葡萄穗霉属的酚氧化酶

本发明的技术背景

本发明涉及新型酚氧化酶，特别是，来源于葡萄穗霉属的菌株的新型酚氧化酶以及产生这些酶的葡萄穗霉属的新型菌株。本发明提供了用于表达葡萄穗霉属酚氧化酶的方法和宿主细胞以及用于制备表达系统的方法。

发明背景

酚氧化酶的作用是催化氧化还原反应，即，将电子从电子供体(通常是一种酚化合物)转移到分子氧(起着电子受体的作用)，从而将所述分子氧还原成H₂O。虽然能够采用多种不同的酚氧化物作为电子供体，但是酚氧化酶对于作为电子受体的分子氧则是非常特异的。

酚氧化酶可被用于多种用途，包括洗涤剂工业、造纸和纸浆工业、纺织业和食品业。在洗涤剂工业中，在用洗涤剂进行洗涤的过程中，酚氧化酶已被用来防止溶液中的染料从一种织物转移到另一种织物上，该应用通常被称作染料转移的抑制。

大多数的酚氧化酶的最适pH是在酸性pH范围内，而在中性或碱性pH下则失去活性。

已知酚氧化酶由多种真菌产生，包括曲霉属、链孢霉属、Podospora、葡萄孢属、灰侧耳菌属、层孔菌属、射脉菌属、栓菌属、多孔菌属、丝核菌属和香菇属。然而，仍需要鉴别和分离出用于洗涤剂洗涤方法和组合物中其最适pH值在碱性范围内的酚氧化酶和能够自然产生这种酚氧化酶的微生物。

本发明概述

本发明涉及新型酚氧化酶。在一个优选的技术方案中，本发明涉及从葡萄穗霉属中获得的酚氧化酶。特别是，本发明的酶能够减轻与染料以及具有不同化学结构的染色化合物有关的颜色，尤其是在中性或碱性pH下。正是基于它们的这种脱色的能力，本发明的酚氧化酶可以被用于，例如，纸浆和纸张的漂白，用于漂白脱去织物上的污迹颜色以及用于洗涤剂和纺织品应用当中。一方面，本发明的酚氧化酶能够在没有增强剂的条件下减轻染料或染色化合物的颜色。另一方面，本发明的酚氧化酶能够在有增强剂存在的条件下进行脱色。

本发明基于一种编码酚氧化酶的基因组序列(SEQ ID NO：3)的鉴别和定性，所述酚氧化酶从葡萄穗菌属中获得并且具有如SEQ ID NO：2所示的推测氨基酸序列。

因此，本发明提供了与具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的酚氧化酶具有至少68％至100％的相同性，至少68％的相同性，至少70％的相同性，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性的酚氧化酶，条件是所述酶能够减轻与染料或染色化合物有关的颜色。在一个技术方案中，所述酚氧化酶具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列或具有含在保藏号为MUCL 38898的Stachybotryschartarum中的氨基酸序列。

在一个技术方案中，所述酚氧化酶获自于包括Stachybotrysparvispora，Stachybotrys chartarum；S.kampalensis；S.theobromae；S.bisbyi，S.cylindrospora，S.dichroa，S.oenanthes和S.Nilagerica在内的葡萄穗霉的菌种。在另一个技术方案中，所述葡萄穗霉菌种包括Stachybotrys chartarum MUCL 38898和S.chartarum MUCL30782。

在另一个技术方案中，本发明提供了一种编码一种酚氧化酶的分离多核苷酸，其中该多核苷酸含有与SEQ ID NO：1具有至少65％至100％的相同性，也就是说，至少65％的相同性，至少70％的相同性，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性的一种核酸序列，条件是所述多核苷酸编码能够减轻与染料或染色化合物有关的颜色的酚氧化酶。本发明包括在高严紧度条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示多核苷酸杂交的多核苷酸序列，条件是该序列能够减轻与染料或染色化合物有关的颜色。本发明还包括编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸。在一个技术方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核酸序列或者含在Stachybotrys chartarum MUCL 38898中的核酸序列。本发明还提供了含有本发明的多核苷酸的表达载体和宿主细胞。

本发明还涉及制备本发明酚氧化酶的方法。因此，本发明提供了一种包括下列步骤的制备酚氧化酶的方法：在产生所述酚氧化酶的条件下培养含有一种编码酚氧化酶的分离多核苷酸的宿主细胞，所述酚氧化酶的序列与SEQ ID NO：2所示的酚氧化酶氨基酸序列具有至少68％至100％的相同性，也就是说，至少68％的相同性，至少70％的相同性，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性；并且任选地回收所制备的酚氧化酶。在一个技术方案中，所述多核苷酸含有如SEQ ID NO：1所示的序列。在另一个技术方案中，所述多核苷酸含有如SEQ ID NO：3所示的序列。在一个附加的技术方案中，所述多核苷酸在高严紧度条件下与具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示序列的多核苷酸杂交或者与含在Stachybotryschartarum MUCL 38898中的序列杂交。在另一个技术方案中，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有65％至100％的相同性，也就是说，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性。

本发明还提供了一种制备含有编码酚氧化酶的多核苷酸的重组宿主细胞的方法，该方法包括的步骤是：获得一种编码所述酚氧化酶的分离多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO：3具有65％至100％的相同性，也就是说，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性；将所述多核苷酸引进所述宿主细胞；并且在适于产生所述酚氧化酶的条件下培养所述的宿主细胞。在一个技术方案中，所述多核苷酸被整合到宿主基因组中，并且在另一个技术方案中，所述多核苷酸存在于一种复制质粒上。本发明还包括在高严紧度条件下与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3所示多核苷酸杂交的多核苷酸。本发明还提供了编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸。在一个技术方案中，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核酸序列或含在Stachybotrys chartarum MUCL 38898中的核酸序列。

在本发明的一个技术方案中，所述含有编码酚氧化酶多核苷酸的宿主细胞包括丝状真菌、酵母菌和细菌。在另一个技术方案中，所述宿主细胞是包括曲霉菌种、木霉菌种和白霉菌种在内的丝状真菌。在另一个技术方案中，所述丝状真菌宿主细胞包括黑色曲霉变种.泡盛曲霉和Trichoderma reseei.

在本发明的另一个技术方案中，所述宿主细胞是一种包括糖酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属、裂殖糖酵母属、克鲁维氏酵母属和Yarrowia的菌种在内的酵母菌。在另外一个技术方案中，所属糖酵母菌种是啤酒糖酵母。在另一个技术方案，所述宿主细胞是一种包括革兰氏阳性菌如杆菌属，和革兰氏阴性菌如埃希氏菌属在内细菌。

本发明还提供了含有与具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的酚氧化酶具有68％至100％的相同性，也就是说，至少68％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性的氨基酸的酶组合物。在一个技术方案中，所述氨基酸具有如SEQ ID NO：2所式的氨基酸序列。这种酶组合物可被用于，例如生产洗涤剂和其它清洁组合物，纸张和纸浆漂白组合物和织物组合物。

本发明还包括减轻样本上污迹中与染料或染色化合物有关的颜色的方法，该方法包括步骤：将样本与含有一种氨基酸的一种组合物接触，所述氨基酸与具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的酚氧化酶具有68％至100％的相同性，也就是说，至少68％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性，条件是所述酶能够减轻与染料或染色化合物有关的颜色。在一个优选的方法技术方案中，所述氨基酸如SEQ ID NO：2所示。

所述方法中，pH最适值在5.0至11.0之间，优选地，pH最适值在7至10.5之间，以及更优选地，pH最适值在8.0至10之间。另外所述的方法中，最适温度在20至60℃之间，优选地，在20至40℃之间。

附图的主要描述

图1提供了利用实施例5中记载的PCR制备来源于Stachybotryschartarum的酚氧化酶的核酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2提供了在本文中被命名为Stachybotrys氧化酶B基因的氨基酸的氨基酸序列。

图3表示来源于Stachybotrys chartarum的酚氧化酶的基因组序列(SEQ ID NO：3)。该核酸序列在本文中被定义为Stachybotrys氧化酶B基因。

图4是一种葡萄穗霉属酚氧化酶B酶SEQ ID NO：2(底下一行)和胆红素氧化酶(SEQ ID NO：4)的氨基酸排列顺序。

图5提供了一种载体pGAPT2-spoB的构建图谱，该载体被用于在曲霉菌中进行表达。碱基1至1134含有黑色曲霉葡萄糖淀粉酶基因启动子。碱基3098至3356以及4950至4971含有黑色曲霉葡萄糖淀粉酶终止子。作为一个真菌转化标记的沟巢曲霉pyrG基因被插入到3357至4949之间。所述质粒的其余部分含有用于在大肠杆菌中进行繁殖的pBR322序列。编码SEQ ID NO：1的葡萄穗霉属酚氧化酶的核酸被克隆到Bgl II和Age I限制位点中。

图6是一个葡萄穗霉属氧化酶B蛋白在一种复制质粒中进行表达的构建图谱。所述葡萄穗霉属氧化酶的表达受控于曲霉菌的葡萄糖淀粉酶启动子和终止子。所述转化标记pyrG基因和AMA 1序列来源于沟巢曲霉。

图7表示葡萄穗霉属氧化酶B作用于底物2，6 DMP的pH曲线图。

图8表示如实施例1中所述的从离子交换柱上分部收集的Stachybotrys chartarum馏分的非变性(天然的)凝胶电泳(银染)。

图9表示如实施例1中所述的覆盖ABTS的馏分的非变性凝胶电泳。

图10表示从图9所示凝胶的ABTS覆盖层鉴定和分离的SDS-PAGE凝胶电泳带。Stachybotrys chartarum氧化酶B被显示在具有覆盖层2标记的泳道中。泳道覆盖层2表示在所述条件下观察到的Stachybotryschartarum氧化酶B的模式带。

详细描述定义

本文所使用的术语酚氧化酶是指那些能够催化氧化还原反应的酶，在该氧化还原反应中电子供体是一种酚化合物并且对作为电子受体的分子氧或过氧化氢是特异的。本发明获自于Stachybotrys chartarum的举例性酚氧化酶如SEQ ID NO：2所示。本发明包括与具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的酚氧化酶具有65％至100％的相同性，也就是说，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少  85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性的酚氧化酶。本文所使用的相同性是通过GCG软件的GAP程序来测定的(UniversityResearch Park，Madison Wis.)，该程序具有下列参数：间距权重＝12；长度权重＝4；间距创建罚值＝8；和间距延伸罚值＝2。

本文所使用的葡萄穗霉属是指任何产生能够减轻与染料或染色化合物有关的颜色的酚氧化酶的葡萄穗霉属的菌种。本发明包括葡萄穗霉属的天然分离物的衍生物，包括子代和突变体，条件是所述衍生物能够产生一种能够减轻与染料或染色化合物有关的颜色的酚氧化酶。

本文中在涉及酚氧化酶时，术语“获自于”是指来源于或由所述特定微生物菌株天然产生的酚氧化酶。举个例子，获自于葡萄穗霉属的酚氧化酶是指那些由葡萄穗霉菌天然产生的酚氧化酶。本发明包括那些与由葡萄穗霉菌产生的酚氧化酶相同然而是利用基因工程技术由微生物如被编码所述酚氧化酶的基因转化的细菌、真菌或酵母菌产生的或是由与那些来源于葡萄穗霉属的微生物相同的微生物产生的，或者是由那些来源于葡萄穗霉属的微生物的等同物如子代或突变体产生的酚氧化酶。

本发明包括由一种能够在高严紧度条件下与具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：3所示序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的酚氧化酶。本发明包括编码酚氧化酶的多核苷酸，该多核苷酸与含有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸具有至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性。核酸水平的相同性是通过GCG软件的GAP程序测定的(University Research Park，Madison Wis.)，该程序具有下列参数：间距权重＝50；长度权重＝4；间距创建罚值＝50；和间距延伸罚值＝3。本发明还包括含有部分本发明的酚氧化酶的突变体、变异体和衍生物，条件是所述突变体、变异体或衍生物酚氧化酶能够保留天然存在的酚氧化酶的至少一种特性。

本文所使用的术语“染色化合物”是指一种使纺织品着色的物质或者是指产生具有污迹视觉表观的物质。如在《纤维和纺织品技术词典》(Hoechst Celanese Corporation(1990)PO Box 32414，Charlotte N.C.28232)中定义的，一种染料是一种通过化学反应、吸收或分散作用插入到纤维中的染色化合物。染料的实例包括直接染色的蓝染料、酸性蓝染料、直接染色的红染料、反应性蓝或反应性黑染料。通用纺织品染料的目录见颜色索引，第3版，1-8期。产生污迹视觉表观的物质是多元酚、类胡萝卜素、花色素苷、单宁、美拉反应产物等。

本文使用的短语“减轻与染料或染色化合物有关的颜色”或“染色化合物的修饰”是指所述染料或化合物通过氧化反应，直接地或间接地被改变了，使得颜色看起来被减轻了，也就是说，视觉上所述颜色被减弱了、减轻了、脱色了、漂白了或被除去了，或者所述颜色不受影响但所述化合物被修饰了结果使得染料的再沉积受到抑制。本发明包括通过任何方法减轻颜色，所述方法包括，例如通过任何方法彻底去除织物上的污迹中的染色化合物以及减小颜色的强度或改变所述化合物的颜色。

当本文使用的术语“突变体”和“变异体”指的是酚氧化酶时，是指通过改变天然存在的氨基酸序列和/或其结构如通过改变结构基因的DNA核苷酸序列和/或通过直接置换和/或改变氨基酸序列和/或酚氧化酶的结构而获得的酚氧化酶。本文使用的术语酚氧化酶“衍生物”是指天然存在的全长序列的一部分或一个片段或仍保留天然存在的酚氧化酶的至少一种活性的变异酚氧化酶氨基酸序列。当本文所使用的术语“突变体”或“变异体”指的是微生物菌株时，是指由某种形式的自然分离物变化而来的细胞，例如，该细胞具有例如改变的编码酚氧化酶结构基因的DNA核苷酸序列；对自然分离物进行改变是为了提高酚氧化酶的产率；或其它影响酚氧化酶表达的改变。

术语“增强剂”或“调节剂”是指能够减轻与染料或染色化合物有关的颜色的任何化合物，所述染料或染色化合物与酚氧化酶或一种增强酚氧化酶氧化活性的化合物相结合。所述的增强剂通常是指一种有机化合物。酚氧化酶

本发明的酚氧化酶的功能是催化氧化还原反应，即，将电子从电子供体(通常是一种酚氧化物)转移给分子氧或过氧化氢(起电子受体的作用)，从而将过氧化氢还原成水。这种酶的实例是漆酶(EC 1.10.3.2)、胆红素酶(EC 1.3.3.5)、酚氧化酶(EC 1.14.18.1)、儿茶酚酶(EC1.10.3.1)。编码酚氧化酶的核酸

本发明包括编码获自于葡萄穗霉属菌种的酚氧化酶的多核苷酸，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列具有65％至100％的相同性，也就是说，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性，条件是由所述多核苷酸编码的酶能够减轻与染料或染色化合物有关的颜色。在一个技术方案中，所述酚氧化酶具有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列或者具有含在Stachybotryschartarum MUCL 38898中的多核苷酸序列。正如本技术领域的技术人员所能理解的，由于遗传密码的简并性，多种多核苷酸能够编码如SEQ ID NO：2所示的酚氧化酶。本发明包括所有这些多核苷酸。

所述编码酚氧化酶的核酸可以通过本技术领域中已知的标准方法，例如，通过化学合成、通过cDNA克隆、通过PCR、或通过从一种需要的细胞如葡萄穗霉属菌种中纯化的基因组DNA或其片段的克隆来从克隆的DNA(例如，一种DNA“文库”)中获得(参见，例如，Sambrook等.，1989，分子克隆实验指南，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Glover，D.M.(编辑)，1985，DNA克隆：实用方法，MRL出版社，Ltd.，牛津大学，联合王国，I，II期)。来源于基因组DNA的核酸序列除了含有编码区外还可含有调节区。无论是哪种来源，分离到的编码本发明酚氧化酶的核酸应当被分子克隆到用于基因扩增的合适载体中。

在分子克隆来源于基因组DNA的基因过程中，产生了DNA片段，其中的某些DNA片段将编码目的基因。采用不同的限制酶可以在特异性位点对所述DNA进行裂解。或者，可以在有锰存在的条件下采用脱氧核糖核酸酶将DNA裂解成片段，或所述DNA被物理剪切，例如通过超声处理。然后通过标准技术按照大小分离得到的线性DNA片段，所述标准技术包括但不限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱层析。

一旦产生了核酸片段，就可以通过多种方法完成对编码酚氧化酶具有特异性的DNA片段的鉴定。例如，本发明的一种编码酚氧化酶的基因或其特异性RNA，或其片段如一种探针或引物进行分离和标记后被用于检测一种生成基因的杂交分析(Benton，W.和Davis，R.，1977，科学196：180；Grunstein，M.和Hogness，D.，1975，美国国立科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)72：3961)中。含有类似于所述探针基本序列的那些DNA片段在高严紧度条件下将进行杂交。

本发明包括获自于葡萄穗霉属菌种的酚氧化酶，其中该酚氧化酶通过核酸杂交技术来鉴定，该核酸杂交技术以SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3作为探针或引物并且筛选基因组或cDNA来源的核酸。编码获自于葡萄穗霉属菌种的酚氧化酶并且与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少65％的相同性的核酸可以通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交或利用探针、SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的部分或片段进行的扩增来检测。因此，本发明提供了一种检测编码酚氧化酶的核酸的方法，该核酸包含在本发明中且含有与葡萄穗霉属菌种的基因组或cDNA来源的核酸杂交的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的部分或全部核酸序列。

因此，本发明的范围包括能够在高严紧条件下与SEQ ID NO：3所示核酸序列杂交的多核苷酸序列。杂交条件是基于核酸结合复合物的熔解温度(Tm)，如本文中引进作为参考的Berger和Kimmel(1987，分子克隆技术指南，酶学方法(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methodsin Enzymology)，152期，学术出版社(Academic Press)，San DiegoCalif.)中所教导的，并且赋予了一个如下所释的确定术语“严紧度”。

“最大严紧度”通常大约在Tm-5℃(比探针Tm低5℃)；“高严紧度”比Tm低大约5℃-10℃；“中等严紧度”比Tm低大约10℃-20℃；以及“低严紧度”比Tm低大约20℃-25℃。例如，在本发明中下列条件是高严紧度的条件：在37℃下于含有50％甲酰胺，5×SSPE，0.5％SDS和50ug/ml的被剪切的鲱DNA的缓冲液中进行杂交。在65℃下于1×SSC和0.1％SDS存在的条件下冲洗30分钟一次，在65℃下于0.5×SSC和0.1％SDS存在的条件下冲洗30分钟一次以及在65℃下于0.1×SSC和0.1％SDS存在的条件下冲洗30分钟一次；下列条件是中等严紧度的条件：在37℃下于含有25％甲酰胺，5×SSPE，0.5％SDS和50ug/ml的被剪切的鲱DNA的缓冲液中进行杂交。在50℃下于1×SSC和0.1％SDS存在的条件下冲洗30分钟一次，在50℃下于0.5×SSC和0.1％SDS存在的条件下冲洗30分钟一次；下列条件是低严紧度的条件：在37℃下于含有25％甲酰胺，5×SSPE，0.5％SDS和50ug/ml的被剪切的鲱DNA的缓冲液中进行杂交。在37℃下于1×SSC和0.1％SDS存在的条件下冲洗30分钟一次，在37℃下于0.5×SSC和0.1％SDS存在的条件下冲洗30分钟一次。能够在高严紧度的条件下与一种核酸探针杂交的核酸与所述探针具有大约80％至100％的相同性；能够在中等严紧度的条件下与一种核酸探针杂交的核酸与所述探针具有大约50％至80％的相同性。本文使用的术语“杂交”将包括“核酸的一条链通过碱基配对与一条互补链结合的方法”(Coombs J(1994)生物技术词典(Dictionary of Biotechnology)，Stockton出版社，纽约N.Y.)。

在聚合酶链反应(PCR)技术中使用的扩增方法被记载在DieffenbachC W和G S Dveksler(1995，PCR引物实验指南，冷泉港出版社，PlainviewN.Y.)中。来源于SEQ ID NO：3的至少大约10个核苷酸和至多大约60个核苷酸，优选地大约12至30个核苷酸，和更优选地大约25个核苷酸的核酸序列可以被用作一种PCR引物。

从cDNA或基因组文库中分离本发明的核苷酸构建物的优选方法是采用利用简并的寡核苷酸探针的聚合酶链反应(PCR)，所述寡核苷酸探针是在具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质的氨基酸序列的基础上制备的。例如，所述PCR可以利用美国专利US4,683,202中记载的技术来进行。表达系统

本发明提供了用于在宿主微生物如真菌、酵母菌和细菌中产生酚氧化酶的宿主细胞、表达方法和系统。一旦获得了本发明的编码酚氧化酶的核苷酸，就可以利用本技术领域中已知技术来构建含有所述核酸的重组宿主细胞。分子生物学技术被记载在Sambrook等的分子生物学克隆实验指南，第2版(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，(1989)中。获得了编码酚氧化酶的核酸并利用合适的载体将其转化到宿主细胞中，所述编码酚氧化酶的核酸与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示核酸具有至少65％至100％的相同性，也就是说，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性，所述相同性是通过利用GCG软件的GAP程序(University Research Park，Madison，Wis.)并按照下列参数：间距权重＝50；长度权重＝4；间距创建罚值＝50；和间距延伸罚值＝3进行测定的。多种适用于在真菌、酵母菌和细菌中进行克隆、转化和表达的载体以及转化和表达盒对本技术领域的技术人员来说是已知的。

通常，所述载体或盒含有指导所述核酸转录和翻译的序列、一种选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括一个调控转录起始的基因5’区域以及调控转录终止的DNA片段3’区域。这些调控区域可以来源于与所述宿主同源或异源的基因，条件是选择的所述调控区域能够在宿主细胞中发挥作用。

能够用来在一种宿主细胞中启动所述酚氧化酶表达的起始调控区域或启动子对于本技术领域的技术人员来说是已知的。实际上，任何能够启动所述酚氧化酶表达的启动子都适用于本发明。编码所述酚氧化酶的核酸通过起始密码子被可操作性连接在用于有效表达所述氧化或还原酶的选择表达调控区域上。一旦构建出适当的盒，就将其用于转化宿主细胞。

常规的转化方法被记载在最新分子生物学实验方法汇编(第1卷，由Ausubel等编辑，John Wiley & Sons，Inc.1987，第9章)中并且包括磷酸钙方法、利用PEG的转化和电穿孔。PEG和钙介导的原生质体转化(Finkelstein，D B 1992转化.丝状真菌的生物中工程，技术和产品(由Finkelstein & Bill编辑)113-156)可以被用于曲霉属和木霉曲属的转化。原生质体的电穿孔被记载在Finkelstein，D B1992转化.丝状真菌的生物技术.技术和产品(由Finkelstein & Bill编辑)113-156中。对分生孢子的显微投影轰击被记载在Fungaro等.(1995)的“通过对完整分生孢子的显微投影轰击转化构巢曲霉”，FEMS微生物学通讯125293-298页中。土壤杆菌介导的转化被记载在Groot等.(1998)根癌土壤杆菌介导的丝状真菌的转化.自然生物工程16 839-842页中。对于酵母属的转化，本技术领域的技术人员已知有醋酸锂介导的转化以及PEG和钙介导的原生质体转化以及电穿孔技术。

含有本发明酚氧化酶的编码序列并表达所述蛋白的宿主细胞可以通过多种本技术领域的技术人员已知的方法来鉴定。这些方法包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA杂交以及蛋白的生物分析或免疫分析技术，该技术包括用于鉴定和/或定量分析所述核酸或蛋白的基于膜、基于溶液或基于碎片的技术。

如本文所述，将编码获自于Stachybotrys chartarum(MUCL 38898)的酚氧化酶的基因组序列(SEQ ID NO：3)分离出来并且在黑色曲霉变种.泡盛曲霉和Trichoderma reesei中进行表达。酚氧化酶活性

本发明的酚氧化酶能够利用多种不同的酚化合物作为电子供体，同时对作为电子的受体的分子氧或过氧化氢的特异性非常强。

根据特异底物和反应条件，例如，温度、有无增强剂等的存在，每一酚氧化酶的氧化反应将具有各自的最佳pH。酚氧化酶的应用

如下文所述，本发明的葡萄穗霉属酚氧化酶能够氧化多种具有不同化学结构的染料或染色化合物，所述氧化过程成中以氧或过氧化氢作为电子受体。因此本发明的酚氧化酶被用于需要减轻与染料或染色化合物有关的颜色的应用中，如在清洁过程中的应用，用于除去织物上的食物污迹；和用于纺织品；和用于造纸和纸浆。需要一种介质或增强剂来获得需要的效果。染色化合物

在本发明中，多种染色化合物可被用作本发明酚氧化酶的氧化对象。例如，在洗涤剂的应用中，织物上的污迹中的染色物质可以是一种对象。几种类型或种类的染色物质可能产生污迹，如卟啉的衍生结构如血迹中的血红素或植物中的叶绿素；茶污迹、酒污迹、香蕉污迹、桃污迹中的单宁和多元酚(参见P.Ribereau-Gayon，植物酚醛塑料，Ed.Oliver &Boyd，Edinburgh，1972，pp.169-198)；番茄(番茄红素，红色)、芒果(胡萝卜素，桔黄色)中的染色物质类胡萝卜素(G.E.Bartley等.，植物细胞(1995)，第7期，1027-1038页)；许多水果和花中的高度染色分子，花色素苷(P.Ribereau-Gayon，植物酚醛塑料，编辑Oliver & Boyd，Edinburgh，1972，135-169页)；和美拉反应产物，通过在有蛋白/肽成分存在的条件下加热碳水化合物分子的混合物产生的黄/褐色染色物质，诸如在烹饪油中发现的黄/褐色染色物质。增强剂

根据染料或染色化合物的性质，本发明的酚氧化物能够在有或无增强子存在的条件下减轻与所述染料或染色化合物有关的颜色。如果一种化合物能被作为所述酚氧化酶的直接底物，所述酚氧化酶能在无增强子存在的条件下减轻与所述染料或染色化合物有关的颜色，尽管对于酚氧化酶最佳活性来说一种增强子仍然是优选的。对于其它不能作为所述酚氧化酶的直接底物或不能直接被所述酚氧化酶利用的化合物来说，需要一种使酚氧化酶活性最佳化并减轻所述颜色的增强子。

增强子被记载在例如1995年1月12日公开的WO 95/01426；1996年3月7日公开的WO 96/06930；和1997年3月27日公开的WO 97/11217中。增强子包括但不限于吩噻嗪-10-丙酸(PTP)、10-甲基吩噻嗪(MPT)、吩嗪-10-丙酸(PPO)、10-甲基吩嗪(MPO)、10-乙基吩噻嗪-4-羧酸(EPC)、乙酰丁香酮、丁香醛、甲基丁香酯、2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐(ABTS)。培养物

本发明包括能够产生本发明的酚氧化酶的葡萄穗霉属菌株和天然分离物以及这种菌株和分离物的衍生菌株，诸如Stachybotrys parvispora菌种的菌株，特别包括Stachybotrys parvispora变种hughes MUCL38996；Stachybotrys chartarum菌种的菌株，特别包括Stachybotryschartarum MUCL 38898；S.parvispora MUCL 9485；S.chartarum MUCL30782；S.kampalensis MUCL 39090；S.theobromae MUCL 39293；和S.Bisbyi、柱孢葡萄穗霉、S.Dichroa、S.Oenanthes、S.Nilagerica菌种的菌株。

本发明提供了基本生物纯的葡萄穗霉属的新型菌株培养物，特别是从中能够纯化出酚氧化酶的菌株Stachybotrys parvispora MUCL 38996和Stachybotrys chartarum MUCL 38898的基本生物纯的培养物。纯化

本发明的酚氧化酶可以通过在有氧的条件下在含有可同化碳源和氮源与其它必需营养成分的营养培养基中培养产生酚氧化酶的葡萄穗霉菌株(如S.parvispora MUCL 38996，S.chartarum MUCL 38898)来制备。所述培养基可以按照本技术领域已知的原则来配制。

在培养过程中，所述产生酚氧化酶的菌株将酚氧化酶分泌到胞外。这样可以通过例如从培养液中分离细胞物质(例如通过过滤或离心)来实现对所述酚氧化酶的分离和纯化(回收)。得到的不含细胞的培养液可以就这样使用，或者如果需要，可以先进行浓缩(例如，通过蒸发或超滤)。如果需要，所述酚氧化酶可以从所述不含细胞的培养液中分离出来并通过常规方法，例如通过柱层析被纯化到所需的纯度。

通过浓缩所述宿主培养物的上清液以及随后通过硫酸铵分离和凝胶渗透色谱可以从培养液中分离和纯化出本发明的酚氧化酶，其中酚氧化酶被胞外分泌到所述培养液中。

本发明的酚氧化酶可以根据所要进行的应用来配制和使用。在这方面，如果被用于洗涤剂组合物，利用美国专利U.S.4,689,297中记载的方法可以从发酵液中直接配制所述酚氧化酶的涂层固体。而且，如果需要，所述酚氧化酶可以通过适当的载体被配制成液体形式。如果需要，所述酚氧化酶也可以被固定化。

本发明还包括含有本发明的葡萄穗霉酚氧化酶的表达载体和重组细胞以及所述重组宿主细胞中的酚氧化酶的随后纯化。酶组合物

本发明的酚氧化酶可以被用来制备例如用于洗涤或清洁组合物；用于在处理、加工、整理、抛光过程中的纺织品或纤维生产；用于纸和纸浆的生产；和用于淀粉加工应用中的酶组合物。酶组合物也可以含有其它组分，该组分例如被用于配制或作为效能增强子。

例如，洗涤组合物除了所述酚氧化酶还可以含有常规的洗涤剂成分如表面活性剂、助洗剂和其它酶如蛋白酶、淀粉酶、脂酶、角质素酶、纤维素酶或过氧化物酶。其它成分包括增强子、稳定剂、杀菌剂、光学增白剂和香料。所述酶组合物可以是任何适当的物理形式，诸如一种粉末、含水或不含水的液体、一种糊状物或凝胶。

本发明的酚氧化酶就描述至此，提供下列的实施例只是说明性质的，而不是也不应该被理解为是限制性质的。除非另有说明，本文中以百分比形式表示的稀释度、数量等的百分数是每单位体积的重量百分数(w/v)。如本文所使用的以％(v/v)形式表示的稀释度、数量等是指每单位的体积百分数。本文中的温度是摄氏温度(C)。实施本发明的方式和方法通过参考下列实施例可以被本技术领域的技术人员更加充分理解，所述实施例并不意味着以任何方式限制本发明或附在其后的权利要求的范围。本文所参照的所有参考文献和专利出版物被引进本文作为参考。实施例1纯化

该实施例阐明了具有图2所示氨基酸序列的Stachybotryschartarum酚氧化酶的纯化。

在PAD平板(Difco)上将Stachybotrys chartarum培养大约5-10天。一部分平板培养物(大约3/4×3/4英寸)被用来接种装在500ml摇瓶中的100ml的PDB(马铃薯葡萄糖培养液)。该摇瓶在26-28℃和150rpm的条件下温育3-5天一直到达到良好的生长状态。

然后将所述液体培养物接种到装在2.8L摇瓶中的1L的PDB中。该摇瓶在26-28℃和150rpm的条件下温育2-4天一直达到良好的生长状态。

准备一个含有生产培养基(含有g/L的下列组分：葡萄糖15；卵磷脂1.51；叔-乌头酸1.73；KH₂PO₄3；MgSO₄.7H₂O 0.8；CaCl₂.2H₂O 0.1；酒石酸铵1.2；大豆蛋白胨5；Staley 7359；苄醇1；吐温20 1；氨三乙酸0.15；MnSO₄.7H₂O 0.05；NaCl 0.1；FeSO₄.7H₂O 0.01；CoSO₄0.01；CaCl₂.2H₂O 0.01；ZnSO₄.7H₂O O.01；CuSO₄0.001；ALK(SO₄)₂.12H₂O0.001；H₃BO₃ 0.001；NaMoO₄.2H₂O 0.001)的10L发酵罐。然后用1L液体培养物接种所述发酵罐，在28℃下，以5.0L/分钟的恒定速率通入空气并以120RPM的恒定的转速搅拌来进行60个小时的发酵培养。pH维持在6.0。

通过离心从发酵培养液中除去1L液体中细胞并且通过DE过滤器进一步澄清上清液。通过利用Amicon YM10膜和4个体积的含20mM MOPS的缓冲液进行膜渗滤以便除去低分子量的盐。

采用装有25ml的Poros HQ-20树脂的离子交换柱纯化所述酶。该柱首先用5个柱体积(125ml)的20 mM MOPS pH 7.0来进行平衡。将5ml含有5-10mg的总蛋白的样品加载到所述柱上。然后用3个柱体积的MOPS缓冲液冲洗，再用一个体积的250ml中的0-0.5M的梯度硫酸铵进行洗脱。所述流速是10ml/分钟。以5ml的体积收集馏分。采用ABTS方法分析每一馏分中的酚氧化酶活性。对具有ABTS活性的所述馏分在SDS PAGE凝胶上跑电泳。切下凝胶上对应ABTS活性的带并测定其氨基酸序列。

下面的数据来自另一轮的纯化并且表明在SDS PAGE凝胶上存在葡萄穗霉属氧化酶B。在该纯化过程中，发酵的粗产物采用利用HQ20的离子交换柱进行纯化。在4-20％的Tris-甘氨酸凝胶上对馏分进行初步的非变形(天然)凝胶电泳。采用跟踪染料稀释样品并且采用Laemmli缓冲液作为跑胶缓冲液。对所有感兴趣的洗脱峰的馏分采用所述观察纯度的初步凝胶进行电泳并对得到的凝胶进行银染。对每一相同洗脱峰的其它馏分采用证实活性蛋白的第二步凝胶进行电泳并在pH7和pH10采用ABTS进行覆盖。为了进行ABTS覆盖，在pH7和pH10制备4.5mM ABTS(pH7采用50mM醋酸钠和pH10采用50mM硼酸钠)。所述凝胶被分成两部分来进行覆盖：泳道1-5被pH7覆盖以及泳道6-10被pH10覆盖。切下ABTS阳性的带并且用Laemmli缓冲液和含有BME的跟踪染料进行匀质化。然后将样品置于100℃下维持5分钟后加载到4-20％的Tris-甘氨酸梯度凝胶上。跑胶缓冲液采用具有20％SDS的Laemmli。然后将所述凝胶进行银染。

初步变性凝胶、ABTS覆盖凝胶和SDS-PAGE凝胶的结果分别如图8、9和10所示。实施例2Stachybotrys chartarum酚氧化酶的氨基酸序列分析

将实施例1中所制备的Stachybotrys chartarum酚氧化酶进行SDS聚丙酰胺凝胶电泳并进行分离。采用尿素和碘乙酰胺处理分离的成分并用endoLysC酶进行消化。通过endoLysC消化产生的片段采用HPLC(反相单孔(monobore)C18柱，CH3CN梯度)进行分离并利用微滴板来进行收集。通过用于质量鉴定的MALDI对所述馏分进行分析并且通过Edman降解进行序列分析。测定了下列的氨基酸序列并以氨基端到羧基端的方向来表示：N’FVNSGENTSPNSVHLHGSFSR C’(SEQ ID NO：5)N’GVEPYEAAGLKDVVWLAR C’  (SEQ ID NO：6)实施例3克隆基因组核酸

在实施例2提供的肽序列的基础上设计两个简并引物。引物1具有以下序列：GTCAACAGTGGNGARAAYAC以及引物2具有以下序列：GCGGCCTCATANGGCTCNAC，其中N代表所有四种核苷酸(A，T，C和G)的混合物，R代表A和G的混合物以及Y代表T和C的混合物。

为了分离编码酚氧化酶的基因DNA，将从Stachybotrys chartarum(MUCL #38898)中分离到的DNA作为PCR的模板。用Tris-EDTA缓冲液将所述DNA稀释100倍从而使终浓度达到88 ng/ul。将10微升的稀释DNA加到一个eppendorf管中的总体积为100微升的反应混合物中，该反应混合物含有0.2mM的各种核苷酸(A，G.C和T)、1×反应缓冲液，0.542微克的引物1和0.62微克的引物2。在100℃下将所述混合物加热5分钟后，将2.5单位的Taq DNA聚合酶加到所述反应混合物中。PCR反应在95℃下进行1分钟，所述引物在50℃下退火1分钟连接到所述模板上并且在72℃下延伸1分钟。这样的循环反应重复30次后再在68℃下进行一次7分钟的延伸反应。通过琼脂糖凝胶检测到的PCR片段含有一个大约1.3千对碱基的片段，然后将该1.3千对碱基的片段克隆到质粒载体pCR-II(Invitrogen)中。然后对所述1.3kb的插入片段进行核酸测序。由于推导出的肽序列与实施例2中记载的通过Edman降解测序的肽序列相匹配，所以测得的序列数据表明所述片段是编码Stachybotryschartarum酚氧化酶B的基因。然后采用反向PCR方法分离含有5’基因和3’基因的PCR片段，所述反向PCR方法采用了在1.3 kb PCR片段的序列数据的基础上推导出的4个引物。图3提供了含有启动子和终止子的葡萄穗霉属酚氧化酶B基因(spoB)的全长基因组序列(SEQ ID NO：3)。实施例4Stachybotrys chartarum酚氧化酶B与其它氧化酶的比较

翻译的蛋白序列(如2所示)(SEQ ID NO：2)被用作查询检索DNA和蛋白质的数据库。结果表明葡萄穗霉属氧化酶B的蛋白序列与胆红素氧化酶的蛋白序列具有67％的相同性。图4表示通过GCG软件的GAP程序(University Research Park，Madison Wis.)测定的两种蛋白质的序列排列，该程序具有下列参数：间距权重＝12；长度权重＝4；间距创建罚值＝8；和间距延伸罚值＝2。实施例5葡萄穗霉氧化酶B在黑色曲霉变种.泡盛曲霉中的表达

通过PCR分离在侧翼上具有两个新引进的限制酶切位点(BamHI和AgeI)且含有编码葡萄穗霉属酚氧化酶B的核酸的DNA片段。该PCR片段首先被克隆到质粒载体pCR-II上并且通过核酸测序来证实所述的基因序列(图1)。然后将该DNA片段克隆到载体(pGAPT2)的Bgl II至Age I位点之间以便构建一个质粒pGAPT2-spoB，参见图5。所述表达质粒被命名为pGAPT2-spoB(图5)，该质粒能被整合到所述的宿主基因组中。除了插入沟巢曲酶基因组DNA片段AMA1序列(分子微生物学199619：565-574)的5259 bp HindIII片段外，将侧翼上具有两个新引进的限制酶切位点(BamHI和AgeI)且含有编码葡萄穗霉属酚氧化酶的核酸的DNA片段也克隆到与质粒pGAPT2相同的质粒pRAX1中。该表达质粒被命名为pRAX1-spoB(图6)，该表达质粒能被维持作为一个复制质粒，然后利用标准的PEG方法将该质粒转化到曲霉菌株GCAP4(基因1990，86：153-162)中。在不含尿苷的平板上选择转化体。将三个转化体在尿苷平板上培养3天。采用0.01％tween80将由所述转化体长出的孢子重新悬浮在水中。将所述孢子(100,1000或10,000)加到含有160 ul的PROC培养基的96孔微滴板中。在30℃下培养5天后，结果表明这些样品具有ABTS活性。将1000个所述孢子加到250ml摇瓶中的50ml PROC培养基中，然后在30℃下培养3天，ABTS活性是0.33单位/ml。在30℃下培养4天后，ABTS活性是4.8单位/ml。大约1.2×10⁶个孢子也被加到2.8升摇瓶中的1升PROC培养基中。葡萄穗霉属酚氧化酶B蛋白的产生在第3天达到1单位/ml和在第4天达到4单位/ml并且所述活性是利用ABTS分析方法测得的。实施例6酚氧化酶在Trichoderma reesei中的表达

在转化Trichoderma reesei中使用的表达质粒是按照下述方法构建的。图5所示的含有编码葡萄穗霉属酚氧化酶B基因的BamHI至AgeI片段的末端被T4 DNA聚合酶钝化后被插到木霉表达载体pTREX的Pmel限制位点，该载体是PCT出版物WO 96/23928(该文献并入本文参考)中记载的pTEX的修饰变型，该载体含有用于基因表达的CBH1启动子和终止子和一个作为转化选择标记的木霉pyr4基因。从凝胶中分离仅含CBH1启动子、酚氧化酶基因(spoB)、CBH1终止子和选择标记pyr4的线性DNA片段并将该片段用来转化尿苷营养缺陷型菌株Trichoderma reesei(参见美国专利US 5,472,864)，该菌株缺失了4个主要的纤维素酶基因。在不合尿苷的木霉最小平板上分离稳定的转化体。所述转化体在摇瓶中的50ml Proflo培养基中于28℃至30℃下培养4天并且通过实施例8中记载的ABTS分析所述酚氧化酶B的表达。Proflo培养基由下列成分(g/l)组成：Proflo 22.5；乳糖30.0；(NH₄)₂SO₄ 6.5；KH₂PO₄ 2.0；MgSO₄7H₂O0.3；CaCl₂ 0.2；CaCO₃ 0.72；痕量金属原液1.0 ml/l和10％Tween80 2.0ml/l。所使用的痕量金属原液含有(g/l)：FeSO₄.7H₂O 5.0；MnSO₄.H₂O 1.6；ZnSO₄.7H₂O 1.4；CoCl₂.6H₂O 2.8。实施例7葡萄穗霉酚氧化酶B的纯化

从摇瓶中取出按照实施例5中记载的方法获得的葡萄穗霉属酚氧化酶B培养液，冷却到4℃并在Sorval离心机中利用GSA转头以10500rpm离心15分钟。然后将得到的上清液从沉淀中取出并利用从MilliporeCorporation得到的TFF固定器和柱体UF(6 ft^2 PTGC 10K聚醚砜Cat.#CDUF006TG)将所述上清液超滤浓缩6-10倍。通过膜渗透用4个体积的蒸馏(Di)水冲洗所述浓缩物，得到的回收率在40-80％之间。将所述物质再次离心除去固体并通过0.45μ的滤器进行过滤。然后采用阴离子交换柱层析进一步纯化含有滤出液的酶。在此过程中，用pH6.9、50mM的磷酸钾缓冲液平衡Q-Sepharose阴离子交换柱。用pH6.9、20mM的磷酸钾缓冲液将浓缩物(上述酶混合物)稀释成1至4份(总共5份)并以120ml/分钟加载到柱上。用含有300mM NaCl的pH6.9的20mM磷酸钾缓冲液洗脱主要的杂质。接着用含有500mM NaCl的缓冲液以120 ml/分钟的流速洗脱所述柱子。然后分别收集各个馏分。将酚氧化酶活性最高的各个馏分合并在一起，利用带有YM10膜的Amicon浓缩器进行浓缩并渗透到milli-Q中。

然后按照实施例8中记载的内容，利用基于ABTS氧化的标准分析方法测定酚氧化酶活性。如此测得的酶活性在pH5下是61.4U/ml和在pH9下是6.1U/mL。实施例8ABTS分析

下列实施例描述了用于酚氧化活性测定的ABTS分析。所述ABTS分析是一种分光光度活性分析，该分析使用了下列试剂：分析缓冲液＝50mM醋酸钠，pH5.0；50mM磷酸钠，pH7.0；50mM碳酸钠，pH9.0。所述ABTS(2，2’-连氮基双3乙苯噻唑啉-6-磺酸)是一种4.5mM的蒸馏水溶液。将0.75ml分析缓冲液和0.1ml ABTS底物溶液混合后加到比色杯中。将一个含有缓冲液-ABTS溶液用作空白对照。加入0.05ml酶样品快速混合并加到含有缓冲液-ABTS溶液的比色杯中。30℃下15分钟(对于活性比＜0.1的样品视再长些)内测得的420nm下的吸光度变化率为ΔOD 420/分钟。用分析缓冲液将具有高活性比的酶样品稀释到0.1至1的浓度。实施例9番茄污迹的漂白

该实施例说明具有图2所示序列的葡萄穗霉属酚氧化酶在减轻番茄污迹颜色中的用途。

在250ml容器中进行所述实验，将15ml的冲洗液加到该容器(如表中所示)中。冲洗液的pH被调到pH9。将来源于葡萄穗霉属菌种的纯酚氧化酶以6mg/l加到冲洗液中。吩噻嗪-10-丙酸盐(PTP)被用作增强子，浓度为250mM。下列组成被用作冲洗液(2g/L)：洗涤剂组合物：LAS 24％STP 14.5％苏打  灰分17.5％硅酸盐 8.0％SCMC 0.37％蓝色颜料 0.02％含水量/盐 34.6％

在30℃下将所述样品冲洗30分钟。冲洗后，采用滚筒式干燥机将所述样品干燥并利用Minolta分光计测定反射光谱。冲洗前和冲洗后样品间的颜色差异数据被表示为CIELAB L^*a^*b^*颜色间隔。在该颜色间隔中，L^*表示亮度，a^*和b^*表示色度坐标。样品间的颜色差异被表示为ΔE，ΔE通过下面的公式计算： $>>\Delta E>=>>\Delta >>L>2>>+>\Delta >>a>2>>+>\Delta >>b>2>\; >$>

作为ΔE值的结果如下面的表1所示

由ΔE值可以看出，在有所述酶/增强子体系存在的条件下番茄污迹的漂白得到了改善。