种酶酶切的pBCFK12载体中，产生表达载体pBC-LMW-UK。将此载体转化进入DH5α细胞(LifeTechnologise,Gaithersburg.MD)，然后分离，并通过DNA测序证实其序列。借助于SDS-PAGE和酶谱学方法分析细菌中产生的LMW-UK,Granelli-Piperno等，实验医学杂志，V.148.pp.223-34(1978)，此方法测定UK对血纤维蛋白溶酶原的激活作用。通过Commassie兰染色凝胶已证明，在大肠杆菌中表达了LMW-UK，在酶谱学检测法中它是有活性的。

对大肠杆菌中LMW-UK快速表达和检测的成功，使之有可能对UK进行诱变分析，以便确定它的最小功能结构。借助于PCR，用SEQ ID NO2和3构成了一个具有Cys²⁷⁹变成Ala²⁷⁹置换的突变体，以AviⅡ和HindⅢ酶切此PCR产物，并用于置换PBC-LMW-UK构建体中的AviⅡ和HindⅢ片段。在大肠杆菌中表达了所形成的PBC-LMW-UK-Ala²⁷⁹构建体，并在酶谱学方法中显示其产物是有活性的。

在杆状病毒中克隆和表达μUK(UK(I¹⁵⁹-K⁴⁰⁴)A²⁷⁹Q³⁰²)

应用如下的寡核苷酸引物，通过PCR产生了μUK(包含Ala²⁷⁹Gln³⁰²的UK氨基酸Ile¹⁵⁹-Lys⁴⁰⁴)：

SEQ ID #                       PCR引物序列

4    5′-ATTAATCAGCTGCTCCGGATAGAGATAGTCGGTAGACTGCTCTTTT-3′

5    5′-ATTAATCAGCTGAAAATGACTGTTGTGA-3′

6    5′-ATTAATGTCGACTAAGGAGGTGATCTAATGTTAAAATTTCAGTGTGGCCAA-3′

7    5′-ATTAATGCTAGCCTCGAGCCACCATGAGAGCCCTGCT-3′

8    5′-ATTAATGCTAGCCTCGAGTCACTTGTTGTGACTGCGGATCCA-3′

9    5′-GGTGGTGAATTCTCCCCCAATAATGCCTTTGGAGTCGCTCACGA-3′

为了使UK中的唯一糖基化位点(Asn302)突变，将寡核苷酸引物SEQID NO:4和6，以及SEQ ID NO:5和8用于以pBCLMW-UK-Ala²⁷⁹作模板的二个PCR反应。用限制性酶PVUⅡ酶切此二个PCR反应的产物，以T4 DNA连接酶连接，然后用作模板产生LMW-UK-A²⁷⁹-Q³⁰²。与此同时，应用天然UK cDNA作模板，以SEQ ID NO:7和9通过PCR将天然UK前导序列直接融合于Ile¹⁵⁹。

用此PCR产物和SEQ ID NO.8作引物，在以LMW-UK-A²⁷⁹-Q³⁰²DNA作模板的另一PCR反应中产生μUK cDNA。以NheⅠ酶切μUK，并连接于用相同酶酶切的杆状病毒转移载体pJVP10z。Vialard等，病毒学杂志，V.64(1),pp.37-50(1990)。通过标准的DNA测序技术证实了所形成的构建体pJVP10z-μUK。

应用来自PharMingen(San Diego.CA)的BaculoGold试剂盒，通过磷酸钙沉淀法将构建体pJVP10z-μUＫ转染至Sf9细胞。在此培养基中检测了μUK的活性。通过标准的方法将表达μUK的单重组病毒作噬斑纯化，并制备了大量贮备病毒。

在另一个昆虫细胞系，High-Five细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中进行了大批量μUK表达，此细胞在2种摇瓶中，悬浮培养于无血清的Excel 405培养基(SRH Biosciences,LeneXa,Ks)中，28℃，以80rpm的速度振荡。使High-Five细胞生长达到2×10⁶个细胞/ml后，以0.1感染复数加入重组μUK病毒，并继续培养3天。收获培养上清液用作纯化的起始材料。通过UK生色底物S2444的酰胺分解测定此培养上清液中μUK的活性，底物S2444的浓度为6-10mg/升。Claeson等，止血法.V.7.p.76(1978)。

在巴斯德毕赤酵母中表达μUK

为了在毕赤酵母中表达μUK，使用了带有合成前导序列的表达载体。通过修饰载体pHil-D2(Invitrogen)构建了毕赤酵母表达载体pHil-D8，使其含有分泌重组蛋白的合成前导序列。此前导序列5’-ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTACTTTGCAATCTGTCTTCGCTCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC-3’(SEQ ID NO:10)编码为KEX2断裂而有效连接于前-肽序列(黑体字母指示的)的PH01分泌信号(下面加单线指示的)。为了构建pHil-D8，用pHil-S1(Invitrogen)作模板进行PCR，因为此载体含有编码pH01的序列，这是相当于pHil-S1的核苷酸509-530的正向引物(SEQ ID NO:11)和具有一种核苷酸序列的反向引物(SEQ ID NO:12)，这种核苷酸序列编码PH01分泌信号的后部分(SEQ ID NO:10的核苷酸45-66)以及前肽序列(SEQ ID NO:10的核苷酸67-108)。此引物序列(从Alamed.CA Operon技术公司获得)如下：

SEQ ID #                      PCR引物序列

11    5′-GAAACTTCCAAAAGTCGCCATA-3′

12    5′-ATTAATGAATTCCTCGAGCGGTCCGGGATCCCTCGGCAGCGGAACCAACGGTAGTGCAG

          ATAACTGGCTGAGCGAAGACAGATTGCAAAGTA-3′

在标准的PCR条件下进行扩增。对此PCR产物(大约500个bp)作凝胶纯化，用BlpⅠ和EcoRⅠ切割，并连接于用相同酶切割的pHil-D2。将此DNA转化进入大肠杆菌HB101细胞，并通过限制性酶切消化和序列分析对阳性克隆进行鉴定。一个具有合适序列的克隆被称为pHil-D8。

然后使用下面二个寡核苷酸引物扩增用于克隆进入pHil-D8中的μUK。

SEQ ID #                 PCR引物序列

13    5′-ATTAATGGATCCTTGGACAAGAGGATTATTGGGGGAGAATTCACCA-3′

14    5′-ATTAATCTCGAGCGGTCCGTCACTTGGTGTGACTGCGAATCCAGGGT-3′

用pJVP10z-μUK作模板，以SEQ ID NO:13和14获得了PCR产物。用BamHⅠ和XhoⅠ酶切此扩增产物，并连接于用相同的这二个酶酶切的pHil-D8。通过DNA测序证实所形成的质粒是pHil D8-μUK，并按照供应商的说明将它用于转化毕赤酵母GS115株(Invitrogen)。根据供应商(Inivitrogen)详述的方法，通过在BMGY培养基中培养，在BMMY培养基中表达，筛选转化的毕赤酵母菌落对μUＫ的表达。用生色底物S2444测定了μUK的活性。与在杆状病毒-High-Five细胞中观察到的相比较，在毕赤酵母中μUK的表达水平较高，达到30-60mg/L。

纯化μUK.

将High Five细胞或毕赤酵母的培养上清液合并于20升的容器内。加入蛋白酶抑制剂碘乙酰胺，苯甲脒和EDTA，使之分别达到最后浓度为约10mM,5mM和1mM。然后通过加入5mM,pH7.5的Hepes缓冲液将此上清液稀释5倍，并使之通过1.2μ和0.2μ的滤膜。在以50-100ml/min的流速通过膜时，μUK被捕获在Sartorius膜吸附剂S100(SartorinsEdgewood,NY)上。用10mM pH7.5的Hepes缓冲液，10mM碘乙酰胺，5mM苯甲脒，1mM EDTA彻底漂洗之后，用在10mM pH7.5 Hepes缓冲液配制的NaCl梯度液(20mM-500mM,200ml)，10mM碘乙酰胺，5mM苯甲脒，1mM EDTA从S100膜上洗脱μUK。在含有抑制剂的10mM Hepes缓冲液中将此洗出液(～100ml)稀释10倍，然后对S20柱(BioRad,Hercules.CA)加样。用20倍柱体积的NaCl梯度液(20mM-500mM)洗脱μUK。在此洗脱缓冲液中不使用抑制剂。然后用10mM，pH7.5 Hepes缓冲液将此洗出液稀释5倍，并对肝素-琼脂糖(Sigma)柱加样。用10mM-250mM的NaCl梯度液洗脱μUK。将此肝素柱μUK洗出液(～50ml)施加于用10mMpH7.5 Hepes缓冲液，200mM NaCl平衡的苯甲脒-琼脂糖(Sigma.St.Louis.MO)柱(40ml)。然后用平衡缓冲液洗柱，并用50mM,pH4.5的NaOAc,500mM NaCl洗脱。通过超滤将此μUK洗出液(～30ml)浓缩至4ml，并施加于用20mM pH4.5 NaoAc,100mM NaCl平衡的Sephadex G-75柱(2.5×48cm；Pharmacia^Biotech,Uppsala，瑞典)。收集含有μUK的单一主峰，冷冻干燥成最终产物。此纯化的材料在SDS-PAGE上呈现单一主电泳带。

高质量的μUK结晶有助于通过达到1.0分辨率的X-射线晶体学方法确定它的远-三维结构。借助于悬滴气雾扩散法得到了晶体。典型的孔池液由0.15M Li₂SO₄,20％聚乙二醇，MW 4000和琥珀酸缓冲液，pH4.8-6.0组成。在盖玻片上，将2μl孔池液与2μl蛋白质溶液混合，并将此盖玻片封盖在孔池上。在约18-24℃下，24小时内可出现结晶，此蛋白质溶液含有6mg/ml(0.214mM)μUK，配制在10mM,pH4.0的柠檬酸，3mMε-氨基己酸对-乙酯基苯基酯氯化物(抑制剂)与1％DMSO的共-溶剂中。据信用于共结晶中的此抑制剂可酰化活性位点丝氨酸195，随之通过酶促脱酰化，因为，在有这化合物存在时生长的晶体3维X-射线结构显示出没有在此酶的活性位点的遗留抑制剂。Menegatei等，酶抑制作用杂志V.2.PP 249-59(1989)。出现的唯一密度是由于结合的溶剂分子密度。因为不存在此抑制剂时μUK将不结晶，认为此结晶体是亚稳态抑制剂：UK复合物据信是结晶实体。重要的是，所形成的μUK晶体是由酶和空活性位点组成，这对于实现CrysteLEAD^TM法是理想的情况。

在这些条件下获得的晶体属于空间晶群P212121，具有单元室尺寸a=55.16,b=53.00,c=82.30,和α=β=γ=90°。在旋转的阳极源上它们的衍射超过1.5。更进一步地，在纽约Ithaca的Cornell高能同步加速器源下，已收集到1.0分辨率的自然数据组。应用AMORE程序(Navaja，结晶学报，A50:157-163(1994))，以低分辨率尿激酶结构作检查探针(Spraggon等,结构V,S.pp.681-691(1995)；PDB eneryILMW)，通过分子置换法确定了此晶体的结构。应用XPLOR程序包(A.Brunger,X-PLOR(2.1版本)手册，耶鲁大学，New Haven CT(1990))对此结构进行了精选加工。

筛选弱碱

将此μUK对结构定向性文库进行了筛选，以便发现可能具有优越药物动力学特点的新型初始支架。因为尿激酶的活性位点是由一个主空穴组成，此空穴含有以天冬氨酸(Asp¹⁸⁹)形成的游离羧化物，所以最被熟知的支架是强碱性的，并含有脒或胍部分。已发现此碱性基团以氢键盐键与Asp¹⁸⁹连接。这在药理学可能是一个问题，因为已知强碱降低口服生物有效度。因此，选择了弱碱性的文库，它包含以前未知是尿激酶结合剂的化合物。

在可利用的化学制品目录(ACD)中查到了一个弱碱文库，它含有61个具有PKa在大约1-9的化合物。通过观测其二维化学结构确定，将此文库细分为各有大约6-7个形状不同化合物的9组混合物。通过上面所述的方法对此化合物混合物进行筛选。准确地说，将每种化合物溶解于100％DMSO中使之达到最终浓度约2M(或者对于小溶解度的成饱和液)。将含有此混合物的6或7种化合物的每种化合物等体积混合，形成单个化合物的最终浓度为0.33M。将单一的μUK晶体置于含有27％PEG4000,15.6mM琥珀酸pH5.4,0.17M Li₂SO₄和0.5-0.8ml化合物混合物的50ml溶液中，此化合物混合物被加入形成1-1.6％DMSO和3.3-5.2mM单个化合物最终浓度。在这些条件下，预期检测结合剂的实验灵敏度为Kd＜1.0mM。使晶体能够平衡达大约8-24小时。

在配有RAXISII或MAR像平面检测器的Rigaku RTP 300 RC旋转阳极源上收集数据。典型的数据由具有2-5分钟暴光时间的45-50 2°振荡组成。典型的数据，在2.0-3.0的分辨率70-90％是完整的具有13-26％的交汇R-因子。因此，根据快速的数据收集方案，数据质量从好至差地排列。但是，已表明数据的这种质量适合于对结合剂的初步检测，由于具有高质量的起始模型，它已被精选达1.5的分辨率(R=20.7％,Rfree=25.3％)。使用DENZO程序包(Otwinowski等，酶学方法276(1996))处理数据，借助于XPLOR程序包计算电子密度图形。

应用QUANTA 97程序包(分子模拟公司，产生和展示量子的分子，San Diego：分子模拟公司1997)，在Silicon Graphics INDIGO2工作站上检查电子密度图形。在活性位点电子密度的形态被目视鉴别为产生自混合物中的一个(或几个)化合物，指示出存在阳性命中复合物(hit)，或者产生自有序的水分子，指示出不存在结合。对于导致阳性命中复合物的实验，观察到适合的化合物移动进入电子密度之中。还核查了电子密度图确定是否蛋白质结构有任何改变，如果观测到，则作适当的修正。因此，在图形检查和化合物配合步骤之后，就可知道化合物：蛋白质复合物的三维结构。尿激酶的例子采用目测移动化合物进入此密度中，因为仍然是小批量进行筛选。当扩展至筛选大批量化合物时，商用程序如QUANTA的XFIT模型装有助于自动化配合化合物至此密度。

图6显示阳性命中复合物的实例。所筛选的化合物编号为1-6，活性位点Fo-Fc电子密度图形显示在图6A。此密度的形态鉴别结合剂为化合物5。图6B显示主要的特异性空穴中化合物的详细结合模型，是通过对CrysteLEAD^TM电子密度图的描述直接获得。氨基氮的氢与Asp¹⁸⁹的羧基结合，嘧啶基氮的氢与骨架羰基(Gly²¹⁸)结合。此结构还显示，理想的修饰位点应该是在吡啶甲基。

化合物的另一个混合物(化合物7-13)不产生任何命中复合物(hits)。浸渍这组化合物之后所形成的电子密度图形，与此混合物中任何待测化合物的图形不相对应。代之，它们与结合的溶剂分子相对应。见图6C。

图7显示阳性命中复合物的另一个实例。在被筛选的7个化合物(14-20)中，图7A中所示的Fo-Fc图形表明，被结合的是化合物19。图7B中描绘的结合模型显示，2-氨基是以氢键同Asp¹⁸⁹侧链结合，并且为了接近相邻的疏水亚空穴(图7B中以S1β指示的)，8-羟基是取代的理想位点。图8代表另一个命中复合物，发现其中化合物22即5-氨基吲哚(图8A)是以同Asp¹⁸⁹结合的氨基氢结合于尿激酶(图8B)。被筛选的化合物是化合物21-27。

图9显示一个实例，发现其中来自相同混合物(化合物28-34)的二个化合物相结合而不存在多占有率的问题。在起初的实验中，是在存在全部混合化合物时浸渍此晶体，发现化合物28被结合(图9A)。此外，当将较弱结合的化合物31单独浸渍时(基于通过CrysteLEAD^TM确立的原有结构活性关系)，也发现此化合物被结合(图9B)。在本方法更典型的应用中，如果需要，为了检测混合物中较弱的结合剂，当不存在较弱结合剂时文库应被再浸渍。

表1概括了每种CrysteLEAD^TM命中复合物的抑制常数，是通过焦Glu>4)和pH7.4(50mM Txis)完成。其它的测定条件是150mM NaCl,0.5％Pluronic F-68去垢剂，200mM S-2444，具有DMSO最终浓度2.5％。底物的Km被测定为55μM。

表1：通过CrysteLEAD^TM检测命中复合物的抑制常数和pKa

化合物(CAS#)          Ki           Ki           pKa

                    (pH6.5)       (pH7.4)       ——

5(42753-71-9)   ＞＞500μM     ＞＞500μM       6.0*

19(70125-16-5)       56μM         137μM        7.3

22(65795-92-8)      200μM       ＞500μM       6.0*

28(580-22-3)         71μM         136μM       7.3

31(1603-41-4)   ＞＞500μM     ＞＞500μM       7.0*

*表示估计的pKa

基于此活性和结构信息，选择了化合物19作为前导化合物。晶体学信息表明，在8-位置取代使之可能接近相邻的疏水空穴S1β空穴，并从而导致效力增加。根据来自基于脒系列的晶体学和结合信息、合成了化合物35(化合物19的8-氨基嘧啶基类似物)。这种修饰导致在pH6.5(Ki pH7.4=2.5μM；Ki pH6.5=0.32μM)时结合效率增加大约200倍。实验表明，CrysteLEAD^TM法可提供前导支架，又可提供详细的结构信息，这些都是通过基于结构的药物设计，精心制作这种支架，使之成为更有效的化合物所必需的。

图10中显示出化合物35：尿激酶晶体的母体化合物19的外罩。此外罩表明，如所预期的，氨基吡啶环被结合于疏水的亚-空穴(S1β)空穴中，并且这种取代导致喹啉环向此位点移动。

还测定了化合物35,8-氨基嘧啶基-2-氨基喹啉的口服生物有效度。对于大鼠，已确定当给予10mg/Kg的剂量时，化合物35的口服生物有效度为30-40％。因此，CrysteLEAD^TM的成功实施导致形成了一种新颖的前导支架，通过一次基于结构的药物设计循环产生了具有200倍增效的化合物，并发现是口服生物可利用的。

实施例2：VanX

万古霉素是一种特选的药物，用于由对β-内酰胺抗菌素抗性的链球菌或葡萄球菌菌株引起的感染。但是，对于最终依赖的这种药物，现在已经发现了万古霉素抗性菌菌株。某些研究者认为VanX，一种金属蛋白酶与万古霉素抗性有关联。VanX是一种级联过程中的一部分，此过程导致以D-Ale-D-乳酸置换细菌肽聚糖链(对万古霉素的结合位点)末端的D-Ala-D-Ala部分。这样可导致对万古霉素的结合降低100倍。VanX的唯一已知的抑制剂是几种肽或肽衍生物，例如D-Ala-D-Ala底物的膦酸或膦酸类似物。因此，它们并不是适合的药物，因为在体内它们会被代谢和/或被降解。最初试图通过正常的筛选方法找到适合的药物，但未能揭示出适当的配体。随后，本申请者借助于CrysteLEAD^TM寻找非肽的前导化合物，用于开发针对治疗这些抗性菌株的药物。

VanX的制备

在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中37℃培养大肠杆菌W3110，使之达到在595nm的吸光度大约为1.3-1.5，此大肠杆菌W3110株含有质粒PGW1，其中的VanX基因是在IPTG-诱导性tac启动子的控制之下。然后加入IPTG至最终浓度0.8mM，并将细胞再培养1.5小时。

通过以6000rpm离心10分钟收获细胞。然后将细胞沉淀再悬浮于含有0.01％NaN₃,1mM MgCl₂,1mM PMSF,1mM DTT(缓冲液A)和25单位/ml苯并酶(benzonase)(Nicomed Pharma,Copenhagen,Denmark)的冰冷20mM Tris-HCl(pH8.0)中。在一种超声球磨机微珠制浆机(Biospec)中，通过对裂解混合液(1∶1 V∶V)加入0.1μm的氧化锆陶瓷微珠，运行1-3分钟使细胞裂解。这种微珠制浆机随贮冰容器一起运行，以便保持裂解物冷却。然后，将裂解液从沉淀的玻璃微珠上轻轻倒出。用1-2倍体积的裂解缓冲液漂洗此微珠，并将此洗液同原来的裂解液合并。然后以25000g离心此裂解液30分钟使细胞碎片沉淀。在50mM Tris-HCl,pH7.6,1mM EDTA和1mM DTT(缓冲液B)中，4℃将此上清液透析过夜。

然后，将透析过的裂解液对Q-琼脂糖速溶柱加样，此柱先以4mm/分钟的速度用缓冲液A预平衡过。用缓冲液A彻底洗柱，随后用缓冲液B-缓冲液B+0.5M NaCl的线性梯度液洗脱。将由此步骤得到的VanX活性组份合并在一起，浓缩后对缓冲液B中的Superose-75柱加样。然后将从Superose柱层析得到的VanX组份以2ml/min的速度对在缓冲液A中的Source-Q柱加样。用几倍柱体积的起始缓冲液洗柱。然后用缓冲液A-缓冲液A+25mM NaGl的稀薄梯液洗脱出VanX蛋白。用Amicon滤器，将来自这最后步骤的VanX活性组份浓缩至在缓冲液A中大约15mg/ml的最终浓度。除非另有说明，上面的过程均在4℃进行。纯化后，VanX蛋白质的纯度大约为95％，并容易结晶。

VanX晶体的结构

借助于多同晶型置换，以2.2的分辨率确定了VanX的晶体结构。Bussiere等，分子细胞，Vol 2.pp 75-84(1998)。通过定滴气雾扩散法(Sitting drop vapor diffusion method)，按空间晶群P21结晶前面获得的重组蛋白。典型的结晶具有单元室尺寸为a=83.4，b=45.5，c=171.4，α=γ=90°，β=104°，在不对称单元中具有六个分子。典型的池溶液由0.1M Mes pH6.4,0.24M硫酸铵和20％PMME 5000组成。在定滴微桥(Sitting drop microbridge,Hampton USA)上，将2ml蛋白质与2ml池溶液混合，并用盖玻片封闭池室。在18℃出现结晶，在大约2-3天之内晶体生长达到充分大小。此蛋白质溶液由在10mMTris中配制的12-15mg/ml(0.5-0.6mM)VanX,15Mm DTT,pH7.2组成。在这些条件下生长的晶体三维结构显示出一个空活性位点，使此系统可高度适合用于CrystaLEAD^TM。

VanX活性位点具有能够接纳D-Ala-D-Ala底物的延伸空穴。此空穴还包含催化锌。因此对于这种情况，最初是针对锌定向的文库筛选VanX，以便找到可能汇合成单一前导化合物的多结合支架。筛选了三个文库，它们利用定向锌的氨基酸，硫醇，异羟肟酸或羧化物部分。

筛选

氨基酸文库由102个可购得的光学纯天然和非天然存在的氨基酸化合物组成。将此文库分成含8-10个形态不同化合物的12组混合物，并用上述方法进行筛选。具体地说，将每种化合物溶解于100％DMSO中，使之达到最终浓度2M(或者对于小溶解度的成饱和液)。将每组混合物中的每种化合物等体积混合，形成单个化合物的最终浓度为0.33M。将单一的VanX晶体置于含有0.1M Mes pH6.4,0.24M硫酸铵，20％PMME5000和0.5-0.8ml混合化合物的50ml溶液中，此混合化合物被加入形成1-1.6％DMSO和3.3-5.2mM单个化合物最终浓度。使晶体能够平衡3-4小时。制备了硫醇，异羧肟酸和羧化物文库，并以类似的方式进行了筛选。

在配有RAXISII,MAR像平面检测器或MAR CCD检测器的Rigaku RTP300 RC旋转阳极源上收集数据。对于像平面系统，典型的数据由具有15分钟暴光时间的90 1.25°振荡组成，面对于CCD,100 1.0°振荡暴光2分钟。典型可用的数据在2.6-2.8分辨率＞90％是完整的，具有10-20％的交汇R-因子。这需要充分地观察并鉴别Fo-Fc或2Fo-Fc图形中的抑制剂。对于这些图形，其初始模型已被精选达2.1的分辨率(R=25％，R_free=28％)。借助于DENZO程序包处理数据，借助于XPLOR程序包计算电子密度图形。存在羧化物文库的某些化合物时，显示出空间晶群从P21移向C2(a=170.6,b=47.5,c=83.6,α=γ=90°,β=104°)。对于这种形式，其不对称单元含有一个三聚体，从而降低了自由度的数目，以致使较低的分辨率数值(3.0)就足够用于结合观察。

应用QUANTA 97在Silicon Graphics INDIGO2工作站上检查电子密度图形。在活性位点的电子密度图形被目测鉴别，通过混合物中一个或几个化合物的形状鉴别指示出存在阳性命中复合物，或者通过有序的水分子鉴别指示出不存在结合。对于导致阳性命中复合物的实验，观察到适合的化合物移动进入电子密度中。还检查了电子密度图形有无蛋白质结构有任何改变，如果观测到，则对其结构作相应的修正。因此，在图形检查和化合物配合步骤之后，就可知道化合物：蛋白质复合物详细三维结构。

在VanX筛选中目前已检测出6个命中复合物(化合物36-41)。图11显示代表性命中复合物的结合模型。在所有的情况下，电子密度图形可鉴别结合的化合物。图11A显示与协同于活性位点锌的羧化物结合的化合物39。图11B显示与指向活性位点锌的羧化物结合的化合物36。图11C中，还发现化合物37通过羧化物相结合。化合物39和化合物41的结合(后者未显示)暗示，活性位点锌优选与羧化物协同，优于自由的硫醇。这导致对羧化物文库进行了筛选，在此发现了另一些命中复合物。在所有的情况下，化合物都是在7-10个化合物的混合物中被筛选，通过电子密度图形直接鉴别此命中复合物。可按照类似于对尿激酶实施例所述的方式，将这些命中复合物直接提供给以结构为基础的药物设计循环。

实施例3：以100个化合物的混合物进行筛选

为了增加每单位时间通过CrystaLEAD^TM法可筛选化合物的数目，本方法的优选实施方案将筛选100个化合物的混合物，而不是10个化合物的混合物。这种方法的好处是较高的化合物吞吐量与降低对命中复合物检测的灵敏度同时存在。此外，因为只是结合混合物中最有效的化合物，较弱的命中复合物可能被遗漏。例如，当借助于CrystaLEAD^TM筛选一般性文库时，其中之一大小，形状和功能都完全不同，则预期命中碰撞率(hit-rate)较低。因此，较粗略的筛选被证明是合理的。此外，因为从这种筛选获得的命中复合物可能是更有效的结合剂，所以它们可作为起始支架用于基于结构的药物设计。因为化合物的混合物将由100个化合物组成，所以应该精心设计此混合物，以便确保全部成员形态不同而足以免除对去盘绕的需要。因此，在检测命中复合物时，为了鉴别命中复合物，进行某些去盘绕可能是必要的。

为了测验这种特殊的方法，将一个已知结合于μUK的化合物加到100个化合物的组中。这种已知的结合物化合物19原先已用CrysteLEAD^TM法发现，表明在pH6.5以56μM的Ki，在pH7.4以137μM的Ki结合于μUK。通过混合10个化合物的10组混合物构成了此100种化合物的混合物。具体地说，将10种干化合物的混合物溶解于100％DMSO中，形成大约80-240mM的最终浓度(或者对于小溶解度的制成饱和液)。将等量的10种化合物的每个混合物混合，形成单个化合物的最终浓度为8.0-24.0mM，并掺入化合物19的100％DMSO贮备液，使之达到最终浓度为18.0mM。将单一的μUK晶体置于27％PEG4000,15.6mM琥珀酸pH5.4,0.17M Li₂SO₄和0.5μl混合化合物的50μl溶液中，此混合化合物被加入形成1％DMSO。在浸渍实验中每种化合物的最终浓度在80-240mM的范围，化合物19的浓度是180mM。在这些条件下，预计本实验检测结合物的灵敏度为Kd＜20-60mM。晶体能够平衡达4小时15分钟。

以配有MarCCD摄像机的Argonne National Labs新式光子源同步加速器ID射线IMCA收集数据。数据由具有7秒暴光时间的100 1°振荡组成。数据在1.6分辨率为87.4％完整，具有5.4％的总并汇R-因子。用DENZO程序包(Otwinowski等，酶学方法，276(1969))处理数据，用XPLOR程序包计算电子密度图形。

应用QUANTA 97程序包(分子模拟公司，量子产生和展示分子。SanDiego：分子模拟公司，1997)，在Silicon Graphics INDIGO 2工作站上检查此电子密度图形。在活性位点此密度图形的形态被目测鉴别为是由指示阳性命中复合物的混合物中的一个化合物引起的，此化合物被鉴别为化合物19，并被描绘在图12中。

对于发现前导化合物这种方法是优选的。前导化合物一般应具有作为较紧密结合物的特征(例如，在本方法灵敏度范围内)。还能使此方法在1-2星期的时间范围内筛选10000个化合物的非定向文库。此方法还可用于同筛选10-20个化合物的其它方法结合，此时较弱的结合物可被鉴别。这些结合物不可能用作前导化合物，但是可附着于前导支架以使增加其效力。

实施例4：用CrystaLEAD^TM筛选ErmC’

ErmC’是一种rRNA甲基转移酶，它在23SrRNA的肽基转移酶环路内，从S-腺苷基-L-甲硫氨酸将甲基转移至腺嘌呤的N6。这种甲基化作用使之对许多大环内脂抗菌素如被广泛开处方的红霉素具有抗菌素抗性。预期抑制ErmC’将使抗性反转。为了设计一种特异性的并有效的ErmC’抑制剂，已把目标对准辅助因子或S-腺苷基-甲硫氨酸结合位点。S-腺苷基-L-甲硫氨酸被显示为下面的化合物42：

ErmC’的晶体结构显示，S-腺苷基-L-甲硫氨酸位点由二个可容纳腺嘌呤环和甲硫氨酸的主空穴组成。此外还存在第三个空穴，此空穴可容纳受到甲基化的rRNA腺嘌呤。为了在此位点确立SAR，产生了一个在N6和/或5’羟基被取代的腺苷类似物文库。文库中变化的位点被显示为下面的化合物43。

ErmC的表达和纯化

通过聚合酶链反应(PCR)扩增ErmC’基因和来自pERM-1的上游kdsB顺反子，构建了表达载体pTERM31。应用包含在“加尾的”PCR引物中的BamHⅠ和HimdⅢ位点，将此PCR产物亚克隆进入PET24+(Novagen,Madison,WI)中。在T7lac启动子控制下，通过对kdsB的翻译偶联，这个新构建体能够表达ErmC’。将pTERM31质粒转化进入E-ColiBL21P(DE3)/PLYS S株(Novagen)，并将所形成的菌株用于产生ErmC’。在New Brunswick Scientific(Edison,NJ)Micros发酵罐中，27.5℃培养转化的细胞，此发酵罐中含有以卡那霉素，氯霉素和葡萄糖补充的10升Superbroth(BIO 101,La Jolla,CA)。当培养物的光密度达到1.10，通过加入1mM异丙基β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导ErmC’表达。诱导后400分钟收获细胞。

在室温下融化冷冻的细胞糊状物(200-250g)，并再悬浮于5-10倍体积的冷裂解缓冲液(50mM Tris,5mM1,4-二硫苏糖醇(DTT)，1mM苯甲基磺酸氟化物(PMSF)，2mM乙烯-二胺四乙酸(EDTA),0.2％TritonX-100,pH7.8)中。用French压碎器裂解细胞，离心除去细胞碎片。将其上清液对20升Tris-DTT-甘油-镁(TDGM)缓冲液pH7.8(50mMTris,5mM DTT,10％甘油，10mM MgCl₂)透析过夜。然后将此透析物对已在TDGM缓冲液中预平衡的Sepharose Fast Flow柱加样。检测各组份中甲基转移酶活性，将含有ErmC’的组份合并在一起，对TSK SP-5PW柱(TosoHaas,Nontgomeryville,PA)加样，用NaCl梯度液洗脱。然后在YM-10(Amicon)滤膜上浓缩此纯化的蛋白质。

ErmC晶体结构

借助于悬滴气雾扩散法培育ErmC’的晶体。对装有100mM Tris,500mMNH₄(SO)₄,15％PEG 8000,pH7.8的储液器平衡含有在25mM Tris/Cl,100mM NaCl,2mM DTT,10％(v/v)甘油，pH7.5中配制的5-8mg/ml ErmC’的液滴。在1天内出现晶体，1周内长至充分的体积。晶体属于空间晶群P43212。应用在空间晶群P6中ErmC’的晶体结构(Bussiere等，生物化学Vol 137,pp 7103-7112)，通过达2.2分解率的分子置换确定了在这种空间晶群中ErmC’的结构。在这些条件下长成的晶体3维结构显示出一个空活性位点，使它成为非常适合应用CrystaLEAD^TM的系统。

筛选

此腺苷文库由59个化合物组成。将此文库分成8-9个形态不同化合物的7组混合物，并借助于CrystaLEAD^TM法进行筛选。具体地说，将每个化合物溶解于100％DMSO中，形成最终浓度1M(或者对于小溶解度的成饱和液)。混合等体积的每个化合物，组成10个化合物的混合物。将单一的ErmC晶体置于20％PEG 8000,0.3M硫酸铵，10％甘油,pH7.7和0.5-0.8ml混合化合物的50μl溶液中，被加入的混合化合物形成1-1.6％DMSO和3.3-5.2mM单个化合物最终浓度。使晶体能平衡3-4小时。

在带有RAXISII，MAR像平面检测器或MAR CCD检测器的Rigaku RTP300 RC旋转阳极源上收集数据。对于像平面系统，典型的数据由15-20 2°振荡组成，具有20-30分钟的暴光时间，而对于CCD系统，15-20 2.0°振荡暴光8-15分钟。典型可用的数据在3.4-3.6分辨率80-90％是完整的，具有7-16％的交汇R-因子。这需要充分地观测，并在Fo-Fc或2Fo-Fc图形中鉴别抑制剂。对于这些图形，起始模型已被精选达2.2分辨率(R=20％ R_free=25％)。用DENZO程序包处理数据，通过XPLOR程序包计算电子密度图形。

应用QUANTA 97，在Silicon Graphics INDIGO2工作站上检查电子密度图形。目测鉴别活性位点此密度图形的形状，通过混合物中一个或几个化合物的形状指示阳性命中复合物(Positive hit)，或者通过有序水分子指示不存在结合。对于导致阳性命中复合物的实验，目视发现适合的化合物移动进入此电子密度中。还核查了此电子密度图形是否存在蛋白质结构的改变，如果观测到则对结构作相应的修改。因此，在图形检查和化合物配合步骤之后，就可知道化合物：蛋白质复合物的详细3维结构。

在对ErmC’腺苷类似物的筛选中检测到二个命中复合物(化合物44和45)。图13和14显示出化合物44和45与ErmC’复合物的晶体结构。

在所有情况下，电子密度的形态可鉴别结合的化合物。发现疏水的替代物沿着部分暴露的疏水表面相结合，暗示存在可能有助于这些化合物结合的优选相互作用，使它们能够作为命中复合物被检出。没有检测出在5’OH位置含有替代物的命中复合物。对化合物44和45的后随化合物在此疏水位点含有最优化的氢化茚取代基。

                      序列表

<110>Nienaber,Vicki

     Greer,Jonathan

     Abad-Zapatero,Celerino

     Norbeck,Daniel

<120>借助于X-射线晶体学方法筛选和设计配体

<130>6308.US.P1

<150>09/036,184

<151>1998-03-06

<160>14

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

<210>1

<211>51

<212>DNA

<213>合成的

<400>1 attaatgtcg actaaggagg tgatctaatg ttaaaatttc agtgtggcca a51

<210>2

<211>57

<212>DNA

<213>合成的

<400>2 attaataagc tttcagaggg ccaggccatt ctcttccttg gtgtgactcc tgatcca57

<210>3

<211>47

<212>DNA

<213>合成的

<400>3 attaattgcg cagccatccc ggactataca gaccatcgcc ctgccct47

<210>4

<211>46

<212>DNA

<213>合成的    

<400>4 attaatcagc tgctccggat agagatagtc ggtagactgc tctttt46

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>合成的

<400>5 attaatcagc tgaaaatgac tgttgtga28

<210>6

<211>51

<212>DNA

<213>合成的

<400>6 attaatgtcg actaaggagg tgatctaatg ttaaaatttc agtgtggcca a51

<210>7

<211>37

<212>DNA

<213>合成的

<400>7 attaatgcta gcctcgagcc accatgagag ccctgct37

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>合成的

<400>8 attaatgcta gcctcgagtc acttgttgtg actgcggatc ca42

<210>9

<211>44

<212>DNA

<213>合成的

<400>9 ggtggtgaat tctcccccaa taatgccttt ggagtcgctc acga44

<210>10

<211>111

<212>DNA

<213>巴斯德毕赤酵母

<400>10 atgttctctc caattttgtc cttggaaatt attttagctt tggctacttt gcaatctgtc60 ttcgctcagc cagttatctg cactaccgtt ggttccgctg ccgagggatc c111

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>合成的

<400>11 gaaacttcca aaagtcgcca ta22

<210>12

<211>92

<212>DNA

<213>合成的

<400>12 attaatgaat tcctcgagcg gtccgggatc cctcggcagc ggaaccaacg gtagtgcaga60 taactggctg agcgaagaca gattgcaaag ta92

<210>13

<211>46

<212>DNA

<213>合成的

<400>13 attaatggat ccttggacaa gaggattatt gggggagaat tcacca46

<210>14

<211>47

<212>DNA

<213>合成的

<400>14 attaatctcg agcggtccgt cacttggtgt gactgcgaat ccagggt47