抗菌肽葛佬素的基因构建、制备方法及用途

本发明涉及葛佬素的cDNA序列、通过葛佬素的cDNA序列制备葛佬素cDNA的方法，通过葛佬素的cDNA序列制备重组抗菌肽葛佬素的方法，属基因工程领域。

革兰氏阴性(G^-)杆菌脓毒症和休克是导致临床病人死亡的主要原因之一，寻找有效的治疗措施一直是临床医学关注的焦点。

存在于G^-杆菌外膜上的内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)目前认为是G^-杆菌引起脓毒症的主要原因。近年的研究表明LPS在全身性炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和代偿性抗炎症综合征(Compensatory anti-inflammatory responsesyndrome，CARS)中起着重要作用，LPS在体内可直接刺激机体单核-吞噬细胞系统分泌包括TNF-α、I1-1和IL-6等细胞因子，这些因子的过度释放导致机体多器官衰竭甚至死亡。

葛佬素(Gloverin)是存在于蚕蛹中的一种分子量为13.8KD的带正电荷的阳性蛋白质，它含有130个氨基酸，具有杀灭G^-杆菌及中和内毒素的作用。其最大的特点为其具有高度的稳定性，在100℃下10分钟及强酸强碱的严酷情况下仍可保持活性，克服了蛋白类药物不稳定和不易保存的缺点。

针对葛佬素的报告仅有一篇，其重点是从蚕蛹中直接分离纯化葛佬素的方法以及对其进行生物活性的初步研究，尚未见到有关葛佬素cDNA序列的研究报告。

葛佬素具有杀菌及中和内毒素作用，但从蚕蛹中直接分离纯化葛佬素的数量非常有限，远远不能满足临床和实验室的要求，因此获取能够满足科研及临床应用的大量的葛佬素必须依赖现代基因工程的方法获得---即制备重组的葛佬素。而获得重组葛佬素的基础是必须知道葛佬素的cDNA序列，但由于葛佬素cDNA的序列目前尚未见报告。因此获得葛佬素cDNA至关重要。

本发明的目的即为公开葛佬素的cDNA。

本发明的另一目的在于根据葛佬素cDNA序列，采用化学合成法及聚合酶链式反应合成得到葛佬素的cDNA，为采用基因工程的方法制备重组的葛佬素奠定基础。

本发明的再一目的在于采用基因工程的方法制备具有生物学活性的抗菌肽葛佬素，用于可杀灭G^-杆菌及中和内毒素。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：对同种已知蛋白质Attacin A cDNA中氨基酸密码子的出现频度进行分析，采用出现频度高的密码子带入葛佬素蛋白质序列中进行葛佬素的cDNA序列设计，采用化学合成法及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)进行葛佬素的cDNA的合成构建；另外，本发明利用葛佬素的cDNA，采用基因工程的方法制备抗菌肽葛佬素，并测定了所得抗菌肽葛佬素的活性。

Attacin A为来自蚕蛹的抗菌抗内毒素的蛋白质，其cDNA和葛佬素蛋白质序列已在文献中公开发表，见Kang，D.，Lundstrom，A.andSteiner，H.Trichoplusia ni attacin A，a differentially displayedinsect gene coding for an antibacterial protein.Gene 1996，174(2)，245-249和Axen，A.，Carlsson，A.，Engstrom，A.and Bennich，H.Gloverin，an antibacterial protein from the immune hemolymph ofHyalophora pupae.Eur.J.Biochem.1997；247(2)，614-619。

获得蛋白质cDNA的方法有两种：一是采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)从组织中扩增获得，该方法的优点在于适合序列较长的蛋白质和序列未知的蛋白质，缺点为实验过程复杂，实验要求高，花费大；二是采用化学合成法根据已知蛋白质的氨基酸序列合成得到，该方法的优势在于实验简单、快速，实验要求低，花费少，适用于序列短的、氨基酸序列已知的蛋白质的cDNA构建。

获取葛佬素的cDNA的方法有两种，可以采用RT-PCR法从组织中扩增获得葛佬素的cDNA，也可以采用化学合成的方法合成寡核苷酸引物后采用PCR重叠延伸法扩增获取目的基因。RT-PCR法包括：在内毒素刺激蚕蛹后，抽提蚕蛹细胞总RNA；以总RNA为模板，采用Oligo dT和随机引物进行RT-PCR获取cDNA；以cDNA为模板，采用1对葛佬素引物，采用PCR方法获取葛佬素全长cDNA，进行序列测定、鉴定。采用化学合成的方法合成，即以单核苷酸为原料，由自动化的仪器自行完成寡核苷酸引物的合成，采用PCR重叠延伸法扩增获取目的基因。

本发明中所构建的葛佬素的cDNA序列即采用化学合成法合成寡核苷酸引物，采用PCR重叠延伸法扩增获取目的基因。

采用DNA序列测序的方法，可以鉴定所得到的DNA即为设计的序列。

具体地说，由于Attacin A是来自蚕蛹的抗菌蛋白质，其cDNA序列已知且与葛佬素的cDNA为同种族的已知蛋白质。本发明中，首先对同种族已知蛋白质Attacin A cDNA序列中氨基酸各种密码子的出现频度进行分析，结果发现Attacin A cDNA中出现频度高的密码子，采用出现频度高的密码子，如苯丙氨酸Phe采用的密码子为TTC，亮氨酸采用的密码子为TTG进行葛佬素的cDNA序列构建，通过6条寡核苷酸引物，采用PCR重叠延伸法得到目的基因，即葛佬素的cDNA。将PCR产物即目的基因与克隆载体pUC T载体相连，经测序鉴定表明该序列与设计的完全一致；将目的基因，即葛佬素的cDNA与组织型纤溶酶原激活剂的信号肽序列连接后，克隆入真核细胞载体，将此真核细胞载体转染真核细胞，真核细胞表达葛佬素，得到本发明的葛佬素并测定了其活性。

本发明的重组抗菌肽葛佬素可以用于治疗内毒素血症、脓毒症等疾病。

本发明的优点在于采用对同种族已知蛋白质cDNA序列中氨基酸各种密码子的出现频度进行分析，即可对仅知道蛋白质氨基酸序列的葛佬素的cDNA序列进行构建，不需进行繁琐的RT-PCR，用PCR重叠延伸法制备葛佬素的cDNA，进一步通过基因重组的方法制备抗菌肽葛佬素，其过程简单，花费少，时间短，效率高。

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。

图1.葛佬素的蛋白质序列；

图2.Attacin A cDNA序列；

图3. 6条寡核苷酸引物；

图4.设计并合成的葛佬素基因；

图5.本发明合成的葛佬素的cDNA的仪器测序结果；

图6.是图5的葛佬素的cDNA的序列表示；

图7.葛佬素的cDNA与克隆载体pUC T载体相连，提取质粒进行Hind III和Aat II双酶切鉴定；

图8.是产物3载体片段的电泳图；

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述办发明，而不是限制本发明。

                          实施例

1.对同种族已知蛋白质Attacin A cDNA序列中氨基酸各种密码子，附图2的出现频度进行分析，结果见表1；附图1为葛佬素的蛋白质序列。表1.编码Attacin A氨基酸密码子的出现频度

    氨基酸                                 密码子出现频度Phe(苯丙氨酸)                  TTT＝8；TTC＝9；Leu(亮氨酸)                    TTA＝3；TTG＝9；CTT＝4；CTC＝3；CTA＝1；CTG＝3Ile(异亮氨酸)                  ATT＝1；ATC＝2；ATA＝0Met(蛋氨酸)                    ATG＝8；Val(缬氨酸)                    GTT＝5；GTC＝9；GTA＝8；GTG＝3Ser(丝氨酸)                    AGT＝7Pro(脯氨酸)                    CCT＝5；CCC＝4；CCA＝4；CCG＝0Thr(苏氨酸)                    ACT＝3；ACC＝5；ACA＝2；ACG＝1Ala(丙氨酸)                    GCT＝6；GCC＝5；GCA＝4；GCG＝2Tyr(酪氨酸)                    TAT＝3；TAC＝4His(组氨酸)                    CAT＝1；CAC＝2Gln(谷氨酰胺)                  CAA＝4；CAG＝2Asn(天冬酰胺)                  AAT＝12；AAC＝0Lys(赖氨酸)                    AAA＝5；AAG＝9Asp(天冬氨酸)                  GAT＝5；GAC＝10Glu(谷氨酸)                    GAA＝8；GAG＝3Cys(半胱氨酸)                  TGT＝0；TGC＝0Trp(色氨酸)                    TGG＝2Arg(精氨酸)                    CGT＝4；CGC＝2；CGA＝0；CGG＝1；AGA＝1；AGG＝3Gly(甘氨酸)                    GGT＝7；GGC＝10；GGA＝8；GGG＝1Stop(终止密码子)               TAG＝1

2.采用出现频度高的密码子，表2，如苯丙氨酸Phe采用TTC进行葛佬素的cDNA序列构建，得到附图4所示的葛佬素的cDNA；表2.构建葛佬素cDNA使用的密码子

    氨基酸                   使用的密码子Phe(苯丙氨酸)                        TTCLeu(亮氨酸)                          TTGIle(异亮氨酸)                        ATCMet(蛋氨酸)                          ATGVal(缬氨酸)                          AGTSer(丝氨酸)                          TCTPro脯氨酸                            CCTThr(苏氨酸)                          ACCAla(丙氨酸)                          GCTTyr(酪氨酸)                          TATHis(组氨酸)                          CACGln(谷氨酰胺)                        CAAAsn(天冬酰胺)                        AATLys(赖氨酸)                          AAGAsp(天冬氨酸)                        GACGlu(谷氨酸)                          GAATrp(色氨酸)                          TGGArg(精氨酸)                          CGTGly(甘氨酸)                          GGAStop(终止密码子)                     TAG

3.根据附图3所示的6条寡核苷酸引物，采用PCR重叠延伸法合成得到附图4所示的目的基因，即葛佬素的cDNA；

具体方法是：(1)在PCR反应体系加入寡核苷酸引物2和4、dNTP、pfu Taq酶，按下列条件进行：94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4个循环后，加入寡核苷酸引物1和5，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30个循环，纯化PCR反应产物(PCR产物1)；(2)在PCR反应体系加入寡核苷酸引物3和5、dNTP、pfu Taq酶，按下列条件进行：94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，4个循环后，加入寡核苷酸引物2和6，94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环后，纯化PCR反应产物(PCR产物2)；(3)在PCR反应体系加入dNTP、pfu Taq酶、前述PCR产物1和PCR产物2，进行94℃PCR反应：预变性4分钟后，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，4个循环后；加入寡核苷酸引物1和6，进行PCR反应：预变性4分钟后，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30个循环后，纯化PCR反应产物。

4.将PCR产物即目的基因与克隆载体pUC T载体相连，提取质粒进行Hind III和Aat II双酶切鉴定完全正确；见附图7，其中A：PCR标记物，从下到上：237bp，377bp，515bp，697bp，994bp，1543bp；B，C，D，E，F：不同克隆质粒/Hind III+Aat II双酶切。

5.重组抗菌肽葛佬素的制备：将目的基因与组织型纤溶酶原激活剂的信号肽序列连接后，克隆入真核细胞载体；具体步骤如下：

第一步、设计2条引物，5’端引物含有限制性内切酶Hind III位点，3’端引物含有限制性内切酶Aat II位点。5’端引物：5’CCCAAGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGG 3。

3’端引物：5’TCTCGACGTCTCTGGCTCCTCTTCTG 3’。以含有组织型纤溶酶原激活剂全长序列的质粒pMM5065为模板，采用PCR方法扩增组织型纤溶酶原激活剂的信号肽序列ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGT CTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGA GACGTCGAGA，纯化PCR产物，采用Hind III和Aat II双酶切PCR产物，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后再次纯化，得到产物1，表示如下：

5’端AGCTTACTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAA ATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGAGCCAGAGACGT 3’端；

第二步、对含有葛佬素基因的克隆载体pUC T载体进行Hind III和Sal I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，纯化约400bp的DNA片段得到产物2：5’端CACTTGGGACAAGAACATCGGTAACGGTAAGGTTTTCGGTACTTTGGGTCAAAACGACGACGGTTTGTTCGGTAAGGCTGGTTTCAAGCAACAATTCTTCAACGACGACAGA GGTAAGTTCGAAGGTCAAGCCTACGGTACTAGAGTTTTGGGTCCAGCTGGTGGTACTACTAACTTCGGTGGTAGATTGGACTGGTCTGACAAGAACGCTAACGCTGCTTTGGACATCTCTAAGCAAATCGGTGGTAGACCAAACTTGTCTGCTTCTGGTGCTGGTGTTTGGGACTTCGACAAGAACACTAGATTGTCTGCTGGTGGTTCTTTGTCTACTATGGGTAGAGGTAAGCCAGACGTTGGTGTTCACGCTCAATTCCAACACGACTTCTGAG 3’端)；

第三步、对含有组织型纤溶酶原激活剂全长序列的真核表达载体，质粒pCDS I进行Hind III和Sal I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，纯化约8000bp的DNA片段，得到产物3，为载体片段，见附图8所示的琼脂糖凝胶电泳图，其中双酶切结果图中A为λDNA/HindIII+EcoRI分子量标准，B为pCDS I/HindIII+Sal I；

第四步、将产物1与产物2在T₄DNA连接酶的作用下16℃连接4小时后，加入产物3再连接12小时；

第五步、采用CaCl₂法，将第四步的连接产物转化大肠杆菌JM109，对在100μg/ml氨苄青霉素平板上生长的克隆，提取质粒进行Hind III和Sal I双酶切鉴定，对酶切产物含有530bp片段的质粒再次进行测序鉴定，经测序鉴定表明该序列与所构建的完全一致；大量抽取该质粒，得到抗菌肽葛佬素。

6.采用脂质体转染的方法转染COS-7细胞，在转染后72小时收集细胞上清测定其杀灭大肠杆菌J5菌及中和内毒素的能力。结果表明COS-7细胞转染上清具有杀灭大肠杆菌J5菌及中和内毒素的能力，而质粒空载体转染COS-7细胞转染上清则不具有杀灭大肠杆菌J5菌及中和内毒素的能力。

本发明的重组抗菌肽葛佬素可以用于治疗内毒素血症、G-杆菌感染以及脓毒症、肝硬化等疾病。也可以与其他的药物复配成组合物用于治疗内毒素血症、G-杆菌感染以及脓毒症、肝硬化等疾病。

本发明的重组抗菌肽葛佬素可以辅以药用上可以接受的任何载体或稀释剂用于治疗内毒素血症、G^-杆菌感染以及脓毒症、肝硬化等疾病。

本发明的重组抗菌肽葛佬素或其组合物可以制成片剂、胶囊、注射液或其他的制剂形式。

本发明的重组抗菌肽葛佬素或其组合物可以以口服、口含、喷雾、静脉或肌肉注射的方式给药。