检测或测定3,4－亚甲基二氧基脱氧麻黄碱(MDMA)的方法和试剂盒

本发明涉及一种检测或测定MDMA(3，4-亚甲基二氧基脱氧麻黄碱(methylenedioxymethamphetamine))及其亚甲基二氧基(methylenedioxy)类似物的方法和试剂盒。

“检测”的意思是对物质存在或不存在的定性分析。

“测定”的意思是对物质的量的定量分析。

“亚甲基二氧基类似物”的意思是亚甲基二氧基苯异丙胺(MDA)的N-(一-或二-)烷基化(例如，N-甲基化或N-乙基化)衍生物。

本发明描述新型MDMA半抗原衍生物的缀合(conjugation)，与赋予抗原性的载体物质(antigenicity-conferring carrier material)或标记剂共价连接的半抗原，以便分别产生本发明的免疫原或缀合物(conjugate)。本发明还描述了对于这些免疫原产生的抗体如何用于展开特异性试验，该试验用于检测或测定生物流体中的MDMA或亚甲基二氧基(methylenedioxy)类似物鉴定研制中。

本发明的方法和试剂盒对于MDMA具有高度特异性，但是用于除了与亚甲基二氧基类似物如3，4-亚甲基二氧基乙基苯异丙胺(methylenedioxyethylamphetamine)(MDEA)有交叉反应。本发明的方法和试剂盒对于与结构相关的苯异丙胺(amphetamine)和脱氧麻黄碱(methamphetamine)的交叉反应是不明显的。

MDMA、MDEA和MDA的结构在下面给出：

MDMA及其亚甲基二氧基类似物是日益滥用的对神经起显著作用的药物。MDMA的主要代谢物是MDA。但是，以尿的形式排泄的65％的MDMA没有变化。极其频繁地使用的各种秘密产品的化合物是3，4-亚甲基二氧基脱氧麻黄碱(MDMA，1)，也称为Ecstasy，3，4-亚甲基二氧基乙基苯异丙胺(MDEA，2)，也称为Eve，和3，4-亚甲基二氧基苯异丙胺(MDA，3)。这些化合物主要对5-羟色胺系统，其次对多巴胺系统发挥它们的作用。亚甲基二氧基苯异丙胺衍生物的流行可归因于它们作用于神经上的作用。

虽然MDMA、MDEA和MDA通常认为是相对安全的消遣药物，但是使用它们能引起许多不利作用和并发症已经逐渐显著，它们中的一些能够导致致命的结果。此外，已经发现MDMA和MDA会损害迄今为止所有经过实验的实验动物的5-羟色胺神经元，且更严重的是人类使用者有5-羟色胺神经毒性的危险，特别是在大剂量重复使用药物之后。

迄今为止，测定生物流体中MDMA及其亚甲基二氧基类似物主要基于气相色谱-质谱(GC-MS)和HPLC。这些色谱法能够提供很好的灵敏度和选择性，但是需要对MDMA及其亚甲基二氧基类似物进行衍生化。另外，这些方法太昂贵且作为筛选工具使用消耗时间。

特异性的结合反应，如抗体-抗原相互作用，已经广泛地用于免疫测定来检测生物流体中存在的各种物质。

因此，例如，放射免疫测定能够用于测定MDMA及其亚甲基二氧基类似物的量。放射免疫测定非常灵敏，但是需要放射性核素示踪剂，例如¹²⁵I和³H，以及在某些情况，需要预先提取步骤。没有已知的RIAs用于测定MDMA及其亚甲基二氧基类似物。

酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种已知的用于各种苯异丙胺衍生物定性和半定量测定的非放射性替代方法。但是，技术人员能够理解苯异丙胺衍生物没有MDMA的亚甲基二氧基环。因此例如，EP0 399 184 A2(Abbott实验室)描述了通过荧光偏振免疫测定检测和测定苯异丙胺的试剂、方法和试剂盒。EP0 399 184 A2由各种苯异丙胺制备半抗原，免疫原和抗体，它们都没有MDMA的亚甲基二氧基环。EP 0 399 184A2的实施例20证实这些试剂以高于加入的MDMA、MDEA和MDA的浓度计算所表现的交叉反应性低于30％(见表2)。另外，EP-A-820984描述的制备苯异丙胺和脱氧麻黄碱的半抗原、免疫原和抗体，它们的半抗原没有MDMA的亚甲基二氧基环。甚至，EP-A-820984中的半抗原衍生自苯异丙胺的未稠合苯环，然而，相反地，MDMA及其亚甲基二氧基类似物含有与苯环稠合的亚甲基二氧基环。

酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种已知的用于苯异丙胺类的一般测定的非放射性替代方法。特别地，Emit(注册商标)II Plus Monoclonal(Syva公司供给)和Cedia(注册商标)DUA(Microgenetics/Roche供给)皆为对苯异丙胺的EIAs。当相对D-脱氧麻黄碱100％时，对于MDMA(Cedia)各自的交叉反应性为69％，对于MDMA为14.3％(当相对于D，L-脱氧麻黄碱(Emit)为100％时)。

酶联免疫吸附测定(ELISA)也是一种已知的用于MDMA及其亚甲基二氧基类似物的定性和半定量测定方法。

以前从Cozart Bioscience Limited(45 Mliton Park，Abingdon，Oxfordshire，OX14 4RU，英国)获得的MDMA只是筛选检测，它需要通过Cozart称为“更特异性的”的化学替代方法——优选气相色谱/质谱(GC-MS)而确认。因此，当与相对脱氧麻黄碱为100％比较，对于MDMA(758-1250％)，MDEA(50-100％)和N-甲基-1-(3，4-亚甲基二氧基苯基)-2-丁胺(MBDB)(150-200％)，Cozart脱氧麻黄碱EIA(2001年10月得到，nowwithdrawn)显示出明显的交叉反应活性，而当与相对MDMA为100％来比较，用D-脱氧麻黄碱(52-80％)和DL-MBDB(10.4-20％)Cozart MDMA EIA(2001年10月得到，now withdrawn)显示明显的交叉反应活性。这两种Cozart检测方法现在已经被单独的Cozart脱氧麻黄碱试剂盒代替，该试剂盒当与脱氧麻黄碱显示100％交叉反应活性相比时，相对于MDMA显示43-49％的交叉反应活性。

对于各种上文提到的检测方法的交叉反应活性数据已经相对于MDMA为100％重新计算，并且这些数据按照图表的形式在下表中给出：

发明目的：

本发明的目的在于克服现有技术的一些或全部缺点，或者另外提供一种替代物。

本发明优选的具体例子的目的在于提供一种检测或测定MDMA及其亚甲基二氧基类似物数量的方法和试剂盒。

本发明的目的是通过制备对MDMA及其亚甲基二氧基类似物高度特异性的、对d-苯异丙胺和(+)-脱氧麻黄碱的交叉反应不明显的抗体，克服缺乏与已知的MDMA的免疫测定方法相关的特异性问题。“不明显”的意思是(对于d-苯异丙胺和(+)-脱氧麻黄碱任何一个)的交叉反应活性当相对于MDMA为100％时相比，少于大约7.5％，优选低于大约5％，较优选低于大约1％，更优选低于大约0.5％，最优选低于大约0.25％。为了达到这样的特异性，本发明描述的半抗原通过在MDMA的N位上衍生(derivatisation)生成。

本发明优选的具体例子的进一步目的在于研制能够结合结构上的表位，MDMA及其亚甲基二氧基类似物的完整的亚甲基二氧基环的抗体。

发明详述：

本发明描述了一种半抗原，其中与MDMA的N结合的氢原子被交联剂(crosslinker)置换(换句话说，衍生)。

第一方面，本发明提供一种如下结构的免疫原：

其中，R是二价连接基团和X是末端基团(或W₁衔接物(linker))，且其中W₁是赋予抗原性的载体物质。优选地，载体物质是蛋白质、蛋白质片段、合成的多肽或半合成的多肽。

第二方面，本发明提供一种如下结构的缀合物；

其中R是二价连接基团和X是末端基团(或W₂衔接物)，且其中W₂是可检测的标记试剂。优选地，标记试剂选自酶、发光物质、放射性物质或它们的混合物。更优选地，标记试剂是酶，优选过氧化物酶，最优选辣根过氧化物酶(HRP)。换句话说，或者附加地，发光物质可以是生物发光物质、化学发光物质或荧光物质。

在第一和第二方案中的交联剂是-R-X-。

优选地，R包含：

                    -Z_a-Y_b-

其中Z是取代的或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基部分(moiety)或取代或未取代的亚芳基，优选亚苯基部分；Y是取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基部分；a是0或1且b是0或1，条件是a和b不能同时为0。换句话说，Z和Y中的一个或者Z和Y一起必须出现在R中。更优选地，b是0，a是1，和Z是C_1-6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基部分。

最优选地，Z是C_3-4未取代的、直链、饱和的亚烷基部分。

有利地，X在与W₁或W₂反应前选自羧酸或其酯、胺、马来酰亚胺、卤代羧酸或其酯、硫代羧酸或其酯、醛、吡啶基二硫醇或乙烯基砜部分。

更有利地，X在与W₁或W₂反应前选自羧酸(-COOH)、胺(-NH₂)和硫代羧酸酯(-S-CO-CH₃)。

另一方面，本发明涉及对于本发明第一方面的免疫原产生的抗体，这些抗体能够至少与一个MDMA结构上的表位结合，优选与完整的亚甲基二氧基环结构表位相结合。抗体具有对MDMA和其它亚甲基二氧基类似物的特异性。抗体对于结构上相关的苯异丙胺和脱氧麻黄碱的交叉反应活性应低于10％，优选低于5％。更优选低于1％，最优选低于0.5％。优选地，将抗体固定在支撑底物上。优选地，抗体是多克隆的。或者，抗体是单克隆的。

本发明进一步提供一种制备抗体的方法，该方法包含通过重复给予根据本发明的第一方面的免疫原免疫动物，优选脊椎动物，最优选哺乳动物，和收集从免疫动物得到的血清的步骤。优选地，该方法进一步包括将所述血清抗体固定到支撑底物上，优选固体支持物，最优选聚苯乙烯固体支持物。按照这一方法制备的抗体是多克隆的。

更另一方面，本发明包括在试样中检测或测定MDMA及其亚甲基二氧基类似物的方法，该方法包括用本发明的缀合物或其混合物和本发明的抗体或其混合物接触试样；检测或测定结合的缀合物的数量；并且从标准曲线推断试样中MDMA及其亚甲基二氧基类似物的存在或数量。

另一方面，本发明包括检测或测定MDMA及其亚甲基二氧基类似物的试剂盒，该试剂盒包括用本发明的缀合物或其混合物和本发明的抗体或其混合物。该试剂盒可以任意地包括应用所述缀合物和所述抗体在试样中检测或测定MDMA及其亚甲基二氧基类似物的指导。

优选地，试样是溶液，如生物流体。更优选地，试样是血清或尿。最优选地，试样是来自人类患者的溶液。

本发明的方法和试剂盒中，首选各自不同的交联剂(免疫原的和缀合物的)。

另一方面，本发明包括使用本发明的缀合物或其混合物和本发明的抗体或其混合物在试验试样如生物流体中检测或测定MDMA及其亚甲基二氧基类似物。

半抗原的制备

半抗原衍生物N-(3｀-羧基丙基)MDMA(化合物7)，N-(4｀-氨基丁基)MDMA(化合物9)和N-(3-乙酰基硫代丙基)MDMA(化合物10)按照图-1的概要制备。首先从3，4-(亚甲基二氧基)苯乙酸(化合物4)用两步制备3，4-亚甲基二氧基脱氧麻黄碱(化合物1)：将化合物4与乙酸酐/吡啶反应，接下去在乙醇中回流用浓盐酸水解反应中间体得到3，4-(亚甲基二氧基)苯基丙酮(化合物5)。在三乙基胺和氰基硼氢钠的存在下，将化合物5与盐酸甲胺在甲醇中反应得到较高收率的MDMA(化合物1)。半抗原7、9和10从化合物1依下各项获得：

半抗原7

在催化剂碘化钾的存在下，将化合物1与乙基-4-溴丁酸酯(bromobutyrate)在乙腈中回流反应得到化合物6的酯。通过在四氢呋喃(THF)/水中用氢氧化钾皂化化合物6后得到半抗原7，N-(3｀-羧基丙基)MDMA。

半抗原9

将化合物1与(N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺在乙醇中回流反应，接下去通过在甲醇中用水合肼回流水解邻苯二甲酰亚胺基得到半抗原N-(4｀-氨基丁基)MDMA(化合物9)。

半抗原10

通过MDMA(化合物1)与碘代丙基硫代乙酸乙酯(iodopropylthioacetate)在乙醇中回流反应制备得到半抗原10[N-(3｀-乙酰基硫代丙基)MDMA]。

免疫原和缀合物的制备

虽然MDMA半抗原提供确定的结构上的表位(完整的亚甲基二氧基环)，但是它们不能自身致免疫，且因此需要结合到载体物质上，当注射入宿主动物体内时就会引起免疫应答。合适的载体物质包括蛋白质，如白蛋白、血清蛋白，例如球蛋白、接目镜蛋白和脂蛋白。说明性的蛋白质载体包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛γ-球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)等等。或者，可以应用具有足够数目有用的氨基如赖氨酸的合成的聚(氨基酸)、其它合成或天然的带有反应官能基的聚合物材料。特别是能够结合到半抗原产生免疫原的碳水化合物、酵母或多糖。

每个半抗原也能够共价连接标记试剂，如酶(例如，辣根过氧化物酶)，具有荧光性质的物质或放射性标记以产生缀合物(或检测试剂)用于免疫检测。荧光物质可以是，例如一价的荧光素残基或其衍生物。

为了确认载体物质上结合有适当的半抗原，在免疫前，使用矩阵辅助紫外激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对每个免疫原进行评估。对于优选的载体物质即牛血清白蛋白而言，优选每摩尔载体最少6摩尔半抗原。

用半抗原制备缀合物和免疫原时，如果其中存在巯基，例如半抗原10，马来酰亚胺、卤素、吡啶基二硫醇或乙烯基砜必须首先各自引入标记试剂或载体物质，使用异双官能交联剂(heterobifunctional linkers)如(但不限制于)N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)；琥珀酰亚胺基(succinimidyl)4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)；(间-马来酰亚胺苯甲酰基(maleimidobenzoyl))-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS)；琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)；溴代乙酰基-甘氨酸N-羟基琥珀酰亚胺；N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(propionate)(SPDP)；乙烯基砜(vinylsulphone)(美国Pierce化学公司)。这样修饰的标记试剂或载体物质随后能够通过半抗原，例如半抗原10中存在的巯基缀合(conjugate)。对于没有巯基的半抗原，例如半抗原7和9，使用没有事先修饰的标记试剂或载体物质进行缀合，适当的使用缀合的标准方法，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(carbodiimide)(EDC)或混合的酸酐。特别地，通过EDC使半抗原7与例如HRP缀合，通过偏高碘酸钠与半抗原9缀合，随后用氰基硼氢钠还原Schiff碱。

抗血清的制备

为了产生多克隆抗血清，将免疫原与Freund佐剂混合，并且将混合物注射入宿主动物体内，如兔、羊、鼠、天竺鼠或马。进一步注射(加强)并取血清试样评价抗体滴度。但达到最佳滴度时，随后将宿主动物放血得到适当体积的特异性的抗血清。要求的抗体纯化水平视计划的应用而定。对于许多目的，根本不需要纯化，但是，在其它情况下，例如抗体固定在固体载体上，纯化步骤能够除去不想要的物质和除去非特异性的结合。

本发明特异性抗体作为试剂在免疫试验中用于测定或检测生物流体中的MDMA及其亚甲基二氧基类似物的试剂是有用的。

MALDI-TOF分析免疫原的一般方法

使用Voyager STR生物分光度测量方法研究站激光解析质谱与延迟萃取(delayed extraction)结合进行MALDI-TOF质谱。将每个要分析的等分试样在0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液中稀释制成1mg/ml的试样溶液。使用芥子酸基质(matrix)和牛血清白蛋白(Fluka)作为外标分析等分试样(1μl)。附图3显示了BSA载体物质的分析结果。能够看到表示出的主信号显示了该试样平均质子质量m/z66,115。在m/z33,038和132,558观察到的信号与观察到的主要组分的双电体(double charged form)和二聚体形式一致。进一步观察到的信号包括在m/z13,505的。