用于预防香烟中或者发酵食品或酒精饮料中的致癌物质引起的癌诱发和转移的米那利提取物

技术领域

本发明涉及含有预防癌和癌转移的成分的植物米那利(Minari)提取物。更详细地说，本发明涉及对于预防发酵食品和酒精饮料中存在的尿烷(EC(氨基甲酸乙酯))或者香烟中存在的致癌物质NNK[{(4-N-甲基-N-亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮}]诱发的癌和癌转移有用的米那利提取物。

背景技术

已知尿烷和NNK与各种癌的发生有关。

尿烷对于小鼠以用量依存的方式诱发肺癌和肝癌，已经计算出尿烷对人的安全用量(virtually safe dose，VSD)，对于肺癌是1.8×10^-4mg/kg体重，对于肝癌是7.2×10^-5mg/kg体重(K.Inai等，Jpn.J.Cancer Res.82，380～385页，1991年4月)。

在妊娠和催乳期间用尿烷处理过的小鼠的后代会发生通过胎盘传递显著增加的胚胎癌、肺癌和卵巢囊腺瘤，而且对于亲代的妊娠小鼠，也会诱发子宫内膜增生和子宫血管瘤(T.Nomura，Cancer Research，33，1677-1683页，1973，7月)。

口服给药的尿烷对于小鼠会诱发肺癌、淋巴瘤、肝癌、胃乳头瘤、皮脂腺腺瘤、乳房瘤、肺腺瘤、扁平上皮细胞瘤、白血病、间叶瘤等(IARC MONOGRAPHS ON THE EVALUATION OF THE CARSINOGENIC RISCRISK OF CHEMICALS TO MAN，第7卷，111～131页，the views of twoIARC Working Groups on the Evaluation of the CarcinogenicRisks of Chemicals to Man which met in Lyon，1974年2月4日～11日，以及1974年6月18日～24日)。

另外，尿烷通过酒精发酵生成，在葡萄酒等酿造产品中以一定水平含有，因此在加拿大成为限制对象(Ethyl Carbamate in AlcoholicBeverages and Fermented Foods，ACS Symposium Series No.484，Food Safety Assessment，John W.Finley等编，419～428页，American Chemical Society，1992年；Identification of VolatileConstituents from Grapes，J.Agric.Food Chem.，第24卷，第2号，329～331页，1976年；RATIONALE FOR THE ESTABLISHMENT OFGUIDELINES TO LIMIT ETHYL CARBAMATE LEVELS IN ALCOHOLICBEVERAGES，BUREAU OF CHEMICAL SAFETY FOOD DIRECTORATE HEALTHPROTECTION BRANCH，HEALTH & WELFARE CANADA，1～8页；Ethylcarbamate in Fermented Beverages and Foods，Cornelius S.Ough，J.Agric.Food Chem.，第24卷，第2号，323～327页)。

NNK是香烟中潜在的致癌物质之一(Djordijevic，M.V.等，AComparison of selected components in the mainstream smoke ofthe leading U.S.and Japanese cigarettes.In：Proceedings ofthe CORESTA smoke and Technology Meeting，200～217页，1996年，11月3日～8日)。

在癌中，肺癌的发生不问男性女性均持续显著增加。肺癌的发病与吸烟、酒精摄取关系密切。国际癌研究所(The Internationalagency for Research on Cancer)指出吸烟和酒精摄取相互增进消费，并提出通过吸烟和酒精饮料摄取完全摄入的NNK和尿烷是肺癌发病的原因。还指出吸烟与男性由于癌引起的死亡的45％直接相关，与女性的21.5％直接相关。现在认为肺癌引起的死亡作为美国吸烟者死亡的主要原因已经取代了心脏病。

需要一种预防吸烟和酒精摄取致癌的饮食成分。

发明公开

本发明涉及预防癌症发病以及发病后转移的米那利提取物的饮食性成分。

属于伞形科的植物米那利在湿润的土壤或稻子中培养、发育，已知传统上作为解毒剂。已知它通过促进酒精排泄非常有效地解除酒精的毒性。

在中药里，米那利用于治疗黄疸、消化器官疾病、神经病、肥胖。但是，迄今为止尚未发现米那利能够预防癌症的发病，并抑制癌的转移。本发明人等发现米那利提取物的饮食性成分通过抑制潜在的前致癌物质活化，而且除去致癌物质代谢产生的潜在的自由基，并直接除去化学致癌物质中的自由基产生体，米那利提取物对于预防癌非常有效，从而完成了本发明。

本发明提供含有预防癌和癌转移的成分的米那利提取物。

本发明的1种方式中，上述提取物通过溶剂提取制备。在本发明的另一方式中，上述提取物通过热水提取制备。

在本发明的另一方式中，上述组合物选自蓼黄素、金丝桃甙、芸香苷、五羟黄酮、叶绿素、叶黄素、イソハメチン、苯乙基异硫氰酸酯、苯烷基异硫氰酸酯(phenalkylisothiocyanate)、黄酮类、黄酮醇类和d-柠檬烯。

在本发明的另一方式中，上述癌是能够被尿烷或NNK〔{(4-N-甲基-N-亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮}〕诱发的癌。在本发明进一步的方式中，上述癌是肺癌，或者是胎盘转递的癌或胚胎癌。

本发明还提供预防癌和癌转移的组合物，含有米那利提取物以及药学上可以接受的载体。

在本发明的1种方式中，上述组合物为选自粉末、液体、片剂、胶囊、小丸的形态。

附图说明

图1表示对于3个A/J小鼠试验组采用胃管营养法分别将不同量的尿烷单次给药4个月后诱发的肺癌的多重性的不同以及米那利提取物的抑制效果。对于3个试验组，分别以125、250、500mg/kg的用量单次给予尿烷，分别再分成2个小组。一组给予常规饲料(尿烷对照组)，另一组使之自由摄取以5％浓度(w/w)添加了米那利提取物的饲料4个月(尿烷+米那利)。试验结束后，观察各组的肺癌多重发生率(癌变数/小鼠)。

图2表示对于3个A/J小鼠试验组采用胃管营养法分别将不同量的尿烷单次给药4个月后癌基因即细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在肺组织中的表达水平的不同以及米那利提取物的抑制效果。对于3个试验组，分别以125、250、500mg/kg的用量单次给予尿烷，分别再分成2个小组。一组给予常规饲料(尿烷对照组)，另一组使之自由摄取以5％浓度(w/w)添加了米那利提取物的饲料4个月(尿烷+米那利)。试验结束后，测定各组的细胞周期蛋白D1的表达水平。

图3表示对于3个A/J小鼠试验组采用胃管营养法分别将不同量的尿烷单次给药4个月后肺组织中S期(S-phase)细胞周期的PCNA(增殖性细胞核抗原)表达水平的不同以及米那利提取物的抑制效果。对于3个试验组，分别以125、250、500mg/kg的用量单次给予尿烷，分别再分成2个小组。一组给予常规饲料(尿烷对照组)，另一组使之自由摄取以5％浓度(w/w)添加了米那利提取物的饲料4个月(尿烷+米那利)。试验结束后，测定各组的肺组织中的PCNA水平。

图4表示对于3个A/J小鼠试验组采用胃管营养法分别将不同量的尿烷单次给药4个月后肺组织中分离DNA的8-OH脱氧鸟苷的水平以及米那利提取物的抑制效果。对于3个试验组，分别以125mg/kg(数据未表示)、250mg/kg、500mg/kg(数据未表示)的用量单次给予尿烷，分别再分成2个小组。一组给予常规饲料(尿烷对照组)，另一组使之自由摄取以5％浓度(w/w)添加了米那利提取物的饲料4个月(尿烷+米那利)。试验结束后，测定各组的肺组织中的分离DNA的8-OH脱氧鸟苷水平。

图5表示对于4个A/J小鼠试验组分别将不同量的香烟的烟中潜在的致癌物质即NNK〔{(4-N-甲基-N-亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮}〕单次腹腔给药4个月后诱发肺癌的多重性以及米那利提取物的抑制效果。其中，4个试验组是指NNK对照组(给予4mg NNK)、以3种不同的给药量(以1.25、2.5、5％w/w将米那利添加到饲料中)使之自由摄取米那利的3个组。

图6表示3组的肺组织中癌基因即细胞周期蛋白D1的表达水平以及米那利提取物的抑制效果，其中，这3组是作为对照组的在腹腔内给予水后使之自由摄取常规饲料4个月的组(CTL)，单次腹腔给予NNK(4mg)后使之自由摄取常规饲料4个月的组(图中以0表示)，以及单次腹腔给予NNK(4mg)后使之自由摄取添加了米那利提取物的饲料(1.25％，w/w)4个月的组。

图7表示对照组(水)、NNK对照组、NNK-米那利给药组(1.25％，w/w)3个试验组的肺组织的S期的PCNA(增殖性细胞核抗原)表达水平上的不同以及米那利提取物的抑制效果。NNK组单次给予4mg的NNK。对于NNK-米那利给药组，单次给予NNK后，以1.25％(w/w)浓度在饲料中添加米那利提取物，并对其它组给予常规饲料，分别使之摄取4个月。试验结束后，测定各组的肺组织中的PCNA水平。

发明的最佳实施方式

本发明使用的用语“米那利”是指属于伞形科〔family Apiaceae(Umbelliferae)〕的植物中，代表性地属于水芹属的韩国原产dor-米那利。

用语“米那利提取物”是指由米那利植物体(叶、茎、根)通过以下记载的提取溶剂，通常为去离子水，提取得到的液体以及含有将其冷冻干燥得到的粉末的固体。

米那利提取物可以按照一般广泛应用的方法制备。例如，首先将米那利洗净，干燥，粉碎成粉末。接着，使用各种溶剂进行提取。一般，提取溶剂相对于米那利粉末添加2～10倍重量。而且，作为其提取溶剂，可以例举水、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、1，3-丁二醇、乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、甲醇。代表性地是使用水制备米那利提取物。也可以将上述溶剂中的2种以上混合使用。

代表性的是，米那利提取物和溶剂的混合物在室温下使用电磁搅拌器等(100～500rpm的旋转数)搅拌的同时进行提取。例如使用去离子水，在70℃下连续搅拌24小时进行提取。之后，分离去离子水，冷冻干燥。以其冷冻干燥的粉末作为米那利提取物。这样制备的米那利提取物中含有的成分可以采用本领域技术人员公知的HPLC(高效液相色谱法)分离，然后采用NMR法(核磁共振分析法)鉴定分离得到的成分。

本发明人等通过NMR分光法确认这样得到的米那利提取物中含有蓼黄素(persicarin)、金丝桃甙(hyperoside)、芸香苷(rutin)、五羟黄酮(quercetin)、叶绿素(chlorophyll)、叶黄素(xanthophyll)、isohamenetin、苯烷基异硫氰酸酯(phenalkylisothiocyanate)、苯乙基异硫氰酸酯(phenethylisothiocyanate)、黄酮类(flavons)、黄酮醇类(flavonols)和d-柠檬烯(d-limonene)。

这些天然物质中的几种作为抗氧化剂是已知的，这些成分协同作用预防癌变。因此，含有这些成分的米那利提取物能够捕获超氧化物和羟基自由基等各种自由基，从而抑制NNK(多环式芳香族烃(polyaromatic hydrocarbons)、氮杂芳烃(aza-arenes)、芳香族胺(aromatic amine)、烷基醛缀合物(conjugatedalkylaldehyde)、甲醛(formaldehyde)、NO、尿烷(urethane)和烟碱(nicotine)、亚硝基胺(nitrosamine)等致癌性化学物质中潜在的致癌物质)、尿烷(发酵食品和酒精饮料中的氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate)、氨基甲酸烷基酯(alkyl carbamate))等诱发的肺癌和转移瘤。或者，这些成分能够抑制各种癌基因的表达。

米那利提取物可以单独使用，也可以与Ostericum coreanum、Oenanthe stolinifera、水芹(Oenanthe javanica)配合使用。

米那利提取物可以制成干燥粉末剂、添加到食品中的添加剂和饮料剂、胶囊剂、片剂、使用一般粘合剂制备的小丸剂等剂型使用。以下，在实施例中叙述本发明涉及的方法论的详细内容，但是并没有限定权利要求范围的意图。

例如本发明以针对发酵食品和酒精饮料中存在的致癌物质和/或香烟中存在的潜在致癌物质的各种给药剂型的米那利提取物的治疗研究为基础。但是，本发明人和申请人也可以将本发明适用于其他类型的癌和转移癌(包括其它致癌物质引起的癌)的预防。而且，也可以改变试验设计及其草案实施。

可以通过考察含有各种浓度的米那利提取物的饲料是否影响尿烷处理后的小鼠肺组织中的细胞周期蛋白D1基因的表达水平进行确认。另外，本发明的米那利提取物对癌和癌转移的预防效果也可以通过考察含有各种浓度的米那利提取物的饲料是否影响致癌性尿烷处理后的小鼠肺组织中的PCNA(增殖性细胞核抗原)的表达水平进行确认。

而且，本发明的米那利提取物对癌和癌转移的预防效果也可以通过测定致癌性尿烷处理后的小鼠肺组织中的8-OH脱氧鸟苷，考察含有各种浓度的米那利提取物的饲料抑制对DNA的氧化性损伤的程度进行确认。而且，本发明的米那利提取物对癌和癌转移的预防效果也可以通过考察含有各种浓度的米那利提取物的饲料是否阻止香烟中潜在的致癌性物质NNK处理后的小鼠的肺癌发生进行确认。

而且，本发明的米那利提取物对癌和癌转移的预防效果也可以通过考察含有各种浓度的米那利提取物的饲料对香烟中潜在的致癌性物质NNK处理后的小鼠肺组织中的PCNA(增殖性细胞核抗原)的表达水平的抑制程度进行确认。

以下，结合实施例说明本发明。

(实施例1：米那利提取物对尿烷活性的有效抑制)

(步骤1：肺癌预防)

将A/J小鼠分为3组，对于各组采用胃管营养法单次给予人的尿烷暴露水平的10000、20000和40000倍(125、250和500mg/kg体重)的尿烷。

接着，将各组再分为2个试验组。一组(米那利处置组)适当给予添加干燥米那利提取物达到饲料的5％得到的饲料4个月，另一组(尿烷对照组)给予常规饲料。其结果如图1所示，肺癌发生率在米那利处置组中显著减少(p＜0.05)。

(步骤2：对癌变基因细胞周期蛋白D1表达水平的抑制)

将A/J小鼠分为对照组和尿烷给药组。再将尿烷给予组分为3组，对于各组以125、250和500mg/kg的给药量给予尿烷。再将尿烷给药后的各组分为2个试验组。一组(尿烷单独给药组)给予常规饲料，另一组(尿烷+米那利组)给予以5％浓度添加了米那利提取物的饲料4个月。测定试验结束时细胞周期蛋白D1的表达水平(第91癌学会发表论文No.5313：I.P.Lee，Pulmonary cyclin D1-induction byFumonisin B1 in Female A/J mice，2000年4月15日)。结果如图2所示。尿烷单独给药组与米那利处置组相比显示4倍高的结果。

(步骤3：对PCNA表达的抑制)

将A/J小鼠分为对照组和尿烷给药组。再将尿烷给予组分为3组，对于各组以125、250和500mg/kg的给药量给予尿烷。再将尿烷给药后的各组分为2个试验组。一组(尿烷单独给药组)给予常规饲料，另一组(尿烷+米那利组)给予以5％浓度添加了米那利提取物的饲料4个月。测定试验结束时细胞周期的S期的PCNA(增殖性细胞核抗原)(第91癌学会发表论文No.5313：I.P.Lee，Pulmonary cyclinD1-induction by Fumonisin B1 in Female A/J mice，2000年4月15日)。结果如图3所示。尿烷单独给药组的PCNA水平与尿烷+米那利组相比上升4倍。

(步骤4：由8-OH脱氧鸟苷浓度表示的对DNA损伤的抑制)

将A/J小鼠分为对照组和尿烷给药组。再将尿烷给予组分为3组，对于各组以125、250和500mg/kg的给药量给予尿烷。再将尿烷给药后的各组分为2个试验组。一组(尿烷单独给药组)给予常规饲料，另一组(尿烷+米那利组)给予以5％浓度添加了米那利提取物的饲料4个月。测定试验结束时8-OH脱氧鸟苷的浓度。结果如图4所示。米那利处置组的8-OH脱氧鸟苷浓度与尿烷单独处置组相比显著减少。

(实施例2：有效抑制NNK活化预防癌的米那利提取物)

(步骤1：肺癌发生的阻止)

将香烟中潜在的致癌物质NNK给予NNK单独给药(+常规饲料)组、NNK给药+米那利添加饲料(1.25、2.5和5％(w/w))合计4组的A/J小鼠。其中，NNK的给药量相当于1盒香烟持续吸100年以上的量(Djordijevic，M.V.等，Comparison of selected componentsin the mainstream smoke of the leading U.S.and Japanesecigarettes.In：Proceedings of the CORESTA smoke andTechnology Meeting，200～217页，1996年，11月3日～8日)。4个月后测定A/J小鼠的肺癌多重性。

结果如图5所示，将米那利提取物作为粉末给予2.5g和5％的组的癌发生率显著降低(p＜0.05)。

(步骤2：对癌基因细胞周期蛋白D1的抑制)

将A/J小鼠分为水单次腹腔给药(+常规饲料)组、NNK(4mg)单次腹腔给药(+常规饲料)组、或NNK单次腹腔给药(+添加米那利提取物使浓度达到1.25％的饲料)3个试验组。4个月后，测定各试验组的癌基因即细胞周期蛋白D1的表达水平。结果如图6所示，米那利处理组的癌基因之一细胞周期蛋白D1的表达水平与NNK对照组相比，减少至半量以下(p＜0.05)。由此表明米那利提取物在细胞周期蛋白D1表达方面显著抑制NNK活性。

(步骤3：对PCNA表达的抑制)

将A/J小鼠分为水单次腹腔给药(+常规饲料)组、NNK(4mg)单次腹腔给药(+常规饲料)组和NNK单次腹腔给药(+添加米那利提取物使浓度达到1.25％的饲料)3个试验组。4个月后，测定各试验组的PCNA表达水平。结果如图7所示，PCNA表达水平与水单独给药组相比，在NNK处理组中显著上升。另一方面，对NNK给药进行了米那利处理(饲料中1.25％，w/w)的组与水给药组相比，显著抑制了PCNA表达水平(p＜0.05)。工业实用性

本发明人确认米那利提取物能够抑制致癌性食物和酒精饮料中存在的尿烷以及香烟中存在的NNK〔{(4-N-甲基-N-亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮)〕诱发的肺癌，从而完成了本发明。作为米那利提取物预防癌的可能的机理，认为是阻断前致癌物质活化成更有活性的致癌物质的阶段，且通过米那利提取物中的大量自由基清除剂除去香烟中或酒精饮料中存在的游离基。而且，本发明的目的在于通过使用含有非常有效的化学预防物质的米那利提取物的饮食性成分，代表性地预防以肺作为标的的致癌物质引起的肺癌的发病和作为其结果发生的癌转移。

如实施例中详细说明的那样，米那利提取物潜在地预防发酵食品、酒精饮料、香烟中存在的致癌物质诱发的肺癌或其他癌，在医药产业中非常重要。