恶性疟原虫新的抗原候选基因PfMAg

本发明为一种恶性疟原虫新的抗原候选基因PfMAg的免疫保护作用，涉及生物医学高技术中的基因的开发与应用领域。

疟疾是当今世界上最致命的传染病之一。全球每年约有3亿到5亿人感染，2百万人死亡。其生活史可以简单归纳如下：当雌性按蚊叮咬宿主时，单核的子孢子从血循环侵入肝细胞，并在此发育为成熟的肝内期裂殖体。成熟的肝裂殖子从肝细胞内释放入血，侵入红细胞进行红内期无性生殖，经过2至3天后发育为成熟的裂殖体，从每个感染红细胞内可释放6至30个裂殖子。这些裂殖子再侵入其它红细胞，进行多轮扩增，导致大量的红细胞被感染、破裂，裂殖子和疟原虫的代谢产物、残余和变性的血红蛋白以及红细胞碎片等一并进入血流，刺激免疫细胞产生内源性热源质，起周期性寒热发作，并出现贫血及脾肿大。与此同时，少量裂殖子发育为有性期的雌、雄配子体，当宿主再次被蚊子叮咬后随血液进入蚊体开始其生活史的蚊虫期，生成下一代子孢子。疟疾疫苗的研究工作已经开展了50多年，但因其生活史复杂，抗原具有多态性等特点，目前仍没有高效的保护性抗原出现。恶性疟原虫肝内期和蚊期疫苗不能阻断红内期的感染，允许一部分原虫进入红细胞。虽然有证据表明，红前期疫苗可以导致发病率的降低。但从流行病学分析，当红前期疫苗在突变发生或免疫接种中止时，会造成大规模流行发生的危险；而红内期疫苗直接针对疟原虫的致病阶段，不会引起上述危险的发生。同时疟原虫在红内期每一个复制周期，都会加强机体的免疫反应。目前红内期疫苗的研究取得了一定的进展，其中红内期重复序列多肽疫苗由于具有表位稳定，表位密度大，引起免疫反应强的特点，在疟疾疫苗的研究中逐渐受到重视。

本发明的目的在于：寻找和克隆恶性疟原红内期新的抗原候选基因。

本发明的内容是应用cDNA文库筛选、DNA序列测定技术、分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、Western印迹杂交法，克隆恶性疟原虫红内期新的抗原候选基因PfMAg，并用酶联免疫吸附实验(ELISA)及恶性疟原虫体外抑制实验进行了免疫学分析。

该基因达到的技术指标为：

1.恶性疟原虫红内期新的抗原候选基因PfMAg cDNA片段长1938bp，含有

一个1767bp的完整的ORF，编码589个氨基酸、分子量为65kD的蛋白质；编码蛋白C末端存在14次10肽[(Q/K)T(D/E)E(I/L)(K/N)ND(H/N)I]的重复片段，该片段与鼠约氏疟红内期抗原PyAg-1 C末端有69％的相似性。(图1)

2.恶性疟原虫红内期新的抗原候选基因PfMAg其C端十肽重复片段重组蛋白在大肠杆菌BL21株中表达(图2)，该重组蛋白与病人血清和正常人血清的反应有显著差别(P＜0.05)，可识别病人血清(图4)。

3.恶性疟原虫红内期新的抗原候选基因PfMAg在红内期裂殖体期特异表达(图3)。

4.抗恶性疟原虫多克隆IgG在体外可抑制恶性疟原虫Dd2株和FCC1株的生长(图5)。

本项发明的优点：对筛选的恶性疟原虫红内期新的抗原候选基因PfMAg进行免疫学的研究，为恶性疟原虫的免疫治疗提供了新的保护性候选抗原。下面结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明：图1 PfMAg cDNA片段及其编码蛋白质序列图。

下划线部分为C端10肽重复序列。图2 重组的PfMAg重复十肽在大肠杆菌中的表达。

1，低分子量蛋白Marker；2，未诱导的含PfMAg C端10肽重复片段质粒的裂解物；3，诱导的含PfMAg C端10肽重复片段质粒的裂解物。箭头所指为重组蛋白带。图3 Western印迹分析红内期PfMAg基因的表达

1，红细胞对照；2，环状体期感染红细胞；3，裂殖体期感染红细胞。箭头所指为65kD PfMAg蛋白。图4病人血清、正常人血清与重组蛋白的免疫反应曲线图图5抗PfMAg IgG的恶性疟原虫体外生长抑制曲线图

实施例1：恶性疟原虫新的抗原候选基因PfMAg的克隆及序列分析1.M26-32单抗的制备

M26-32为我研究室早期制备的单克隆抗体。用粗提的约氏疟原虫裂殖子腹腔注射免疫BALB/C小鼠，5周后用约氏疟裂殖子加强免疫，融合前尾静脉注射恶性疟原虫裂殖子。取其脾细胞与Sp2/0瘤细胞融合，获得一种能产生抗疟原虫单克隆抗体M26-32的杂交瘤。杂交瘤细胞腹腔注射BALB/C

小鼠，产生的腹水作为下一步免疫筛库的一抗。

2.红内期cDNA文库的筛选

利用Promega公司Protoblot Immunoscreening System，按其说明书对恶性疟原虫Dd2株红内期cDNAλZAP文库进行筛选。一抗为M26-32腹水(1∶500倍稀释)，二抗为碱性磷酸酶联的羊抗鼠IgG(1∶7500倍稀释)。经两次筛选，获得阳性克隆后，送于大连宝生物公司进行序列测定。

3.PfMAg cDNA 5’末端的快速扩增

根据测序得到的阳性克隆的序列，设计三段引物：

RACE1：5’TACGCATATTTCCTGCTCTAATAC3’；

RACE2：5’GTATTAAGCTTATATCATTTATATC3’；

RACE3：5’GGAAAACATTTTGATATTATGCTGGC3’.安照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(GIBICOL公司，货号CAT.NO.18374-058)试剂盒说明书，利用上述引物，扩增PfMAg cDNA’末端，得到的片段送于送于大连宝生物公司进行序列测定。

4.PfMAg cDNA片段序列与编码氨基酸的分析

利用WINSTAR软件分析、拼接，得到恶性疟原虫红内期新的抗原候选基因PfMAg cDNA片段长1938bp，含有一个1767bp的完整的ORF，编码589个氨基酸、分子量为65kD的蛋白质。在编码蛋白C末端存在14次10肽[(Q/K)T(D/E)E(I/L)(K/N)ND(H/N)I]的重复片段。利用BLASTP程序在GenBank分析该片段与鼠约氏疟红内期抗原PypAg-1(GenBankNUMBER：AF103869)C末端有69％的相似性。(图1)

实施例2：PfMAg C端重复10肽免疫血清的制备及纯化

1.PfMAg C端重复10肽的亚克隆

根据PfMAg C端1381bp到1938bp序列设计引物：上游：5′CCATGGATGTGAAAGAAAGTAACACTC3’，包含NcoI位点(下划线)，下游：5′GGATCCGAGATATTACTATATATTTTGTATGG3’，包含BamH I位点(下划线)。用此对引物经PCR从PfMAg cDNA克隆中扩增得到657bp片段。将此片段经Nco I、BamH I酶切后，亚克隆于大肠杆菌表达载体pET30a(Novagen)。正确的克隆转化大肠杆菌BL21株，经37℃ IPTG诱导3小时，得到PfMAg C端重复10肽融合重组蛋白。(图2)。2.重组蛋白的纯化及免疫血清的制备与纯化

重组蛋白根据Novagen产品说明书进行纯化。100μg的纯化蛋白免疫兔子，每两周加强一次，共加强4次。免疫血清经两次硫酸胺沉淀后，过DEAE-52柱纯化得到IgG.实施例3：PfMAg基因红内期特异性表达1.恶性疟原虫红内期特异性全蛋白的制备

恶性疟原虫Dd2红内期(红内期疟原虫可分为环状滋养体、成熟滋养体、裂殖体和裂殖子阶段)虫株经5％山梨醇处理两次后，48小时和72小时分别取相同体积的红细胞，用等体积SDS电泳上样缓冲液100℃煮沸5分钟，用同样体积的红细胞作为阴性对照。2.Western印迹分析恶性疟原虫PfMAg基因红内期的特异性表达

等体积的恶性疟原虫红内期全蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移于PVDF膜上(Roche公司)，用BM化学发光试剂盒(Roche公司)检测，以1∶500上述免疫血清作为第一抗体。结果证明仅红内期裂殖体期有65KD特异表达带(图3)。实施例4：ELISA检测病人血清与重组蛋白的免疫反应

以PfMAg C端重复10肽的重组蛋白包板，以恶性疟病人血清、正常人血清为一抗(1∶200)，各取样本14个，以HRP标记的羊抗人IgG(1∶20000)为二抗，进行酶联免疫吸附实验。经显色，读取各孔OD值。将恶性疟病人OD值与正常人OD值进行分析比较，用EPI5.0软件包进行分析，得到P＜0.05，两个群体OD值有显著差异，即病人血清与重组蛋白的免疫反应显著高于正常人(图4)。实施例5恶性疟原虫的体外抑制1.正常人单核细胞的分离

从正常中国成年人体内取全血，以肝素抗凝。全血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心后，分离到单个核细胞。将细胞用RPMI1640不完全培养基(Gibico公司)重悬，37℃，5％CO₂孵箱孵育90分钟，洗去未粘附的细胞，贴壁的细胞用NSE染色(Sigma公司)确认其中单核细胞数。2.恶性疟原虫体外抑制实验

以两次5％山梨醇处理的恶性疟原虫Dd2虫株和FCC1虫株作为实验虫株，起始虫血率为1％。在96孔培养板上设计如下实验：(1)抗PfMAg重复十肽IgG；(2)抗PfMAg重复十肽IgG，单核细胞；(3)正常兔IgG；(4)正常兔IgG，单核细胞；(5)单核细胞。其中每孔中总体积为200μl，红细胞与单核细胞比为200∶1，IgG浓度为原始IgG浓度的5％，10％，20％。5％CO₂，5％O₂，90％N₂，37℃培养48小时后计数虫血率。结果显示，与对照相比，抗PfMAg IgG在一定浓度能有效抑制恶性疟原虫的生长(图5)。这种抑制与单核细胞的存在无关，说明抗PfMAg重复十肽IgG的抑制作用发生在裂殖子侵染阶段。

本发明表明抗PfMAg重复十肽IgG在体外可有效抑制恶性疟原虫的生长，据此其可作为保护性候选抗原，应用于恶性疟原虫的免疫治疗。