免疫反应测定方法以及方法中使用的免疫反应测定用试剂盒

具体实施方式

象上述那样在对样品中被测定物质含量进行测定的免疫反应测定方法中，由被测定物质引起抗原抗体反应，并且由反应后的反应体系的光学特性的测定值可以算出被测定物质的量。

本发明人等在进行上述测定时发现可以获得高的测定值(即，测定灵敏度高)的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒。另外还发现了利用本发明人发现的该免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒可以缓和在抗原过剩区产生的区带现象(Zone Phenomenon)。

以下参照图1对本发明的实施方式进行说明。图1是表示本实施方式的免疫反应测定方法的各工序的工艺流程图。在本说明书中，用语「测定值」只要没有特别记载的话，与信号强度意思相同。

首先，在图1所示的工序St1中，构建含有要对被测定物质的含量进行测定的样品、与被测定物质特异结合的特异结合物质以及苯二甲酸或苯二甲酸盐的反应体系。此时上述反应体系的pH设定为低于7。而被测定物质是抗原时，特异结合物质是抗体，被测定物质是抗体时，特异结合物质是抗原。

依照这样的工序，当样品中含有被测定物质时，通过被测定物质和特异结合物质的抗原抗体反应会生成凝集复合物。当样品中不含有被测定物质时，就不会通过被测定物质和特异结合物质的抗原抗体反应生成凝集复合物。

在图1所示的工序St2中，对反应体系的光学特性进行测定。此时，当在上述工序St1中生成凝集复合物时，上述反应体系出现浑浊、散射光强度以及光透过量等都发生变化。因此通过测定散射光强度以及光透过量等可以估计反应体系的浑浊程度。在此最好是将从上述反应体系中除去特异结合物质后的反应体系作为基准，对上述反应体系的光学变化量、即散射光或光透过量进行测定。另外也可以将从反应体系中除去样品后的反应体系作为基准。

通过实施上述工序，可以使因抗原抗体反应生成的凝集复合物引起的反应体系的光学特性的测定值提高。因此利用本实施方式的免疫反应测定方法可以高灵敏度地测定被测定物质的量。获得这样效果的理由现阶段还不清楚，但本发明人推测存在下述理由。参照图2对该推测进行说明。

认为苯二甲酸或苯二甲酸盐无论哪一个在水溶液中都是以苯二甲酸或苯二甲酸离子形式存在的。认为苯二甲酸或苯二甲酸离子无论哪一个都有极性，具有在水溶液中容易吸附水分子的性质。因此通过在上述反应体系中添加苯二甲酸或苯二甲酸盐，水分子聚集在苯二甲酸或苯二甲酸离子的周围。因此就象图2所示的那样，存在于抗体分子周围的水分子显著减少，抗体分子的局部存在比率增大。由此认为抗原和抗体之间的冲突增加，促进了抗原抗体反应。其结果也促进了凝集复合物的形成，提高了反应体系的光学特性的测定值。

如上所述，利用以往的添加水溶性高分子的方法，为了使测定值提高，并维持良好的S/N比，进行稳定的测定，需要添加高浓度或高分子量的水溶性高分子。因此，存在着使溶液的粘性增大，其分析操作上的处理变得困难的不好状态。然而在本实施方式中由于使用的苯二甲酸或苯二甲酸盐是低分子物质，不会使溶液的粘性增大，其测定操作的处理也变得容易。

另外利用本实施方式的免疫反应测定方法，可以缓和抗原过量存在时产生的区带现象(Zone Phenomenon)。以下参照图3进行说明。图3(a)和(b)是表示均一体系的免疫反应测定方法的反应体系中抗原和抗体的反应方式的模式图。

一般来说，人们知道如果利用均一体系的免疫反应测定方法，会发生称之为区带现象的现象。如图3(a)所示，如果利用通常均一体系的免疫反应测定方法，会生成抗原与抗体交替结合形成的巨大的分子链的凝集复合物。所谓区带现象就象图3(b)所示那样，相对于抗体，抗原存在的量比抗原和抗体形成最大量的凝集复合物的当量区还过剩时，凝集复合物变得难于形成的现象。多价抗体和2价以上抗原之间的结合反应，Heidelberger等人的格子学说是有名的，Fundamental Immunology，William E.Paul编(1984)(邦译基础免疫学，多田富雄监译，第714-716页(1987))文献中有详细记载。

在不发生区带现象的抗体和抗原的浓度范围中，如图(a)所示那样，会生成抗原与抗体交替结合形成的巨大的分子链的凝集复合物。此时如果抗体浓度一定，该凝集复合物的量和大小依赖于抗原浓度而增加。因此，通过将该凝集复合物的量和大小作为光学的变化量进行测定，可以定量测定抗原浓度。另外，凝集复合物由于抗体和抗原的浓度关系，作为溶液中的浑浊或凝集物即使用肉眼也可以充分确认，因此通过目视也可以进行定性判定。

然而，在实际的均一体系的免疫反应测定方法中，往往使用抗体测定抗原浓度。在比抗原浓度低的情况高时，测定值往往具有重要的意义。可是当抗原浓度与抗体相比过剩时，就象图3(b)所示那样，抗体的结合部位被抗原饱和的抗体量增加，凝集复合物产生变得困难。因此，在抗原低浓度情况与抗原过剩情况之间对抗原抗体反应的结果进行区别变得困难。因此担心不能进行依赖于抗原浓度的正确定量以及判定，或者说，要进行依赖于抗原浓度的正确定量以及判定会产生所谓的测定浓度受到限制的不良状况。这样一来，由于抗原过量存在产生的区带现象往往是均一体系的免疫反应测定方法中不良状况的一个原因。

然而，利用本实施方式的免疫反应测定方法，可以缓和抗原过量存在时产生的区带现象。如上所述，这是由于通过在上述反应体系中添加苯二甲酸或苯二甲酸盐，促进凝集复合物形成的缘故。

另外利用本实施方式的免疫反应测定方法，由于可以缓和区带现象，所以可以减少被测定物质在高浓度下的测定值的下降。由此可以扩展能够正确测定被测定物质的含量的测定浓度范围。

以下就各个工序进行详细的说明。

在工序St1中，如上所述，构建含有被测定物质、与被测定物质特异结合的特异结合物质以及苯二甲酸或苯二甲酸盐的反应体系。此时反应体系中可以同时含有苯二甲酸和苯二甲酸盐。当然，反应体系中无论含有苯二甲酸或苯二甲酸盐哪一种都可以。

另外在工序St1中，通过反应体系中含有的苯二甲酸或苯二甲酸盐赋予缓冲能力，最好将反应体系的pH设定为低于7。这样一来，由于反应体系的pH设定为低于7，因此不添加其他缓冲剂，也可以有效地发挥上述的提高测定值的效果以及缓和区带现象的效果。为了通过苯二甲酸或苯二甲酸盐赋予反应体系缓冲能力，苯二甲酸或苯二甲酸盐的浓度最好在0.01M以上。

在本实施方式的免疫反应测定方法中，工序St1中反应体系的pH优选为4.5～5.5范围，更优选4.5～5.3范围，特别优选在4.5～5.0范围。在上述pH范围内，上述的测定值提高效果变好，另外区带现象的缓和效果也变好。特别是反应体系的pH调整在4.5是最理想的。

在本实施方式的免疫反应测定方法中，工序St1中反应体系的苯二甲酸或苯二甲酸盐浓度最好是在0.2M以下。这样一来，上述的测定值提高效果变得更好，另外区带现象的缓和效果也变得更好。为了进一步提高这些效果，反应体系的苯二甲酸或苯二甲酸盐浓度在0.1M以下比较好，特别是为了使上述效果显著提高，最好是将反应体系的苯二甲酸或苯二甲酸盐浓度大致调整在0.1M。

另外在工序St1中，反应体系可以进一步添加别的缓冲剂。本实施方式的免疫反应测定方法中可以使用的缓冲剂是该领域中众所周知的缓冲剂。例如，可以举出由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠构成的磷酸系缓冲剂、乙酸钠、二甲胂酸钠、2-(N-吗啉代)乙磺酸、琥珀酸等。添加缓冲剂时，反应体系应当含有的缓冲剂的量可以根据使用的缓冲剂的种类、含有被测定物质的样品(检体)的量、以及针对反应体系中作为被测定物质的抗原或抗体的抗体或抗原的供给方法等适当调整。

作为本实施方式的免疫反应测定方法中使用的苯二甲酸或苯二甲酸盐，可以举出苯二甲酸、苯二甲酸酐、苯二甲酸氢钾、苯二甲酸钾、苯二甲酸二钠、苯二甲酸铵、苯二甲酸铜(II)等。这些试剂都有销售，容易获得。这些试剂可以单独或搭配起来用。其中作为本实施方式的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒中使用的苯二甲酸盐，从对水的溶解性高、而且溶解时的水溶液的pH在4.0附近的观点出发，优选苯二甲酸氢钾。

而苯二甲酸存在着o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸(对苯二甲酸)异构体。在本实施方式中，可以使用o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸的混合物。单独使用对水溶解性高的o-苯二甲酸最好。使用苯二甲酸盐情况也与苯二甲酸情况一样，可以使用o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸的盐的混合物。单独使用对水溶解性高的o-苯二甲酸盐最好。

另外在本实施方式的免疫反应测定方法中，根据其用途等在获得上述效果的范围内可以添加该领域中众所周知的其他任意成分。例如在适用于散射测浊法、比浊法、玻片凝集法等均一体系的免疫反应测定法的场合，可以向本发明的免疫反应测定方法的反应体系中添加聚乙二醇(PEG)。从非特异凝集少、测定灵敏度高的观点出发，在本实施方式中相对于上述的反应体系，优选聚乙二醇含量为2～6重量％浓度，更优选4重量％浓度。

另外为了减少由于抗原或抗体自身凝集引起的非特异浑浊，可以向本实施方式的反应体系中加入Tween 20、辛基糖苷、十二烷基硫酸钠(SDS)、蔗糖单月桂酸盐、CHAPS等表面活性剂。其含量从减少抗原抗体反应阻碍的观点出发，在本实施方式中，相对于反应体系优选在0.3％(w/v)以下，更优选0.1％(w/v)以下。

在本实施方式的免疫反应测定方法的工序St2中，适用于测定反应体系的光学特性的测定方法没有特别限定。特别是使用会引起区带现象的散射测浊法、比浊法、玻片凝集法等均一体系的免疫测定方法，预料可以获得更好效果。另外适用于通过自动测定仪器进行测定已经普及的散射测浊法或比浊法的场合，由于可以削减或简化在区带现象判定中需要的工序，所以特别理想。

在本实施方式的免疫反应测定方法中，抗原-抗体复合物优选是凝集复合物。另外在工序B中，优选是通过对起因于凝集复合物的光学上的变化量进行测定可以对上述凝集复合物进行检测，更优选光学上的变化量为散射光强度或光透过量的变化量。

本实施方式的免疫反应测定方法，其代表性的作法可以通过以下方式进行。将苯二甲酸或苯二甲酸盐加入到含有缓冲剂的缓冲液中，最终使反应体系的pH保持在酸性，pH保持在4.5～5.5比较好，pH保持在4.5更好。此时加入的苯二甲酸或苯二甲酸盐的浓度，使抗原抗体反应时的浓度变为0.2M以下，优选0.1M以下，特别优选0.1M的浓度。苯二甲酸或苯二甲酸盐也可以充当缓冲剂。通过依次向上述缓冲液中添加要测定的被测定物质的含量的样品(检体)和含有特异结合物质的溶液并进行混合构建反应体系，以样品作为基准测定反应体系的光学上的变化量。

而添加苯二甲酸或苯二甲酸盐的方法、为了将反应体系保持在酸性而添加缓冲剂的方法、以及调整反应体系的pH的方法并不限定于上述作法。例如为了满足上述必要的条件，首先可以在含有特异结合物质的溶液中混合苯二甲酸或苯二甲酸盐，然后再混合缓冲剂。

以下就本实施方式的免疫反应测定方法中使用的免疫反应测定用试剂盒进行说明。

本实施方式的免疫反应测定用试剂盒制备成含有与被测定物质特异结合的特异结合物质；苯二甲酸或苯二甲酸盐；用于将含有被测定物质、特异结合物质以及苯二甲酸或苯二甲酸盐的反应体系的pH设定在7以下的缓冲剂。被测定物质和上述特异结合物质的组合是抗原和抗体的组合。

通过将本实施方式的免疫反应测定用试剂盒添加到要对被测定物质的含量进行测定的样品中，在图1所示的工序St1中可以构建含有要对被测定物质的含量进行测定的样品、与被测定物质特异结合的特异结合物质和苯二甲酸或苯二甲酸盐的反应体系。当样品中含有被测定物质时，通过被测定物质和特异结合物质之间的抗原抗体反应会生成凝集复合物。当样品中不含有被测定物质时，就不会通过被测定物质和特异结合物质之间的抗原抗体反应生成凝集复合物。

因此通过使用本实施方式的免疫反应测定用试剂盒实施图1所示的各个工序，可以使由于抗原抗体反应生成的凝集复合物引起的反应体系的光学特性的测定值提高。就是说，通过使用本实施方式的免疫反应测定用试剂盒可以以高测定灵敏度测定被测定物质的量。另外由于本发明中使用的苯二甲酸或苯二甲酸盐是低分子物质，不会使反应体系的粘性增大，其测定操作上的处理变得容易。

另外，存在的抗原与抗体相比过量时产生的区带现象也可以缓和。由于区带现象被缓和，在被测定物质的高浓度下的测定值的下降被减少。因此可以使能够正确测定被测定物质的含量的测定浓度范围扩展。

这里的本实施方式的免疫反应测定用试剂盒可以既含有苯二甲酸的同时也可以含有苯二甲酸盐。而苯二甲酸或苯二甲酸盐可以赋予反应体系缓冲能力，上述工序St1的反应体系的pH优选调节为低于7。即，优选苯二甲酸或苯二甲酸盐也起着缓冲剂的作用。

另外，本实施方式的免疫反应测定用试剂盒也可以含有别的缓冲剂。这样的缓冲剂可以是该领域中众所周知的缓冲剂。例如可以举出由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠构成的磷酸系缓冲剂、乙酸钠、二甲胂酸钠、2-(N-吗啉代)乙磺酸、琥珀酸等。此时缓冲剂的量可以根据使用的缓冲剂的种类、含有被测定对象物的样品(检体)的量、以及针对反应体系中作为被测定物质的抗原或抗体的抗体或抗原的供给方法等适当调整。

另外本实施方式的免疫反应测定用试剂盒，在工序ST1中反应体系的pH调整在4.5～5.5范围比较好，调整在4.5～5.3范围更好，最好是调整在4.5～5.0范围。在上述pH范围内，上述的测定值提高效果变好，另外区带现象的缓和效果也变好。特别是反应体系的pH大致调整在4.5是最理想的。

本实施方式的免疫反应测定用试剂盒，在工序St1的反应体系中的苯二甲酸或苯二甲酸盐浓度最好调整是在0.2M以下。这样一来，上述的测定值提高效果变得更好，另外区带现象的缓和效果也变得更好。为了进一步提高这些效果，反应体系的苯二甲酸或苯二甲酸盐浓度调整在0.1M以下更好，特别是为了使上述效果显著提高，将反应体系的苯二甲酸或苯二甲酸盐浓度最好调整在0.1M。

作为本实施方式的免疫反应测定用试剂盒中含有的苯二甲酸或苯二甲酸盐，可以举出苯二甲酸、苯二甲酸酐、苯二甲酸氢钾、苯二甲酸钾、苯二甲酸二钠、苯二甲酸铵、苯二甲酸铜(II)等。这些试剂都有销售，容易获得。这些试剂可以单独或搭配起来用。其中作为本实施方式的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒中使用的苯二甲酸盐，从对水的溶解性高、且溶解时的水溶液的pH在4.0附近的观点出发，特别优选苯二甲酸氢钾。

而苯二甲酸存在着o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸(对苯二甲酸)异构体。在本实施方式中，可以使用o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸的混合物。单独使用对水溶解性高的o-苯二甲酸最好。而使用苯二甲酸盐情况也与苯二甲酸情况一样，可以使用o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸的盐的混合物。单独使用对水溶解性高的o-苯二甲酸的盐最好。

另外在本实施方式的免疫反应测定用试剂盒中，根据其用途等在获得上述效果的范围内可以添加该领域中众所周知的其他任意成分。例如在适用于散射测浊法、比浊法、玻片凝集法等均一体系的免疫反应测定法的场合，可以向本实施方式的免疫反应测定用试剂盒中添加聚乙二醇(PEG)。添加的量从非特异凝集少、测定灵敏度高的观点出发，在本实施方式中，上述的反应体系中聚乙二醇含量终浓度为2～6重量％浓度的量比较好，为4重量％浓度更好。

另外为了降低由于抗原或抗体自身凝集引起的非特异浑浊，可以向本实施方式的免疫反应测定用试剂盒中加入Tween 20、辛基糖苷、十二烷基硫酸钠(SDS)、蔗糖单月桂酸盐、CHAPS等表面活性剂。而在本实施方式的免疫反应测定用试剂盒中其含量从减少抗原抗体反应阻碍观点出发，在反应体系的0.3％(w/v)以下比较好，0.1％(w/v)以下更好。

适用于本实施方式的免疫反应测定测定用试剂盒的测定体系没有特别限定。特别是使用可以引起区带现象的散射测浊法、比浊法、玻片凝集法等均一体系的免疫测定方法，预料可以获得更好效果。另外适用于通过自动测定仪器进行测定已经普及的散射测浊法或比浊法的场合，由于可以削减或简化在区带现象的判定中需要的工序，所以特别理想。

本实施方式的免疫反应测定用试剂盒代表性制作方式如下。

象下面那样分别制备含有与被测定物质(这里指的是抗原)特异结合的特异结合物质(这里指的是抗体)的溶液以及含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的溶液。

含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的溶液使用缓冲剂制备，使反应体系的pH保持为低于7。将溶液的pH调整在4.5～5.5比较好，调整在4.5～5.3更好，而调整到4.5～5.0特别好。反应体系的pH调整到4.5最好。而为了使苯二甲酸或苯二甲酸盐的浓度在反应体系中的浓度在0.2M以下、0.1M以下比较好、最好大致在0.1M的浓度，调整苯二甲酸或苯二甲酸盐以及缓冲剂的量，通过将他们溶解于纯水中来制备含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的溶液。

只要满足上述必要条件，也可以将缓冲剂、苯二甲酸或苯二甲酸盐一个一个地分别溶解于溶液中来制备。另外只要是满足上述pH范围，即使不添加缓冲剂，苯二甲酸或苯二甲酸盐兼任缓冲剂的溶液也可以。

含有特异结合物质的溶液与上述含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的溶液混合时，只要是反应体系满足上述必要条件，可以是任意组成。

另外，也可以将特异结合物质与上述苯二甲酸或上述苯二甲酸盐预先混合。此时为了满足上述所示的必要条件，可以用制备的含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的溶液通过对含有特异结合物质的溶液进行透析或凝胶过滤，对低分子成分进行置换。

作为本实施方式的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒的被测定物质的抗原或抗体没有特别限定，一般来说只要是利用抗原抗体反应可以测定的物质无论什么样物质都可以。例如蛋白质、核酸、脂类、细菌、病毒以及半抗原等。其中由于蛋白质是利用抗原抗体反应进行临床检查中的主要测定对象，所以被测定物质是蛋白质时，本实施方式的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒非常适用。作为蛋白质例如可以是LH(促黄体素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人绒毛膜促性激素)等激素，以及各种免疫球蛋白类和亚类、补体成分、各种传染病的标志物、CRP、白蛋白、类风湿因子、血型抗原等。其中作为被测定物质要测定人白蛋白和人C反应性蛋白质(以下略称为人CRP)时，利用本实施方式的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒特别合适。

苯二甲酸或上述苯二甲酸盐具有螯合作用，具有有效争夺存在于反应体系中的Ca²⁺或Fe³⁺等二价和三价金属离子的性质。因此当抗原的内部含有保持金属离子的结构时，与抗原特异结合的抗体优选也能特异结合脱去金属离子状态下的抗原。这样一来，抗原即使由于金属离子脱离引起的分子结构发生变化的物质，也可以进行测定。

另外，当抗原的内部含有保持金属离子的结构，由于金属离子的脱离引起抗原的分子结构发生变化时，将与抗原保持的金属离子相同的金属离子添加到反应体系中，使得上述金属离子存在于反应体系中也可以。通过这样操作，反应体系内由于金属离子脱离引起的抗原的分子结构变化被抑制，抗体可与抗原结合，可以进行测定。

此时添加的金属离子的量可以根据使用的苯二甲酸或苯二甲酸盐的螯合能力、其浓度、抗原具有的金属离子的保持能力等进行设定。

作为具有可保持金属离子的分子结构的抗原如CRP。CRP不会由于有无Ca²⁺而发生结构变化。因此，例如在本实施方式的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒中使用的抗原是CRP，作为抗体使用含有与未带有Ca²⁺的人CRP不结合的抗体的山羊抗人CRP多克隆抗体，以及作为苯二甲酸或苯二甲酸盐使用苯二甲酸时，对于0.02M苯二甲酸，向反应体系中添加0.02M的Ca²⁺比较好。

另外当抗原是对至少一种抗体具有多个结合部位的物质时，抗体是与抗原多个结合部位结合的单克隆抗体比较好。单克隆抗体可以通过杂交瘤细胞株产生。杂交瘤细胞株是从通过对产生抗体的B细胞和骨髓瘤细胞(myeloma细胞)进行细胞融合得到的具有产生抗体能力和很强的增殖能力的融合细胞团中分离出的唯一的细胞，通过使其增殖确立的。因此产生的抗体的性状都相同。另外杂交瘤细胞株增殖能力强，由于可冷冻保存，只要进行适当管理，可以无限期地使用，将杂交瘤细胞株在培养液或腹腔中进行培养，通过纯化可以不断地得到性状永远相同的抗体。

另外，多克隆抗体是通过将抗原注入到动物体，使血液中大量出现与抗原结合的抗体，採集全部血液或一部分，通过纯化得到。因此其性质与动物的个体差异、生育环境、状态等有关。因此连续得到同一性状的抗体很困难。

就是说，通过使用单克隆抗体，经常使用性状相同的抗体成为可能，可以稳定供给作为试剂的抗体。其结果可以预料能够使利用本实施方式的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒进行的免疫反应测定结果稳定。

本实施方式的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒中使用的抗体没有特别限定，只要是与抗原特异结合的，可以是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中的任一类抗体。其中IgG抗体最好。这是由于IgG抗体具有难于产生非特异反应的性质，另外由于销售的产品比较多、容易买到的缘故。另外抗体来自动物的种类也没有特别限定，但由于来自兔、山羊、小鼠的抗体比较容易获得，使用的例子也比较多，所以比较好。

实施例

以下对本发明的实施例进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。

(实施例1)

以下给出了人白蛋白作为被测定物质时的免疫反应测定用试剂盒的构成方法。在本实施例中对由可在基于玻片凝集法、比浊法以及散射测浊法测定中使用的抗体溶液以及含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液构成的免疫反应测定用试剂盒的制作方法进行叙述。

在制备以下所示的缓冲液等时，使用了用Milli-Q SP TOC(Millipore制作)过滤的纯水。另外以下没有特别记载的盐、缓冲剂等试剂都是和光纯药工业制造的产品，使用的聚乙二醇6,000，trans-乌头酸是1级试剂，其他试剂都是特级试剂。

首先制备抗体溶液。兔抗人白蛋白(和光纯药工业制造)多克隆抗体从，是从免疫人白蛋白的兔採集的抗血清中使用蛋白A柱层析进行纯化。填充在柱中的蛋白A固定化凝胶使用Amersham Pharmacia生产的胶。纯化使用的平衡缓冲液的组成为1.5M甘氨酸、3.0M NaCl、pH8.9，洗脱缓冲液组成为0.1M柠檬酸、pH4.0。

向下述那样进行纯化。使容量为填充到柱子的凝胶容量的5倍的平衡缓冲液流过柱子，对柱子进行平衡后，用平衡缓冲液将柱子全结合容量的10～20％的含有抗体的抗血清稀释2倍后流过柱子，使血清中抗体结合到蛋白A上。然后使平衡缓冲液流过柱子使没有吸附在蛋白A的血清成分从柱子上洗出，直洗至没有这些成分。然后使洗脱缓冲液流过柱子，将结合于蛋白A上的抗体洗脱出来。将洗脱下来的抗体级分装入分级分子量1万的透析袋中，用组成为约100倍容量的0.05M 3-(吗啉代)丙磺酸(Dojin生产，以下略称为MOPS)、0.15M NaCl、0.04重量％NaN₃、pH7.4的缓冲液透析数次，置换缓冲液成分。然后通过测定280nm的吸光度推定抗体浓度，使用与透析用缓冲液相同的缓冲液将抗体浓度调到3.0mg/ml，将该溶液作为抗体溶液。而抗体浓度并没有特别限定。制作的抗体溶液可以保存在室温下，但要防止抗体变性，最好是保存在低温下，保存在4℃下更好。

含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液的制备方法如下。而作为苯二甲酸或苯二甲酸盐使用苯二甲酸以及苯二甲酸氢钾，各自构成由各个物质组成的缓冲液。

使用苯二甲酸氢钾的缓冲液的构成方法如下。按照最终浓度计量，苯二甲酸氢钾为0.05M、聚乙二醇6,000为4重量％，将他们溶解于约90％制备目的体积的纯水中。然后添加NaOH水溶液，将pH调整到4.5，用纯水将体积调整到制备目的体积。制备的缓冲液保存在室温下。

使用苯二甲酸的缓冲液的构成方法如下。按照最终浓度计量，苯二甲酸为0.03M、聚乙二醇6,000为4重量％，将他们溶解于约90％制备目的体积的纯水中。然后添加NaOH水溶液，将pH调整到4.5，用纯水将体积调整到制备目的体积。制备的缓冲液保存在室温下。

通过使至少有一种象上述那样构成的含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液与抗体溶液搭配，可以构成免疫测定用试剂盒。

(实施例2)

以下给出了以人CRP为被测定物质时的免疫测定用试剂盒的构成方法。由于CRP具有由具有同一结构的5个亚基构成的结构，所以是相对于一种抗体具有多个结合部位的物质。因此，即使使用一种抗CRP的单克隆抗体也可以制作均一系统的免疫反应测定中使用的免疫测定用试剂盒。单克隆抗体的种类在2种以上也可以。

因此在本实施例中，制作由各自使用多克隆抗体溶液和单克隆抗体溶液的2种抗体溶液和含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液构成的免疫反应测定用试剂盒。

首先给出多克隆抗体溶液的制备方法。

使用蛋白G柱层析从免疫过人CRP的山羊採集的抗血清中纯化山羊抗人CRP多克隆抗体。填充在柱中的蛋白G固定化凝胶使用AmershamPharmacia生产的凝胶。纯化使用的平衡缓冲液的组成为0.02MNa₂HPO₄-NaH₂PO₄、pH7.0，洗脱缓冲液组成为0.1M甘氨酸、pH2.7。有关利用柱层析的纯化方法、通过透析置换缓冲液的方法与实施例1使用的方法一样。然后通过测定280nm的吸光度推定抗体浓度，使用与透析用缓冲液相同的缓冲液将抗体浓度调到1.0mg/ml，将该溶液作为多克隆抗体溶液。

人CRP由于是否带有Ca²⁺会发生结构变化。因此构成免疫反应测定用试剂盒的抗体溶液中含有对未带有Ca²⁺的人CRP不结合的抗体时，由于苯二甲酸或苯二甲酸盐的螯合作用，未带有Ca²⁺的人CRP增加，出现抗原抗体反应的反应率低下的可能性是存在的。最近，对多克隆抗体溶液进行了制备，但在多克隆抗体溶液中含有对未带有Ca²⁺的人CRP不结合的抗体。所以在以下所示的含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液的制备中为了保持人CRP的结构，在缓冲液中添加了Ca²⁺。

具体来说，含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液的制备如下。而作为苯二甲酸或苯二甲酸盐在本实施例中使用苯二甲酸。

按照最终浓度计量，苯二甲酸为0.02M、CaCl₂为0.02M、聚乙二醇6,000为4重量％，将他们溶解于约90％制备目的体积的纯水中。然后添加NaOH水溶液，将pH调整到4.5，用纯水将体积调整到制备目的体积。将得到的缓冲液保存在室温下。

以下给出单克隆抗体溶液的制备方法。

作为单克隆抗体使用即使通过向反应体系添加螯合剂(例如0.02M的苯二甲酸或乙二胺四乙酸等)也没有丧失对人CRP的结合能力、即与没带有Ca²⁺的人CRP也能特异结合的抗体。具体来说，可以象如下所述那样制备单克隆抗体溶液。

本实施例中使用的小鼠抗人CRP单克隆抗体按照下述操作可以得到。首先将产生小鼠抗人CRP单克隆抗体的杂交瘤细胞(工业技术院生命工学工业技术研究所受托编号FERM BP-6620号)注入小鼠腹腔内，通过使其增殖得到腹水。通过使用与实施例1同样的柱层析法从得到的腹水中进行纯化，得到小鼠抗人CRP单克隆抗体样品。

具体来说，腹水可以象下述那样得到。为了产生腹水，使用进行了retire的雌性BALB/c小鼠。向小鼠腹腔内注入0.5～1ml的降植烷，约7天后注入下述细胞悬浮液0.5～1ml后，依次从有腹水产生的小鼠採集腹水。这里向腹腔内注入的杂交瘤细胞悬浮液是通过使用RPMI1640培养基(SIGMA生产)中混合了5～15体积％的胎牛血清的培养基的培养使杂交瘤细胞增殖，增殖的细胞用RPMI1640培养基经离心清洗，再悬浮于RPMI1640培养基(使其浓度为1×10⁶～10⁷cells/ml)得到的。

接下来将利用柱层析完成纯化的小鼠抗人CRP单克隆抗体样品装入分级分子量1万的透析袋中用约100倍容量的含有0.04重量％NaN₃的PBS缓冲液(8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.15g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g/L KH₂PO₄、pH7.4)透析数次，置换缓冲液成分。然后通过测定280nm的吸光度推定抗体浓度，使用与透析用缓冲液相同的缓冲液将抗体浓度调到1.0mg/ml，将该溶液作为单克隆抗体溶液。

含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液的制备如下。在苯二甲酸或苯二甲酸盐中使用苯二甲酸氢钾构成缓冲液。而在本实施例的单克隆抗体溶液因为不受由于人CRP中有无Ca²⁺引起的结构变化的影响，所以缓冲液中没有添加Ca²⁺。

含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液的构成方法如下。按照最终浓度计量，苯二甲酸氢钾为0.05M、聚乙二醇6,000为4重量％，将他们溶解于约90％制备目的体积的纯水中。然后向得到的溶液中添加NaOH水溶液，将pH调整到4.5，用纯水将体积调整到制备目的体积。将得到的缓冲液保存在室温下。

上述那样制备的各个抗体溶液的浓度并没有限定于这些浓度。制作的抗体溶液可以保存在室温下，但要防止抗体变性，最好是保存在低温下，保存在4℃下更好。

通过将上述那样构成的含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液与抗体溶液组合可以构成免疫测定用试剂盒。

在实施例1和2构成的试剂的使用方法，为构建反应体系可以将含有抗原的样品(检材)、抗体溶液、含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液混合之后使用。混合方法可以使用任意方法。混合的比率可以根据需要的抗原浓度的测定范围决定。在通过混合构建的反应体系中会发生抗原抗体反应，生成凝集复合物。通过测定散射光强度的变化量可以估计由于凝集复合物引起的浑浊程度，根据该结果可以知道检测样品中的抗原浓度。

由于混合，缓冲剂、苯二甲酸或苯二甲酸盐、聚乙二醇6,000等添加剂的浓度与初期浓度相比变稀了，但稀释后的浓度与初期浓度的差在大致10％左右，所以得到的结果与由初期浓度预料的测定结果没有太大差别，没有受到多大的影响。而为了避免由于稀释引起的浓度变化，混合时试剂中的各个物质的浓度都按照目的浓度添加就可以制备抗体溶液和含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液。

另外虽然在实施例1和2中没有给出，但可以将抗体固定于胶乳、金胶体、磁微粒子等微粒子载体上，还可以对抗体进行酶、色素、荧光物质、发光物质等标记。

抗体溶液制备中使用的缓冲剂以及抗体溶液的pH并不限定于上述组成和pH。例如，在构成一液系的试剂时，可以使抗体溶液含有苯二甲酸或苯二甲酸盐。因此为了将反应体系的pH维持在低于7，可以用含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的酸性缓冲液进行透析。

在实施例1和2中pH调节使用了NaOH，也可以使KOH、LiOH、NH₄OH、Ca(OH)₂、Mg(OH)₂等氢氧化物。

实施例1和2在制备含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液时使用了苯二甲酸氢钾和苯二甲酸，也可以使用其他苯二甲酸或苯二甲酸盐，例如苯二甲酸酐、或苯二甲酸钾、苯二甲酸钠、苯二甲酸铵、苯二甲酸铜(II)等中的任一种。也可以将他们搭配起来用，此时pH的调节，如果溶解于纯水时的pH处于比调节目的pH高的碱性区时，使用HCl等，如果处于比调整目的pH低的酸性区时，使用上述的氢氧化物等。另外也可以对上述列举的苯二甲酸或苯二甲酸盐的混合比进行调整。

另外，在实施例1和2中给出了含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液的主要缓冲能力是由苯二甲酸或苯二甲酸盐赋予时的制备方法。然而，添加到缓冲液中的苯二甲酸或苯二甲酸盐的浓度并没有特别限定。另外含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液的主要缓冲能力也可以由其他缓冲剂赋予，也可以使苯二甲酸或苯二甲酸盐与其他的缓冲剂协调赋予缓冲能力。

(实施例3)

在本实施例中对在基于本发明的含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的酸性反应体系中的抗原测定的效果与在免疫反应测定方法中一般使用的中性反应体系的抗原测定进行了对比。对比是通过散射测浊法测定人白蛋白进行的。用于构成含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的酸性反应体系的试剂使用实施例1中构成的试剂。

以下将实施例1中制作的使用苯二甲酸氢钾的缓冲液称之为苯二甲酸氢钾缓冲液，而使用苯二甲酸的缓冲液称之为苯二甲酸缓冲液。

而作为比较例在用于构成中性反应体系的缓冲液的构成中使用MOPS，准备0.05M MOPS、4重量％聚乙二醇6,000、pH7.4组成的缓冲液和0.03M MOPS、4重量％聚乙二醇6,000、pH7.4组成的缓冲液。以下，分别称之为0.05M MOPS缓冲液和0.03M MOPS缓冲液。各个缓冲液都保存在室温下。

使用用作抗原的人白蛋白(和光纯药工业制造)和0.05M MOPS、0.04重量％NaN₃、pH7.4组成的缓冲液，制作人白蛋白浓度分别为0、5、10、20、30、50、70、100、200、300、500mg/dl的白蛋白溶液。人白蛋白溶液在使用之前保存在4℃下。

测定时使用分光荧光光度计(岛津制作所制造，型号RF-5300PC)。分光荧光光度计的样品室中配置与恒温水槽(TAITEC制作，商品名COOLNIT BATH EL-15)连接的恒温池架(岛津制作所制作，型号206-15440)，使温度保持在25℃的水在恒温水槽内循环，测定时要将石英杯内的温度保持一定。分光荧光光度计的测定条件设定为激发、荧光波长都是670nm，荧光、激发两者带幅都为3nm，灵敏度设定在高灵敏度。

测定如下。向2.87ml的各个缓冲液中添加0.1ml的实施例1制备的抗体溶液后，搅拌混合，然后再向各个混合液中分别加入各个浓度的人白蛋白溶液0.03ml，搅拌混合。反应体系中的兔抗人白蛋白多克隆抗体约为0.10mg/ml、人白蛋白浓度为测定时使用的人白蛋白溶液浓度乘以0.01后的浓度。将他们移到荧光分析用的石英杯中，设置在分光荧光光度计上，将T型热电偶(从RSコンポ-ネンツ获得，型号219-4696)浸渍到石英杯内，在混合白蛋白后2分钟开始的时间过程测定中，每隔0.04秒测定一次，测定300秒。测定中的石英杯内的温度通过将T型热电偶与数字多级监测器(ァドバンテスト制造，型号TR2114)连接进行监测。为了排除石英杯的污染对测定的影响，在各反应的测定前将纯水加入杯内，用测定的值进行修正。求出通过测定得到的200～300秒之间的各个测定值的平均值，把这些值作为对应于各个浓度的人白蛋白溶液的测定值。为了了解各个缓冲液、抗体溶液、各个浓度的人白蛋白溶液由于混合对反应体系的pH的影响，测定结束后用pH计对反应体系的混合液的pH进行测定。

以下叙述测定结果。由各个测定中使用的各个缓冲液、抗体溶液、各浓度的人白蛋白溶液构成的反应体系的混合液的pH大致与缓冲液的pH相同。而通过热电偶测定得到的各个测定中的杯内温度保持在25.5±1℃。

图4中的曲线表示对于由0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液构成的反应体系和由0.05MMOPS缓冲液构成的反应体系分别加入直至500mg/dl的各个人白蛋白溶液之后进行测定的结果。纵轴表示散射光强度，横轴表示测定中使用的人白蛋白溶液的浓度。散射光强度越大，反应体系的浑浊程度(浊度)越高，表明由于抗原抗体反应形成很多凝集复合物。而曲线中的各个值是由就各个缓冲液得到的各个浓度的人白蛋白溶液的测定值减去人白蛋白浓度为0mg/dl时的测定值得到的结果。

就象图4所示那样，与使用0.05MMOPS缓冲液进行测定时相比，很显然使用0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液测定时给出了高的测定值。而使用0.05MMOPS缓冲液时，在50mg/dl附近出现测定值峰值，随着人白蛋白浓度变高由于区带现象使测定值大大减少。然而，使用0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液时，在70～100mg/dl附近具有测定值的峰，即使人白蛋白浓度增高，由于区带现象引起的测定值的减少也被抑制了。

图5中的曲线表示对于使用0.03M苯二甲酸缓冲液的反应体系和使用0.03MMOPS缓冲液的反应体系分别加入直至500mg/dl的各个人白蛋白溶液之后进行测定的结果。纵轴表示散射光强度，横轴表示测定中使用的人白蛋白溶液的浓度。曲线中的各个值是由就各个缓冲液得到的各个浓度的人白蛋白溶液的测定值减去人白蛋白浓度为0mg/dl时的测定值得到的结果。

就象图5所示那样，与使用0.03MMOPS缓冲液进行测定时相比，很显然使用0.03M苯二甲酸缓冲液测定时给出了高的测定值。而使用0.03MMOPS缓冲液时，在50mg/dl附近出现测定值峰值，随着人白蛋白浓度变高由于区带现象使测定值大大减少。而使用0.03M苯二甲酸缓冲液时，在70～100mg/dl附近具有测定值的峰，即使人白蛋白浓度增高，由于区带现象引起的测定值的减少也被抑制了。

就象以上结果表明的那样，能够确认利用本发明的免疫反应测定方法和免疫反应测定用试剂盒比使用以往的免疫反应测定方法和免疫反应测定用试剂盒可以得到高的测定值。另外也可以确认与使用以往的免疫反应测定方法和免疫反应测定用试剂盒相比可以使区带现象缓和。

在临床检查中，作为糖尿病性肾病的早期诊断标志，排泄到尿中的微量的人白蛋白成为测定对象，将0.1～20mg/dl范围作为定量范围的免疫反应测定方法和免疫反应测定用试剂盒很多(参照新·糖尿病性肾病预防发病和防止发展繁田幸雄、海津嘉藏编辑，第131页(1992))。若通过源于散射测浊法的以往的测定方法和该方法中使用的试剂盒，为了缓和区带现象，需要利用均一体系的免疫反应是平衡反应，通过增加作为反应体系被构建的中性缓冲液中的抗体浓度，或者通过中性缓冲液的稀释等使抗原浓度降低来解决。

而如果使用本发明的免疫反应测定方法和免疫反应测定用试剂盒，抗体浓度低，而且在抗原浓度高时区带现象也可以缓和。为此，例如将本实施例的测定结果作为基础，通过设计将20mg/dl以上的测定值作为阳性值的判定区，在由0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液或0.03M苯二甲酸缓冲液构成的反应体系中将直至500mg/dl的很宽的范围作为测定范围是有可能的。然而，在比较例的中性缓冲液体系中其测定界限在120～130mg/dl左右。

就象以上所示那样，利用本发明的免疫反应测定方法和免疫反应测定用试剂盒与以往的中性缓冲液体系中的测定相比，可以不考虑区带现象的影响而测定更宽浓度范围的人白蛋白。

(实施例4)

以下给出了通过散射测浊法对使用苯二甲酸氢钾作为苯二甲酸或苯二甲酸盐的本发明的免疫反应测定方法和免疫反应测定用试剂盒测得的测定值对pH的依赖关系进行研究的内容。作为被测定物质使用人白蛋白。人白蛋白溶液的制备用与实施例3同样的方法进行，准备浓度分别为0、5、10、20、30、50、70、100、200、300、500mg/dl的白蛋白溶液。使用的抗体溶液与实施例1相同。

作为构建用于研究测定值对pH依赖性的反应体系的缓冲液，制备将含有0.05M苯二甲酸氢钾以及4重量％聚乙二醇6,000的溶液的pH分别调整到4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液。

作为比较例，使用含有0.05M MOPS、4重量％聚乙二醇6,000的溶液的pH调整到7.4的0.05M MOPS缓冲液。仪器和测定法与实施例3相同。

就结果进行叙述。由各个测定中使用的各个缓冲液、抗体溶液、各浓度的人白蛋白溶液构成的反应体系的混合液的pH与缓冲液的pH相同。另外测定中石英杯内的温度保持在25.5±1℃。

得到的结果如图6所示。图6中的曲线表示对于使用由各pH的0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液构成的反应体系分别加入直至500mg/dl的各个人白蛋白溶液之后进行测定的结果。纵轴表示散射光强度，横轴表示测定中使用的人白蛋白溶液的浓度。曲线中的各个值是由就各个缓冲液得到的各个浓度的人白蛋白溶液的测定值减去人白蛋白浓度为0mg/dl时的测定值得到的结果。曲线的评估与图4一样。

用pH4.5～5.5的0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液构成反应体系并进行测定时，与作为比较例的用0.05M MOPS缓冲液构成的反应体系并测定的结果相比，测定值提高，另外可以看到随着抗原浓度增高产生的区带现象被缓和的效果。该效果在用pH4.5的0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液构成反应体系时最大。另外从图6的结果可以认为，若由pH4.5～5.3、优选pH4.5～5.0的0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液构成反应体系时，测定值的提高和区带现象的缓和效果是非常稳定的。

在用pH为6.0的0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液构成的反应体系时，测定值低于用0.05M MOPS缓冲液构成的反应体系测定的值。而测定值曲线表现出与用0.05M MOPS缓冲液构成的反应体系同样的形状，看不到对随着抗原浓度变成高浓度而出现的区带现象有缓和的效果。

在用pH为4.0的0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液构成的反应体系中，将直至100mg/dl的人白蛋白加入反应体系后测定的值低于用0.05M MOPS缓冲液构成的反应体系测定的值。然而将200mg/dl以上的人白蛋白加入反应体系后测定的值高于用0.05M MOPS缓冲液构成的反应体系测定的值。看到对随着抗原浓度变成高浓度而出现的区带现象有缓和的效果。

以上结果表明，在使用苯二甲酸或苯二甲酸盐的免疫反应测定法中反应体系的pH一般设定在pH4.5～5.5范围、设定在pH4.5～5.3范围更好，最好是设定在pH4.5～5.0范围。另外知道将反应体系的pH设定在4.5可以得到最大的效果。

同样，在使用苯二甲酸或苯二甲酸盐的免疫反应测定用试剂盒中，反应体系的pH象设定的那样调整在pH4.5～5.5范围、调整在pH4.5～5.3范围更好，最好是调整在pH4.5～5.0范围。另外可知将反应体系的pH象设定的那样调整在4.5可以得到最大的效果。

(实施例5)

以下给出了通过散射测浊法对使用苯二甲酸氢钾作为苯二甲酸或苯二甲酸盐的本发明的免疫反应测定方法和免疫反应测定用试剂盒测得的测定值对苯二甲酸或苯二甲酸盐依赖性进行研究的内容。作为被测定物质使用人白蛋白。人白蛋白溶液的制备用与实施例3同样的方法进行，准备浓度分别为0、5、10、20、30、50、70、100、200、300、500mg/dl的白蛋白溶液。使用的抗体溶液与实施例1相同。

作为构建用于研究测定值对苯二甲酸或苯二甲酸盐依赖性的反应体系的缓冲液，准备分别含有苯二甲酸氢钾浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3M以及4重量％聚乙二醇6,000的pH为4.5的各个苯二甲酸氢钾缓冲液。

作为比较例，使用含有0.05M MOPS、4重量％聚乙二醇6,000以及pH调整到7.4的0.05M MOPS缓冲液。仪器和测定法与实施例3相同。

以下叙述测定的结果。由各个测定中使用的各个缓冲液、抗体溶液、各浓度的人白蛋白溶液构成的反应体系的混合液的pH在使用0.01M苯二甲酸氢钾缓冲液时为4.7，在使用0.025M苯二甲酸氢钾缓冲液时为4.6，在使用其他浓度的苯二甲酸氢钾缓冲液时为4.5。另外测定中石英杯内的温度保存在25.5±1℃。

得到的结果如图7所示。图7中的曲线表示对于使用由pH大致为4.5的各个浓度的苯二甲酸氢钾缓冲液构成的反应体系分别加入直至500mg/dl的各个人白蛋白溶液之后进行测定的结果。纵轴表示散射光强度，横轴表示测定中使用的人白蛋白溶液的浓度。曲线中的各个值是由就各个缓冲液得到的各个浓度人白蛋白溶液的测定值减去人白蛋白浓度为0mg/dl时的测定值得到的结果。曲线的评估与图4一样。

用苯二甲酸氢钾的浓度在0.2M以下的苯二甲酸氢钾缓冲液构成反应体系进行测定时，与作为比较例的0.05M MOPS缓冲液构成的反应体系测定的结果相比测定值提高了，能够确认测定值提高的效果。另外也可以看到随着抗原浓度增高产生的区带现象被缓和的效果。缓和区带现象的效果在用0.1M以下浓度的苯二甲酸氢钾缓冲液构成反应体系时特别高。用0.1M以下浓度的苯二甲酸氢钾缓冲液构成反应体系测定值提高效果没有太大差别，但缓和区带现象的效果在用0.1M浓度的苯二甲酸氢钾缓冲液构成反应体系中最大。

在用0.3M苯二甲酸氢钾缓冲液构成的反应体系时，人白蛋白浓度直至100mg/dl的测定值都低于用0.05M MOPS缓冲液构成的反应体系测定的值。而人白蛋白浓度为200mg/dl以上的测定值高于比较例，可以看到对随着人白蛋白浓度变成高浓度而出现的区带现象有缓和的效果。

由以上结果可知，在使用苯二甲酸或苯二甲酸盐的免疫反应测定法中，为了获得比一般中性缓冲液高的效果，反应体系的苯二甲酸氢钾浓度调整在0.2M以下合适。特别是苯二甲酸氢钾浓度调整在0.1M以下更好，苯二甲酸氢钾浓度调整在0.1M最好。

同样，如果使用用苯二甲酸或苯二甲酸盐构成的免疫反应测定用试剂盒，可知反应体系的苯二甲酸氢钾浓度调整在0.2M以下比较好。特别是苯二甲酸氢钾浓度调整在0.1M以下更好，苯二甲酸氢钾浓度调整为0.1M最好。

(实施例6)

以下给出了通过散射测浊法对将苯二甲酸或苯二甲酸盐与其他缓冲剂混合之后使用时利用本发明的免疫反应测定方法和免疫反应测定用试剂盒测得的测定值进行研究的内容。

作为被测定物质使用人白蛋白。人白蛋白溶液的制备用与实施例3同样的方法进行，准备浓度分别为0、5、10、20、30、50、70、100、200、300、500mg/dl的白蛋白溶液。使用的抗体溶液与实施例1相同。

作为苯二甲酸或苯二甲酸盐使用苯二甲酸。与苯二甲酸共存的缓冲剂中使用琥珀酸，制备由0.1M琥珀酸、0.02M苯二甲酸、4重量％聚乙二醇6,000组成的pH为4.5琥珀酸苯二甲酸混合缓冲液。另外作为没有苯二甲酸或苯二甲酸盐时的比较例，使用配制的0.12M琥珀酸、4重量％聚乙二醇6,000组成的pH为4.5琥珀酸缓冲液。

以下叙述测定的结果。由各个测定中使用的各个缓冲液、抗体溶液、各浓度的人白蛋白溶液构成的反应体系的混合液的pH与缓冲液的pH大致相同。另外测定中石英杯内的温度保持在25.5±1℃。

得到的结果如图8所示。图8中的曲线表示对于使用上述由琥珀酸苯二甲酸混合缓冲液以及琥珀酸缓冲液分别构成的反应体系分别加入直至500mg/dl的各个人白蛋白溶液之后进行测定的结果。纵轴表示散射光强度，横轴表示测定中使用的人白蛋白溶液的浓度。曲线中的各个值是由就各个缓冲液得到的各个浓度人白蛋白溶液的测定值减去人白蛋白浓度为0mg/dl时的测定值得到的结果。曲线的评估与图4一样。

结果表明，使用琥珀酸苯二甲酸混合缓冲液时，与作为比较例使用的琥珀酸缓冲液相比，测定值提高了，可以确认有效果。另外也可以看到随着抗原浓度增高产生的区带现象被缓和的效果。

由以上结果可知，在本发明的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒中，即使将苯二甲酸或苯二甲酸盐与其他缓冲剂一起使用，也可以确认起到了测定值提高效果以及缓和区带现象的效果。

(实施例7)

以下给出了使用实施例2制作的山羊抗人CRP多克隆抗体溶液对本发明的人CRP测定的效果与在以往免疫反应测定方法中一般使用的中性反应体系中的人CRP测定进行对比的结果。

测定中使用的各浓度的人CRP溶液的配制如下：将纯化的人CRP(Chemicon International生产，Lot No.21042246)用组成为0.05M MOPS、0.04重量％NaN₃的pH为7.4缓冲液稀释后配制。制备人CRP溶液的浓度分别为0、10、20、30、50、70、100、200mg/dl的溶液。

作为抗体溶液使用实施例2制作的山羊抗人CRP多克隆抗体溶液。

作为含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液使用实施例2制作的苯二甲酸缓冲液(0.02M苯二甲酸、0.02McaCl₂、4重量％聚乙二醇6,000，pH4.5)。

另外作为不含苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液的比较例使用含有0.05M MOPS以及4重量％聚乙二醇6,000的溶液并且将pH调整到7.4的0.05M MOPS缓冲液。

测定装置使用自己制作的装置，其构成如下。光源做成270Hz调制的波长680nm的输出功率15mW半导体激光头(キコ-技研制，型号MLXS-D-12-680-35)，检测器做成可见红外精密测光用硅光电二极管(滨松フオトニクス制造，型号S2387-66R)。杯子是将厚0.1cm的光学玻璃板粘接，做成容量约200μl的正四角柱形。各配置位于离开光源0.5cm的地方，使其一面与光源成垂直地配置杯子，检测器在与光源成90°角度方向，离开杯子5.5cm的地方配置，为了使杂散光不入射到检测器，在检测器和杯子之间设置遮光筒。依赖于检测器检测的光量的电流信号经过电流电压变换电路(106V/A)和运算放大器构成的发大电路放大100倍的电压信号后，通过同步放大器(ェヌェフ回路设计ブロツク制造，型号5610B)进行位相敏感检波，输入到GPIB控制的计算机中。

就各个缓冲液，对各浓度人CRP的测定如下。反应体系的混合比为缓冲液178μl、人CRP溶液9μl、抗体溶液7μl。反应体系中的山羊抗人CRP多克隆抗体的最终浓度约为0.036mg/ml、人CRP的最终浓度为测定中使用的人CRP溶液的浓度乘以0.046得到的浓度。

首先向杯内按照上述容量加入缓冲液和人CRP溶液，搅拌混合。然后按照上述容量加入抗体溶液，进行搅拌混合，使抗原抗体反应发生。散射光的测定从加入抗体溶液前10秒开始，每0.5秒测定一次，连续测定300秒。测定值是作为电压值得到的。杯子的污染对测定的影响可以用通过在各反应前向杯内加入纯水测定的值进行修正除去。求得到的于200～300秒之间的平均值，该值作为于各浓度人CRP溶液的测定值。另外在可以由加入抗体溶液之前10秒的测定值判断出由于抗原产生自身凝集的情况，从上述求出的各浓度的人CRP溶液的测定值中减去这些平均值。测定在室温(约20℃)下进行。

以下给出了测定结果。图9中的曲线表示就各个缓冲液加入直至100mg/dl的各人CRP溶液后测定的结果。纵轴表示测定的电压值，横轴表示测定中使用的人CRP溶液的浓度。测定电压值越高，入射到检测器的散射光越多，反应体系的浊度高，即表明由于抗原抗体反应形成许多凝集复合物。另外曲线中的各个值是从得到的各浓度的人CRP溶液的测定值减去人CRP浓度为0mg/dl的测定值得到的结果。

就象图9所示那样，与作为比较例使用MOPS缓冲液进行测定时相比，可以确认使用实施例2制作的由山羊抗人CRP多克隆抗体溶液以及含有0.02M CaCl₂和苯二甲酸的缓冲液构成的试剂进行测定时得到的值，在各浓度的人CRP溶液的测定中都表现出高的测定值。

(实施例8)

以下给出了使用实施例2制作的小鼠抗人CRP单克隆抗体溶液对本发明的人CRP测定的效果与在以往免疫反应测定方法中一般使用的中性反应体系中的人CRP测定进行对比的结果。

测定中使用的各浓度人CRP溶液的制备使用与实施例7同样的方法。制备人CRP溶液的浓度分别为0、10、20、30、50、70、100mg/dl的溶液。

作为抗体溶液使用实施例2制作的小鼠抗人CRP单克隆抗体溶液。

作为含有苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液使用实施例2制作的苯二甲酸氢钾缓冲液(0.05M苯二甲酸氢钾、4重量％聚乙二醇6,000，pH4.5)。

另外作为不含苯二甲酸或苯二甲酸盐的缓冲液的比较例使用含有0.05M MOPS以及4重量％聚乙二醇6,000的并且将pH调整到7.4的0.05MMOPS缓冲液。

测定中使用与实施例7所述同样构成的装置和测定条件。另外有关测定方法以及测定数据的处理方法等也都与实施例7所述的方法同样。因此反应体系中的小鼠抗人CRP单克隆抗体的最终浓度约为0.036mg/ml，人CRP的最终浓度为测定中使用的人CRP溶液的浓度乘以0.046得到的浓度。

以下给出了测定结果。图10中的曲线表示就在苯二甲酸或苯二甲酸盐中使用苯二甲酸氢钾的以实施例2构成的0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液和作为比较例的0.05M MOPS缓冲液，加入直至100mg/dl的各个人CRP溶液后测定的结果。纵轴表示测定的电压值，横轴表示测定中使用的人CRP溶液的浓度。另外曲线中的各个值是从得到的各浓度的人CRP溶液的测定值减去人CRP浓度为0mg/dl的测定值得到的结果。曲线的评估与图9一样。

就象图10所示那样，在对比较例使用的0.05MOPS缓冲液进行人CRP测定时，就10mg/dl的人CRP溶液的测定来说，在与0mg/dl的人CRP溶液的测定值之间没有得到充分的测定值差，实质上不能测定人CRP的浓度差。另一方面，用0.05M苯二甲酸氢钾缓冲液进行测定时，在各个浓度的人CRP溶液测定中都明显表现出很高的测定值，即使在10mg/dl的人CRP溶液的测定中，在与0mg/dl的人CRP溶液的测定值之间也可以得到充分的测定值差。就是说，对人CRP的浓度差进行测定成为可能。

就象以上实施例7和8所示那样，可以确认本发明的免疫反应测定方法以及方法中使用的免疫反应测定用试剂盒，即使对人CRP测定也具有测定值提高的效果。

就象以上说明的那样，利用本发明的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒，通过使免疫反应的反应体系中存在苯二甲酸或苯二甲酸盐，将反应体系的pH设定酸性，可以提高通过抗原抗体结合引起的免疫反应的测定值，而且通过上述操作可以缓和在抗原过剩范围中产生的区带现象。

在以往的添加水溶性高分子的方法中，为了使测定值提高，维持良好的S/N比，进行稳定的测定，需要添加更高浓度水溶性高分子或高分子量的水溶性高分子。因此，使溶液的粘性增大，存在着其分析操作上的处理变得困难的不好状况。然而在本发明中由于使用的苯二甲酸或苯二甲酸盐是低分子物质，不会使溶液的粘性增大，其分析操作的处理也变得容易。

另外，利用本发明的免疫反应测定方法以及免疫反应测定用试剂盒，由于区带现象被缓和，在被测定物质的高浓度下的测定值的急剧下降被减轻。因此可以使能够正确测定被测定物质的含量的测定浓度范围扩展。

就象以上说明的那样，通过本发明可以提供很容易使测定值提高的免疫反应测定方法以及方法中使用的免疫反应测定用试剂盒。还可以提供使在抗原过剩范围内产生的区带现象缓和的免疫反应测定方法以及方法中使用的免疫反应测定用试剂盒。